Name: 一過性受容体電位バニロイド型 1 Ultrapotent アゴニストと純粋な小さな繊維の神経疾患のマウスモデルを確立します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶRTXを用いたマウス小繊維神経障害モデルの確立法。腹腔内投与により熱感覚過敏と機械的異常性疼痛を誘導し、IENF変性とATF-3発現を確認。神経性疼痛の病態生理解明と治療標的探索に有用な実験系を提供します。

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この作品は、省の科学と技術 (106-2320-B-037-024)、高雄医科大学 (KMU M106028、KMU S105034) トップ大学助成金 (TP105PR15)、台湾、高雄医学大学の目的からの補助金によって支えられました。

記載されているすべての手順研究所動物30に関する倫理指針に基づき、プロトコルは、動物委員会の高雄医学大学、高雄、台湾によって承認されています。
1. RTX 神経障害の確立
注意:RTX は神経毒性と有害です。接触、目、粘膜、上気道刺激として機能します。吸入を避ける、RTX の準備中にラボ メガネとコートを着用します。多量の皮膚への接触や処理後の水で洗い流してください。
<ol><li>Tween 80、エタノール (各溶剤 100 μ L) の等量の混合物を 200 μ l 添加に RTX 粉末の 1 mg を追加します。</li>
	<li>因数 RTX ソリューション (12 μ L/バイアル) し、3 ヵ月の-20 ° C で保存します。この下に RTX 株式;有効期限の残りの RTX ソリューションを破棄します。</li>
	<li>600 μ L の最終巻に生理食塩水入りの RTX 株式を希釈します。RTX 溶液の最終濃度は 0.01% を 10 μ L 車両ソリューションで 1 μ g RTX に匹敵するをする必要があります。</li>
	<li>実験動物として 8 週齢アダルト雄 ICR マウス (35-40 g) を使用し、RTX ソリューションの単一の線量の管理 (投与量: 200、50、および 10 μ g/kg、それぞれ) 腹腔内 (i. p.) マウスにマイクロインジェクション注射器で。マウスは、深い麻酔と 5% イソフルレン吸入による麻酔されました。マウスは、RTX 注入中に四肢の撤退行動を示したマウスは長い吸入麻酔を取る必要があります。 例: マウスの重さ 40 g を受け取ります RTX ソリューションでは、50 μ g/kg の投与量を表すの 20 μ L。</li>
	<li>コントロールとしてマウスの 1 つのグループの車両 (10% Tween 80 と 10% エタノール食塩) の等量を与えます。</li>
	<li>RTX 注射後、12-光/12 h 暗い上のプラスチックケージにマウス サイクルし食品を提供し、自由水を返します。</li>
</ol>2. 神経因性挙動の評価
注: は、注射後リカバリするように快適な環境 (ステップ 1.6) で動物を保持します。7 日目の RTX のポスト噴射 (D7) にそれぞれの動物は時差を減らすし、行動テストの効率を促進するために同じ日にホット プレート、von Frey 髪フィラメントのテストを実行します。動物の馴化を最適化し、動作テスト中に環境影響の低減のため安定した湿度 (40%) と (27 ° C) の温度で維持される静かな部屋に動物をもたらします。テスト期間中に動物を邪魔しないで行動テストは毎週予定しています。
<ol><li>ホット プレート テストで熱遅延の測定<ol>
<li>透明なプレキシ グラス ケージの金属ホット プレート (27 cm × 29 cm) の上に優しく動物を配置 (長さ × 幅 × 高さ: 22 cm × 22 cm × 25 cm である;図 1 a)。52 ° c. に金属製のホット プレートの温度を設定します。</li>
		<li>動物のグルタミ ホット プレートに触れるし、動物のグルタミ ン応答を観察したら、ホット プレートの手順で、内蔵タイマーでのホット プレート上の動物の熱遅延の期間を測定を開始します。動物は、揺れを示している場合、グルタミ ン舐めるまたはホット プレート上中ジャンプ削除し、ホット プレート上に動物が残された時間を記録します。この時間は、個々 の動物の熱遅延を定義します。最も近い 0.1 熱遅延時間を記録 s。</li>
		<li>各テスト セッションの最後のホット プレート テスト後応答正規化の 30 分間隔で 3 つのトライアルを実行します。動物は、ホット プレートには応答を示さない場合 25 後セッションを停止 s 潜在的な組織の損傷を避けるために。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Von Frey 毛フィラメントと力学的閾値の測定テストします。<ol>
<li>カスタマイズされた金属製のメッシュの動物を置く (メッシュ サイズ: 5 × 5 mm) 半透明シリンダー プレキシ ガラスのケージ (直径: 13 cm; 高さ: 12 cm) (図 1 b) 少なくとも 2 h の順応に。</li>
		<li>上下法31と後足部の足底に von Frey 毛繊維の別の calibers を適用されます。5-8 s のフィラメント アプリケーションの持続期間のため von Frey 毛フィラメントのセットの中間力から最初のアプリケーションを起動します。</li>
		<li>動物の正規化を最適化するフィラメント アプリケーション間 2 分間隔を使用します。動物の最後の応答に基づく応用フィラメント力を変更します。 Von Frey 毛フィラメントのセットは 0.064、0.085、0.145、0.32、0.39、1.1、および 1.7 g 力のアプリケーションで構成されています。たとえば、0.32 g の初期力と後足の撤退が発生した場合は 0.145 g を適用します。足撤退の不在、0.39 g フォースが適用されます。さまざまな力の 4 つの追加のフィラメントは、前の応答に基づいて適用されますが、公開された数式31によると機械のしきい値を計算します。</li>
		<li>各テスト セッションのため二国間グルタミが含まれます。各後足の 3 つの試験を実行します。それぞれの動物の平均機械しきい値 (mg)、これらの六つの機械しきい値のなかを表現します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56651/56651fig1.jpg"> 図 1。エナンチオ (RTX) のマウス モデルにおける神経因性疼痛の評価のためのカスタムメイドのプレキシ ガラスのケージと金属メッシュ-小さな繊維の神経障害を誘発します。(A, B)これらのグラフは透明なプレキシ グラス ケージと金属の熱板 (27 cm × 29 cm) 測定に使用される装置 (A) に熱遅延時間を表示 (長さ × 幅 × 高さ: 22 cm × 22 cm × 25 cm) と (B) カスタマイズされたメタによる機械の閾値を評価l メッシュ (メッシュ サイズ: 5 × 5 mm) 半透明シリンダー プレキシ ガラスのケージ (直径: 13 cm; 高さ: 12 cm) RTX 誘起小さな繊維の神経障害を持つマウスで。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56651/56651fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3. 皮膚 IENFs 神経の生検の作製と評価
<ol><li>動作テスト後、5% イソフルランと動物の麻酔し、0.1 M pb 4% パラホルムアルデヒド (4 P) 続いて 0.1 M のリン酸バッファー (PB) (pH 7.4) と心腔内灌流による動物を犠牲に。</li>
	<li>灌流後 2 つグルタミ ン最初フットパッドをカットし、後に 4 P で別 6 h 長期保存のための 4 ° C で 0.1 M の PB への転送足蹠組織のそれらをじっと見つめます。</li>
	<li>Cryoprotect フットパッド PB を一晩で 30% ショ糖と 30 μ m の厚さのスライスの足底の表面的に垂直にカットします。蹠のセクションを順番にラベル付けし、-20 ° C で不凍液に保管 注: 不凍液の組成は次のように: 蒸留水、エチレン グリセリン、グリセリン、3:3:3:1 の比率で 2 x PB。</li>
	<li>確実に適切なサンプリングを蹠のすべての 3 番目のセクションを選択します。<ol>
<li>コート スライド グラスに選ばれた足蹠のセクションを置いて、それらを風乾します。</li>
		<li>スライドと標準的な免疫染色の手順とプロセスのプラスチック オイルタンクから取り外をカバーします。<ol>
<li>30 分のメタノールの 1% H2O2足蹠のセクションを消すし、0.5% 脱脂粉乳と 0.1 %1 h 用 0.5 M Tris バッファー (トリス) のトリトン X-100 をブロックします。</li>
			<li>4 ° C でパン軸索マーカー、PGP 9.5 (で育ったウサギ; 1:1, 000) に対する抗血清と足蹠セクションを一晩インキュベートします。</li>
			<li>足蹠セクション 1 時間室温 (RT) でビオチン標識ヤギ抗うさぎ IgG 二次抗体の孵化し、45 分間常温アビジン-ビオチン複合体を孵化させなさい。</li>
			<li>0.05% で反応生成物を可視化する 3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打) 向け 45 s。蒸留水と足蹠セクションを洗うし、取付のためそれらを風乾します。 注: プライマリおよびセカンダリの血清希釈が 0.5 %0.5 M トリスで脱脂乾燥したミルク。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 負傷した小径ニューロンの DRG セクションの作製と評価
<ol><li>4thと 5thを解剖腰部後根神経節と別の 2 時間のポストの修正。</li>
	<li>30% スクロースを PB Cryoprotect 後根神経節組織一晩し順番に 8 μ m 厚にカット、顕微鏡スライド、およびラベルを貼る。-80 ° C のフリーザーに DRG のセクションを格納します。</li>
	<li>適切なサンプリングが確実に 80 μ m 間隔で Immunostain DRG のセクション。<ol>
<li>二重分類蛍光プロシージャを除き、足蹠のセクションの DRG 染色手順を実行します。また、atf3 作動を含める (で育ったウサギ; 1: 100)、傷害マーカーと peripherin (で育ったマウス; 1:800)、主な抗血清で小径神経マーカー。</li>
		<li>4 ° C で一晩一次抗血清の混合物と後根神経節のセクションを孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>赤や蛍光イソチオシアネート (FITC) をテキサスとどちらかに DRG セクションを孵化させなさい-共役二次抗血清 (レバレッジ)、1 h の RT で適切なプライマリ抗血清に対応するし、定量化のためマウントします。</li>
</ol>

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<li>Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+4-methylcatechol+on+skin+reinnervation%3A+promotion+of+cutaneous+nerve+regeneration+after+crush+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).</li>
<li>Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+decompression+on+neuropathic+pain+behaviors+and+skin+reinnervation+in+chronic+constriction+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury.</a> Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).</li>
<li>Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cutaneous+nerve+regeneration+by+4-methylcatechol+in+resiniferatoxin-induced+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).</li>
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著者がある何も開示するには

診療所の小さな繊維の神経障害の効果的な治療は、機能回復と患者の生活の質を促進するため必要です。現在、ターゲットに小径神経細胞傷害の分子機構の包括的な理解の不足のために小さな繊維神経障害による感覚障害治療ガイドの欠如があります。神経障害の以前のモデルに通常両方大と小口径の感覚神経が影響を受ける例えば、化学療法による末梢神経障害12,32,33と機械による末梢神経障害34,35のモデル。したがって、運動麻痺の大径感覚神経の損傷貢献完全に除外できなかったこれらの神経障害モデルの行動テストで。この議定書では、マウスの小さな光ファイバー神経の障害であり、IENFs 変性の病理組織学的および機能的な証拠を提供することによって細径感覚神経にのみ影響の新しいモデルについて説明します。
RTX は、...

IENFs の変性によって明らかである神経因性疼痛を含む小さな繊維の神経障害は、DM などは化学療法のエージェント1,2、神経毒性影響の結果としての条件の様々 な種類の共通 3,4,5。IENFs は後根神経節 (DRG) にある小径ニューロンの末梢の端末を並行 IENF 変性6の場合に影響を受けます。たとえば、神経突起の変えられた上流遺伝子転写は転写因子 3 (atf3 作動)6,7をアクティブにするのアップレギュレーションによって実証されています。さらに、皮膚生検、IENFs 神経支配の評価は小さな繊維神経障害5,8,9の診断に有用。従来、皮膚生検で IENFs のプロファイルに依存しているタンパク質遺伝子産物の免疫組織化学的デモ 9.5 (PGP 9.5)1,10,11。一緒に取られて、後根神経節と IENFs の病理組織学的プロファイルは機能条件の基になる小さな繊維神経障害を反映し、小径ニューロンに神経障害のこのタイプの機能的な結果の指標となることがあります。
以前は、いくつかの実験的モデルが圧縮または断裂14,15による化学療法による末梢神経障害12,13と神経損傷の場合 IENF 変性の問題を解決しました,16. これらの実験モデルにも大口径の神経が影響を受けるそれは、したがって、, 小さな繊維の神経障害; で影響を受ける大径神経の貢献を除外することはできません例えば、有害な撤退によってこれらの障害の検討は、機能運動神経線維17,18,19に依存します。したがって、純粋な小さな繊維神経障害モデルの確立と体系的に神経突起の小径ニューロンの周辺皮膚神経病理学的状態の調査は必要かつ不可欠です。
RTX はカプサイシン アナログと一過性受容体電位バニロイド受容体に 1 (TRPV1) 受容処理20,21,22を媒介する強力なアゴニスト。最近、周辺の RTX 治療安心神経因性の痛み23,24,25 RTX の intraganglionic 注射誘発 DRG ニューロン22の不可逆的な損失。周辺の RTX 投与の効果は用量依存性20,26,27、過渡的脱感作や IENFs の変性につながった。興味深いことに, 体系的な高用量 RTX 治療は神経因性疼痛28, 小さな繊維の神経障害の症状につながった。治療モードと RTX の用量が異なる病理学的効果と神経の反応を生成することが示唆します。ウィットには、周辺の管理ローカル効果29痛み情報伝達を防いだし、神経因性動作6を開発した神経突起が影響を受けます。総称して、RTX 率効果であり、体系的に周辺の IENFs と中央の神経突起などの末梢神経に影響を与える可能性 RTX の特定の投与量があるかどうか問題を提起したことが判明しました。もしそうなら、RTX は特に小径ニューロンに影響を与えるし、診療所の小さな繊維の神経障害を模倣の潜在的なエージェントであるかもしれない。たとえば、クリニックの DM は代謝性疾患と小さな繊維の神経障害の主な特徴は、末梢神経の病理を含む複雑な問題です。DM 関連の小さな繊維の神経障害のメカニズムは、本剤の末梢神経に影響を与えることができない代謝障害の貢献を除外でした。したがって、DM 関連の小さな繊維の神経障害では、体系的な代謝性疾患の影響を除外することができる純粋な動物モデルが必要です。このプロトコルでは、RTX IENF 変性と小径ニューロンの損傷などを含む変更された免疫染色解析によって示されるように、典型的な小さな繊維神経障害モデルを開発するための作業量について説明します。

<table><tbody><tr><td>化学試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>レシニフェラトキシン</td><td>Σ</td><td>R8756</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Σ</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-ジアミノベンジジン</td><td></td><td>Σ D8001</td><td></td></tr><tr><td>アビジン-ビオチン複合体</td><td>ベクター</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Primary Antisera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peripherin</td><td>Chemicon</td><td>MAB-1527</td><td></td></tr><tr><td>ATF3</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-188</td><td></td></tr><tr><td>PGP9.5</td><td>UltraClone</td><td>RA95101</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>二次抗血清</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG</td><td>ベクターBA-1000</td><td></td><td></td></tr>テ<tr><td>キサスレッドコンジュゲートヤギ抗マウス</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-075-146</td><td></td></tr><tr><td>イソチオシアネート(FITC)結合ロバ抗ウサギジャ</td><td>クソン免疫研究</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>IITC</td><td>モデル 39</td><td></td></tr><tr><td>フォン フレイ フィラメント</td><td>Somedic Sales AB</td><td>10-600-0001</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon カバープレート</td><td>サーモ科学</td><td>72110017</td><td></td></tr><tr><td>スライドラック</td><td>Thermo scientific</td><td>73310017</td><td></td></tr></tbody></table>

一過性受容体電位バニロイド型 1 ultrapotent アゴニストと純粋な小さな繊維の神経疾患のマウスモデルを確立します。

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

糖尿病 (DM) や化学療法剤の神経毒性の影響を経験している患者は、変性と小さな繊維の神経障害と呼ばれる小径感覚ニューロンの損傷による感覚障害を開発があります。小さな繊維の神経障害の存在の動物モデルは両方の大と小口径の感覚線維に影響し、負傷した小径感覚線維の効果を適切に評価するには複雑すぎる、神経病理学をこうして作成します。したがって、これらの問題の検討を十分に純粋な小さな繊維の神経障害の実験モデルを開発する必要があります。このプロトコルは、具体的にはエナンチオ (RTX) 一過性受容体電位バニロイドを通じて型の 1 (TRPV1)、単回投与の ultrapotent アゴニストと細径感覚神経に影響を与える小さな繊維の神経障害の実験的モデルを記述します。腹腔内投与、RTX 神経障害と呼ばれます。この RTX 神経の病的な症状を示し, 表皮内神経線維 (IENF) 変性、具体的には外傷を含む小さな繊維神経症患者の臨床的特徴を模倣行動の異常小径ニューロンと熱消と機械的アロディニアの誘導。このプロトコルは、RTX の 3 つの線量をテストした (200、50、および 10 μ g/kg、それぞれ)、結論 RTX の重要な線量 (50 μ g/kg) の典型的な小さな繊維の神経障害症状の開発に必要なし、する変更された染色手順を準備IENF 変性神経相馬損傷を調査します。修正手順は、高速、体系的、かつ経済的です。神経因性疼痛の行動評価は、細径感覚神経の機能を明らかにするため重要です。実験齧歯動物で機械しきい値の評価は特に挑戦的なこのプロトコルを記述するこのタイプの齧歯動物の評価に適しているカスタマイズされた金属製のメッシュ。要約すると、RTX 神経障害は分子の重要性と神経因性疼痛治療薬の開発のための基礎となる介入を評価する新しいと簡単に確立された実験的モデルです。

このプロトコルでは、RTX 神経障害、具体的には IENF の変性、感覚器障害 (図 2) に関連付けられているを含む小径ニューロンに影響を与える新規マウスモデルをについて説明します。ここ記載されているプロトコルに従い、動物は熱消、D7 のポスト RTX 噴射で機械的アロディニアを展示しました。この小さな繊維神経障害モデルを RTX の 3 つの用量の確立: i. p. のルートで 200、50、および 10 μ g/kg を投与します。RTX 線量 (50 μ g/kg) は、重要とみなされ、予備的考察その高線量を示した RTX (200 μ g/kg) 引き起こされる高いマウス致死率 (図 3)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56651/56...

本研究は、純粋な小さな繊維エナンチオ (RTX) ニューロパシーの実験モデルを確立します。RTX のユニークな線量 (50 μ g/kg) が患者の特性を模した小さな繊維神経障害モデルを開発するため最適な神経因性疼痛の基礎となる受容分子の意義を調査を助けることができます。

一過性受容体電位バニロイド型 1 Ultrapotent アゴニストと純粋な小さな繊維の神経疾患のマウスモデルを確立します。

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

この感覚特異的な神経毒送達手順の全体的な目標は、小動物の感覚ニューロパチーモデルを確立することです。この技術は、感覚神経障害における小さな感覚線維の損傷の法則を明らかにするのに役立ちます。その主な利点は、速くて簡単であることです。これらのマウスは、大きな感覚線維にとってどの経路が重要な寄与であるかなど、感覚神経障害領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、個人用保護具を着用し、レシニフェラトキシン(RTX)のストック溶液を作成する際に適切な予防措置を講じます。実験のために600マイクロリットルの1アリコートを生理食塩水で希釈し、残りを12マイクロリットルのアリコートに分割して保存します。試験用マウスには、体重35〜40グラムの8週齢の成体雄ICRマウスを使用します。マイクロインジェクションシリンジを使用して、RTX溶液の単回投与を腹腔内投与します。次に、マウスの第2のグループに、コントロールとして機能するように等量のビヒクルを注入します。すべての注射を行った後、マウスを自宅のケージに収容し、餌と水をアドリブで利用できることを確認します。7日後、週に1回行動テストの実施を開始します。両方のテストは、安定した環境の静かなテストルームで同じ日に実施します。ホットプレートテストで動物の熱待ち時間を測定することから始めます。金属製のホットプレートを摂氏52度にセットします。次に、ホットプレートの透明なプレキシガラスケージに動物をそっと入れます。動物の後ろ足が熱いケージに触れたらすぐにタイマーをスタートさせます。動物が震えたり、後ろ足を舐めたり、飛び跳ねたりした場合は、動物を取り外して、ホットプレートに10分の1秒以内に耐えた時間を記録します。動物がホットプレートで反応を示さない場合は、組織の損傷を避けるために25秒後にセッションを停止します。動物ごとに3回の試行を行い、試行の間に30分の休憩時間があります。後で、3 つのテストの平均時間を動物の最終スコアとして使用します。次に、動物の機械的感覚の閾値を測定します。動物を透明な丸いケージに入れ、床に金属メッシュを入れます。順応後、上下の方法を使用して、フォンフレイヘアフィラメントの異なる口径を後足の足底領域に適用します。最初の刺激では、ミドルフォースフィラメントを5〜8秒間適用します。各刺激の後、2分間待ってから、動物の以前の反応に基づいて次の力を加えます。後足が引っ込んだ場合は、次に低い口径のフィラメントを使用してください。また、後足が引き出さなかった場合は、次に大きいフィラメントを使用してください。マウスが6回突かれるまで、このプロセスを続けます。次に、確立された式を使用して機械的なしきい値を計算します。各テスト日には、各後足で3回の試行を行います。これら 6 つの機械的しきい値の平均を、各動物の平均機械的しきい値として表します。安楽死には、5%のイソフルランを使用し、続いて心臓内灌流を行います。次に、2つの後足の最初のフットパッドを取り外し、4%PFAで6時間固定します。固定後、摂氏4度の0.1モルリン酸緩衝液に移します。これは、長期保存ソリューションとして機能します。凍結切片を作成する前に、フットパッドをPBSの30%スクロースに一晩浸します。翌日、クライオスタットを使用して、足底表面に対して垂直に切断する30ミクロンの組織スライスを作成します。フットパッドセクションに順番にラベルを付け、マイナス20°Cの耐フィーズ溶液に保管します。切片をサンプリングするときは、3つおきに切片を選択し、コーティングされたスライドガラスに移して風乾します。次に、両面をカバープレートで覆い、標準的な免疫染色手順で処理します。まず、フットパッド部分をメタノール中の1%過酸化水素で30分間急冷します。次に、室温の0.5モルトリスバッファーを使用して組織を3回洗浄します。次に、ブロック溶液中で組織を1時間インキュベートします。次に、汎軸索マーカーに対する抗血清で切片を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、切片をTrisバッファーで3回洗浄し、ビオチン化抗ウサギIgGで切片を室温で1時間インキュベートします。その後、Trisバッファーで3回洗浄し、結合していない抗体を除去します。次に、アビジンビオチン複合体と組織を室温で45分間インキュベートします。反応生成物を染色するには、DAB溶液を45秒間短時間塗布した後、フットパッド部分を蒸留水で洗浄し、自然乾燥させてからマウントします。安楽死させた動物からフットパッドを取り外した後、4番目と5番目の腰椎DRGを解剖します。次に、解剖したDRG組織を室温で4%PFAで2時間ポストフィックスします。次に、DRG組織をPBS中の30%スクロースで一晩凍結保護します。翌日、それらを8ミクロンのセクションに切ります。スライドに置き、ラベルを付けます。これらのセクションは摂氏マイナス80度で保管してください。ラベリングする場合を除き、フットパッド切片に使用したのと同じ方法を使用し、損傷マーカーであるATF-3と、一次抗血清の小径ニューロンマーカーであるペリフェリンを含め、その反応を一晩実行します。切片を洗浄した後、適切な二次抗血清とインキュベートします。次に、別の一連の洗浄の後、定量化のために切片をマウントします。このプロトコルは、感覚障害に関連するIENF変性を含む小径ニューロンに特異的に影響を与えるレシニフェラトキシン神経障害の新規マウスモデルについて説明しています。1キログラムあたり50マイクログラムの用量は重要と見なされ、より高い用量はしばしば致死的でした。RTX注射の7日後、動物は熱痛覚低下症と機械的異痛症を示しました。臨界用量では、IENF変性があり、ATF-3誘導が認められました。損傷したニューロンはペリフェリン陽性の小径ニューロンであった。対照的に、低用量のRTXは小繊維ニューロパチーを確立せず、神経支配に変化を示さなかった。また、低用量では、ニューロン損傷のマーカーであるATF-3誘導も示されませんでした。したがって、1キログラム当たり50マイクログラムのRTXの臨界用量が、記載された方法の適用のために推奨される。このビデオを見れば、純粋な感覚ニューロパチーモデルを確立する方法についてよく理解できるはずです。それが開発された後、この技術は、小さな感覚神経障害の分野における研究への道を開き、その製品の貢献に 傷害 小さな感覚神経、開発における神経因性疼痛。RTXは神経毒性があり危険であり、目、粘膜、上気道を刺激する可能性があることを忘れないでください。吸入を避け、ラボ用眼鏡を着用し、RTXを取り扱うときはコートを着用してください。皮膚に付着した場合や取り扱い後は、多量の水で洗い流してください。

establishing-mouse-model-pure-small-fiber-neuropathy-with-ultrapotent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、マウスモデルで片方の側を外科的に除神経し、もう片方をコントロールとして残すことで感覚神経機能をテストする方法を示しています。機械的刺激に対する応答は、感覚神経の役割を裏付けています。...

外科的除神経マウスモデルにおける感覚神経機能の試験

このビデオでは、TRPV1アゴニフェラトキシン(RTX)を使用してマウスの小繊維ニューロパチーモデルを確立する方法を示します。マウスへのRTX投与の手順を概説し、RTXが小径の感覚ニューロンでニューロン死を誘発し、それによってニューロパチーモデルを確立する方法を説明しています。...

レシニフェラトキシンを用いた小繊維ニューロパチーのマウスモデルの確立

神経因性疼痛は、体性感覚系に影響を及ぼす病変または疾患の結果である。マウスでは神経因性疼痛の「カフモデル」は坐骨神経の主枝の周囲にポリエチレンカフの注入で構成されています。機械的異痛は、von Freyフィラメントを使用してテストされています。...

マウスにおける神経因性疼痛の坐骨神経細胞浸潤モデル

このレポートは、Freund 完全アジュバント、百日咳毒素との組み合わせでゼロ (P0)180 199ペプチド ミエリン蛋白を用いた実験的自己免疫性炎 (EAN) を正常に誘導するために単純な方法をについて説明します。機能的障害とこの EAN...

機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ

神経伝導測定神経変性のマウス ・ モデルを評価するために有用なツールだけど、よく後肢で坐骨神経を刺激するためにのみ適用されます。ここでは、複合筋活動電位...

生体内で運動ニューロンの変性症のマウスモデルの前肢からの複合筋活動電位の電気生理学的測定

この手法の目的は、一次運動ニューロン (MNs) マウスの脊髄からの高濃縮文化を準備することです。ミネソタ病気を引き起こす突然変異の結果を評価するために述べるこれらの分離が magnetofection で、トランスフェクションの MNs...

株マウス一次運動ニューロンによるシャルコー ・ マリー ・ トゥース病の in Vitroモデル化

フットパッド接種モデルは、生体内でウイルス誘発性神経炎症反応を特徴付けるための貴重なツールです。特に、末梢神経系において開始されたウイルス動態および関連する免疫病理学的プロセスの明確な評価を提供する。...

ウイルス誘導神経炎症反応を研究するマウスフットパッド接種モデル

この修正手術は、マウスまたはラットの温存神経損傷モデルのための簡略化された方法であり、一般的な腓骨神経と腓骨神経の両方を損傷するために1回の結紮と1回の切断のみが必要です。...

マウスの神経因性疼痛の改良温存神経損傷手術モデル

部分的な坐骨神経結紮は、熱的および機械的刺激に対する誇張された反応を特徴とする、長期にわたる慢性神経因性疼痛を誘発する。神経因性疼痛のこのマウスモデルは、疼痛管理のための革新的な治療法を研究するために一般的に使用されています。この記事では、標準化と再現性を向上させるための外科的手順について詳しく説明します。...

坐骨神経部分結紮術:新規治療法の抗侵害受容効果を研究するための慢性神経因性疼痛のマウスモデル

マウスにおける眼窩遠位神経の慢性狭窄損傷は、継続的な疼痛や異痛症の徴候である触覚刺激(フォン・フレイ毛髪刺激に対する過敏性)に応答した自発行動(顔面グルーミング活動の増加)や夜間防御行動の変化を誘発し、三叉神経障害性疼痛のモデルとなる。...

三叉神経障害性疼痛を研究するためのマウスにおける遠位眼窩下神経の慢性狭窄損傷(DIoN-CCI)

このプロトコルは、感覚神経を使用してヒト神経腫の痛みを模倣し、外科的治療を評価するための再現性のあるラットモデルを提示し、トランスレーショナル神経腫研究のための貴重なツールを提供します。...

伏在神経を介した標的筋再神経支配を使用した神経腫疼痛治療オプションを研究するための新しい外科的げっ歯類モデル

学ぶRTXを用いたマウス小繊維神経障害モデルの確立法。腹腔内投与により熱感覚過敏と機械的異常性疼痛を誘導し、IENF変性とATF-3発現を確認。神経性疼痛の病態生理解明と治療標的探索に有用な実験系を提供します。

一過性受容体電位バニロイド型 1 Ultrapotent アゴニストと純粋な小さな繊維の神経疾患のマウスモデルを確立します。

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