Name: 合成とオリゴ ペプチドの質量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぶオリゴペプチドの手動合成と質量分析によるモノマー配列解析の手法。初心者向けの視覚的ガイドとして、標準的分析化学ラボで特殊モノマー残基を持つペプチドの合成と構造同定を支援します。

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著者は、peptoid 合成における技術支援のため氏マイケル ・ コノリーと博士ロナルド Zuckermann (の分子鋳造、ローレンス ・ バークレー国立研究所) を感謝したいです。我々 は、全米科学財団 (チェ ・ 1301505) からの支援を認めます。パシフィック大学で化学質量分析施設ですべての質量分析実験を行った。

1. Peptoid の合成
注: 合成樹脂の樹脂を膨潤・保護グループを削除するアクティブにするから始まります。樹脂モノマー添加サイクルの繰り返しで上に peptoid チェーンの成長が続きます。樹脂と結合した最初の単量体は、C 末端残基です。Peptoid は N 末端から C 末端細長い。目的の peptoid シーケンスを達成すると、樹脂はオフ切断、peptoid 製品を精製します。
<ol><li>試薬の調製 注: 液体の試薬、マイクロ ピペットを使用して測定したで、固体試薬分析用天秤を用いています。<ol>
<li>ミックス 6.2 mL の n、N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) と n, n-ジメチルホルムアミド (DMF) DIC/DMF 溶液の 0.8 M を準備する 43.8 mL。</li>
		<li>0.8 M BMA/DMF 溶液を調製する DMF の 50.0 mL に BMA の 5.56 g を溶解します。</li>
		<li>2 mL ピペリジン (Pip) の 20% DMF Pip/ソリューションを達成するために DMF の 8 mL を混ぜます。</li>
		<li>1.9 mL Npe の 1.0 を達成するために DMF の 13.1 mL に溶解 M Npe/DMF。</li>
		<li>13.7 mL 1.0 を達成するために DMF に Nme の 1.3 mL を溶かす M Nme/DMF。</li>
		<li>0.32 mL ナエの 1.0 を達成するために DMF の 2 mL に溶解 M ナエ/DMF。 注意: 合成に使用される化学物質のほとんどは、危険です。トリフルオロ酢酸 (TFA) や DIC、Pip、BMA は、皮膚、目、呼吸器に有害な。DMF、ジクロロ メタン (DCM) は、発がん性を疑われています。ヒューム フードすべての反応を実行して、適切な個人用保護具を使用する必要があります。合成で使用されるすべての化学物質の化学物質等安全データシート (MSDS) をご確認ください。</li>
	</ol></li>
	<li>樹脂活性化
	<ol>
<li>84 mg 場アミド樹脂 (樹脂、0.047 ミリ モル 0.56 ミリ モル/g の読み込み) を測定し、10 mL のポリプロピレンの固相反応容器に追加。プランジャーを容器に挿入します。</li>
		<li>反応容器に DMF の 2 mL を加えて圧力キャップと容器のキャップします。シェーカーに容器を置き、キャップを取り外し、反応容器のプランジャーを押すことによって廃棄物コンテナーに約 12 度と 385 振動/分 30 分排水ソリューションのための動きの角度で常温で容器を揺り動かしなさい。</li>
		<li>容器に 20 %pip/DMF 溶液 2 mL を加えて、容器のキャップします。2 分、シェーカーの扇動し、ドレインの廃棄物コンテナーにソリューション。</li>
		<li>20 %pip/DMF 溶液 2 mL を加える容器、キャップ、容器とキャップ 12 分削除の室温でそれを扇動し、廃棄容器への解決策をドレインします。</li>
		<li>DMF、キャップ、容器の 1 つの mL を追加することによって樹脂を洗い、キャップをはずし、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレイン 1 分の容器を攪拌します。4 追加回 DMF と樹脂を洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>モノマーを添加し、N 末端のアセチル化 注: 各モノマー添加サイクルは、2 つの反作用のステップ、bromoacetylation、変位を伴います。<ol>
<li>Nme 樹脂フォーム最初のモノマー添加サイクルを実行します。</li>
		<li>Bromoacetylation 反応を実行します。0.8 M BMA/DMF 溶液の 1 mL のビーカーに 0.8 M DIC/DMF 溶液 1 mL を混ぜます。樹脂を含む反応容器に混合物を転送し、容器のキャップします。シェーカーに容器を置くとキャップ 20 分削除の室温でそれを扇動し、廃棄物コンテナーにソリューションをドレインします。</li>
		<li>DMF の 1 mL を追加する、容器のキャップ、1 分攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水によって樹脂を洗浄します。DCM の 1 つの mL を追加し、1 分の容器を撹拌排水ソリューション樹脂を洗浄します。もう一度、DCM の樹脂を洗浄し、DMF で 2 回洗ってください。</li>
		<li>置換反応を行います。1.0 M Nme/DMF 溶液の 1 mL を追加し、容器のキャップ、キャップ 60 分削除のため室温で容器を扇動、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレインします。</li>
		<li>1 mL DMF を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。1 ml の DCM、1 分攪拌を描画し、排水ソリューションにより樹脂を洗浄します。DMF で 2 回洗浄後もう一度、DCM を洗います。</li>
		<li>1.3.2 に 1.3.5 Nae-(Npe-Nme)4を形成するための手順からモノマー添加サイクルを繰り返す-樹脂。置換反応 (1.3.4) の手順を繰り返し、peptoid 順序に従って特定アミン溶液を使用します。 注: peptoid チェーンが伸長する C 末端から N 末端に樹脂にバインドされている C 末端残基を持つ。</li>
		<li>Ac-Nae-(Npe-Nme)4を形成する N 末端アセチル化を実行-樹脂。</li>
		<li>ミックス 92年 μ L の酢酸無水、43.5 μ N、N diisopropylethylamine (DIPEA)、ビーカーに DMF の 2 mL、約 2 mL のアセチル化をカクテルを作る。</li>
		<li>樹脂を含む容器に 2 mL のアセチル化のカクテルを追加、キャップ、容器および 60 分のキャップをはずし、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレインの室温でそれを扇動します。</li>
		<li>DMF の 1 mL を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。DCM の 1 つの mL を追加し、1 分の容器を撹拌排水ソリューション樹脂を洗浄します。DCM、一度より多くの樹脂、さらに 2 回 DMF で洗浄洗浄を繰り返します。</li>
		<li>DCM の 1 mL を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。DCM で 2 回洗浄を繰り返します。キャップをはずし、10 分間反応容器内空気乾燥させる樹脂。</li>
	</ol></li>
	<li>胸の谷間と浄化
	<ol>
<li>TFA、triisopropylsilane (ヒント) を 100 μ l 添加 HPLC グレード H2O ビーカーに 100 μ L の胸の谷間の 4 mL のカクテルを作るための 3.8 mL を混ぜます。</li>
		<li>4 mL の新鮮な作った胸の谷間カクテル樹脂を含む容器に追加、容器、キャップ、2 時間室温で攪拌します。</li>
		<li>キャップをはずし、50 mL ポリプロピレン製遠心管に濾液ソリューションを収集します。容器に TFA の 1 mL を追加、キャップ、および 1 分同じ遠心管に収集濾液ソリューションを扇動します。</li>
		<li>粘性解は左が約 1 mL まで窒素ガスのストリームで優しく吹いて TFA を蒸発させます。</li>
		<li>残りの溶液にジエチル エーテル 15 mL を追加、遠心分離機管のキャップ、一夜にして 2 時間-20 ° C のフリーザーでそれを孵化させなさい。原油の peptoid は、白色固体として析出します。</li>
		<li>遠心分離機管のキャップ 10 分削除 4,427 × g で遠心分離機を用いた固体のペレットし、ソリッドを失うことがなく慎重にビーカーにジエチル エーテルをデカントします。 注意: ジエチル エーテルは可燃性の有機溶剤です。ジエチル エーテルの安全なの遠心分離機を使用してください。</li>
		<li>洗浄は遠心分離機に冷たいジエチル エーテル 10 mL を加えることによって固体管、固体を含むチューブをキャップと遠心分離機で配置すること。10 分間遠心遠心分離機からチューブし、ソリッドを失うことがなく慎重にビーカーにジエチル エーテルをデカント削除 4,427 × g で遠心分離を行います。</li>
		<li>固体を乾燥するには、窒素ガスのストリームでやさしく吹いて。</li>
		<li>HPLC グレード H2O 乾燥した固体を溶解するための 10 mL を追加します。ソリューションを孔径 0.45 μ m のナイロン シリンジ フィルターを通過し、前加重 50 mL ポリプロピレン製遠心管に濾液を収集します。</li>
		<li>シェル固定ソリューションを配置し、液体窒素で満たされた 12 オンス、ダブル スタック拡張ポリスチレン カップに 1/3 peptoid ソリューションを含む遠心管を回転します。固体 peptoid を生成するため冷凍ソリューション一晩を凍結乾燥します。</li>
		<li>HPLC グレード H2O の mL の 10 に固体 peptoid を溶解して凍結 1 つより多くの時間を繰り返し、液体窒素で凍結し、一晩を lyophilizing をシェルします。結果として得られる peptoid は、質量分析法による配列解析のために十分に純粋です。</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS 測定と解析
注: MS/MS 実験はエレクトロ スプレー イオン化 (ESI) ソースに結合トリプル四重極質量分析計で実施です。データ コレクションは、楽器を伴うデータ集録ソフトウェアを使用して制御されます。一般的な手順が含まれています 1) フル スキャン質量分析実験を行うと実験 2) MS/MS シドを実行する質量スペクトルを記録、MS/MS スペクトルを記録し、3) 理論 MS/MS スペクトル データを比較します。フラグメント化スキームは、peptoid の構造的特徴に基づく予測します。
<ol><li>試料溶液の調製
	<ol>
<li>3-5 mL のガラス瓶で 1.0 2.0 mg 固体 peptoid を重量を量る。溶解、peptoid に 1 mL 混合溶剤のアセトニ トリルと水 (ACN/H2O、1:1、v/v) を追加します。これは約 10-3 M の濃度でストック サンプル ソリューションを提供します。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブに 20 μ L の原液を転送し、ACN/H2O 約 10-5 M の希釈試料溶液を生成するための 1 mL 混合溶媒を追加します。</li>
		<li>3 分別 1.5 mL 遠心にソリューションのトップの部分の約 700 μ L を転送の 4,427 × g で遠心分離を実行することによって希釈試料溶液の任意の可能な不溶性粒子 peptoid MS の実用的なソリューションを作るにチューブを削除約 10-5 M の濃度。</li>
		<li>質量分析法による測定では, 観測信号強度に基づく MS 作業溶液の濃度を調整します。</li>
		<li>0.20 μ m シリンジ フィルターを試料溶液を通過し、濾液を収集 peptoid MS 約 10-5 の実用的なソリューションを作るに 1.5 mL 遠心チューブには希釈試料溶液の任意の可能な不溶性の粒子を除去する方法M。</li>
	</ol></li>
	<li>質量スペクトルを記録
	<ol>
<li>エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) 源によって ACN/H2O (1:1、v/v) の混合溶媒を実行し、標準的な肯定的なイオンの計測器、質量電荷比 (m/z) 100-1500 の範囲と完全なスキャン質量分析モードを設定します。 メモ: 典型的な動作パラメーター: ESI 針電圧 5 kV キャピラリー電圧 40 V 乾燥ガス (窒素ガス) の温度は、200 ° C</li>
		<li>500 μ L または 1 mL の注射器に peptoid MS 作業ソリューション (約 10-5 M) の約 300 μ L を追加し、キャピラリー ポリエーテル エーテル ケトン (ピーク) チューブを用いた ESI 入口に注射器を接続します。シリンジ ポンプに注射器を置き、ESI 入口に試料溶液を注入する 10 μ L/分の流量を設定します。</li>
		<li>ESI プロセスをアクティブに ESI 針電圧をオンにし、検出器の電源を入れます。プロフィール モードで 100-1,500 の m/z 範囲表示を設定します。プロファイル ウィンドウに示すように質量スペクトル プロフィールを表示します。M/z 1,265 (m/z 1,264.6 のとして表示) でピークは peptoid イオンまたはプロトン化 peptoid に対応します。</li>
		<li>2 分の MS スペクトルを記録します。「メソッド ウィンドウ」で「実行時間」として 2 分を使用記録ウィンドウを開き、適切なファイル名を入力、スペクトルを記録します。 注: 結果の質量スペクトルは図 3に示すです。</li>
		<li>M/z 1,265 のピークの強度を最適化します。1,150 1,350 m/z 範囲を設定し、プロフィール ウィンドウに表示される mV でピーク強度を表示しながら毛細血管の電圧を調整します。たとえば、増加するキャピラリー電圧 50 V をまたはより高いピーク強度の変化を見ると。最適なピーク強度は 150-200 mV。 注: キャピラリー電圧を調整すると、特定イオンの豊かさが大きく変わる。キャピラリー電圧を増加 peptoid イオンの強度を高めることができます。しかし、高キャピラリー電圧がイオン源の peptoid イオンの解離を引き起こすも、観測強度を減少します。M/z 1,265, ピークの強度を高めることができるガスを乾燥の温度を調整するキャピラリー電圧を調整するよりも効果的です。M/z 1,265 でピークが最適な強度が到達しない場合は、サンプルの濃度 (または二重 MS 作業溶液の濃度など) を調整します。</li>
		<li>楽器を MS/MS モードに切り替えます。M/z 1,265 前駆イオンを設定し、MS/質量質量 100 1,400 の m/z の範囲。「メソッド ウィンドウ」で「第 1 四半期最初のミサ」として m/z 1,265 を使用し、、「第 1 四半期最後のミサ」を空白のままにします。「Q3 最後質量」として「第 3 四半期最初のミサ」、m/z 1,400 m/z 100 を使用 注: MS/MS モード、前駆イオンと peptoid イオンを分離する質量フィルターとして最初の四重極ユニット (Q1) 機能で第 2 四重極ユニット (Q2) は衝突セルと 3 つ目の四重極ユニット (Q3) 機能質量分析器として。</li>
		<li>1.5 mtorr 圧 40 eV で衝突エネルギーと衝突ガス (アルゴン、この場合) セットします。</li>
		<li>プロファイル ウィンドウに表示質量スペクトル プロフィールを表示します。M/z 1,265 のピークは peptoid イオンに対応し、m/z 値の低いピークは peptoid イオンからフラグメントを表します。</li>
		<li>断片化スペクトルの表示を最適化するために衝突エネルギーを調整します。45 eV に衝突エネルギーを増やすなど、スペクトルの変化を表示します。 注: 一般的に、衝突エネルギーを増加強化フラグメント イオンの豊富なし peptoid イオンの豊かさを減らします。衝突ガス圧力を増加させると、フラグメント イオンの豊かさをまた高めます。 注意: 2 mTorr を超えて衝突ガス圧を増やさないでください。</li>
		<li>2 分の MS/MS スペクトルを記録します。「メソッド ウィンドウ」で「実行時間」として 2 分を使用記録ウィンドウを開き、適切なファイル名を入力、スペクトルを記録します。</li>
		<li>1-2 回の記録を繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>Peptoid シーケンス解析 注: CID の条件の下で一連の B イオンと呼ばれる N 末端フラグメントと Y イオンと呼ばれる C 末端フラグメントのシリーズを生成する peptoid バックボーンに沿ってアミド結合でフラグメントは peptoid イオン<ol>
<li>左側と右側に、C 末端に N 末端を置くことによってアセチル化 peptoid の化学構造を描画し、フラグメント化スキームを図 2 aに示すように、生成する各アミド結合で破線を描画します。電荷キャリアを示す破線の円内でプロトンを描画します。構造体の左側から開始して、B1B2B8として N 末端フラグメントを示す破線にラベルを配置します。右側から始まって、Y1Y2Y8として C 末端フラグメントを示す破線にラベルを配置します。 注: 化学ソフトウェアの描画は、peptoid 構造を描画する使用できます。</li>
		<li>左から 4番目のアミド結合での断片化を想像して、N 末端フラグメントと図 2 bに示すように、適切な正式な料金と C 末端フラグメントの構造を描きます。N 末端フラグメントで B4のラベルを配置し、C 末端フラグメントの Y5のラベルを配置します。580 の値を生成するための構造の要素の公称質量を合計することによって B4の m/z 値を計算し、N 末端フラグメントで 580 m/z を配置します。Y5 m/z 値を計算し、C 末端フラグメントの 685 m/z を配置します。</li>
		<li>すべて 8 B イオンおよびすべての 8 Y イオンの m/z 値を計算し、表 1に示すように、テーブルでは、それらを組み立てます。 注: フラグメントの m/z 値は描画ソフトウェア化学を使用して計算できます。</li>
		<li>楽器を伴うデータ レビュー ソフトウェアを使用して peptoid の記録の MS/MS スペクトルを開きます。「イオンのラベルを表示する」にラベル設定とラベルしきい値を 3% に設定します。これはピークのラベルの付いた m/z 値の MS/MS スペクトルを生成します。</li>
		<li>MS/MS スペクトル データを csv ファイル形式のテキスト ファイルとして書式設定し、データ処理ソフトウェアを使用してスペクトルを再構築をエクスポートします。ピークの m/z 値を配置します。結果の MS/MS スペクトルを図 4に示します。 メモ: いくつかの質量分析計は、MS/MS スペクトルを生成するデータ処理ソフトウェアが装備されています。この場合、MS/MS スペクトル データをエクスポートする必要はありません。</li>
		<li>表示、対応する B と Y-イオンを識別するために表 1に示されるように MS/MS スペクトル m/z 値を割り当てます。B4m/z 580 でピークを識別するたとえば、-イオンと 685 m/z が Y5として識別されて-イオン。図 4に示すように、スペクトルに対応する B と Y 記号のピークのラベルを付けます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type%2FArginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
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<li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li>
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提示プロトコルを使用して nonamer peptoid、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2は合成されています。合成装置には、注射器のようなポリプロピレン固相反応容器と機械的シェーカーが含まれます。反応容器は商業的に低コストです。機械的シェーカーは、化学実験室で一般的な装置です。注射器のような反応容器を使って、ソリューションは引き込まれるしプランジャーを手動で移動することによって容器からプッシュできます。この技術により単量体、1 つの単一の反作用の容器で発生する追加と樹脂の胸の谷間反応、胸の谷間の別容器に樹脂連結中間製品を転送する手順が不要に。この手法は、反応容器からソリューションを削除する真空抽出装置の必要性もなくなります。真空抽出、他研究者19,20によって実証されている手動 peptoid 合成に使用されます。反応ステップ間樹脂を徹底的に洗浄は高純度の製品を得ることが重要です。潜在的な問題の 1 つは、モノマー添加のいくつかのサイクル後反応容器で釉薬の目詰まりです...

ペプチドは、ペプチドの構造を模したバックボーン構造を持つシーケンス制御された高分子のクラスです。ペプチド合成できる多様なアミンから高度可変プロパティ1,2を展示するペプチドを可能にします。ペプチドは、生物物理学的研究、治療薬として考えられている、タンパク質3,4,5,6配位子として設計されて分子モデルとして使用されています。ペプチドは、防汚と抗体ミメティック材料、抗菌薬、酵素阻害剤7,8,9などの生理活性物質の多様性に開発されています。高い順序と可変自然とペプチドも考えられたの分子情報ストレージ10の種類として。シーケンスとペプチドの構造を特徴付けるため効率的な分析法の開発のためのこれらの多様なアプリケーション呼び出しの発見。タンデム質量分析を用いた手法は、ペプチド11,12,13を含む、シーケンス制御された高分子のシーケンスのプロパティを分析するための選択の方法として約束を示しています。 14,15。しかし、体系的な研究から生じる peptoid イオン断片化パターンを関連付ける質量分析研究、ペプチドの構造情報が非常に限られました。
ペプチドは、固相メソッドを使用して容易に合成することができます。よく発達したメソッドには、2 段階モノマー添加サイクル16,17のイテレーションが含まれます。またサイクルごとに樹脂連結アミンはハロ酸 (通常ブロモ酢酸、BMA)、によってアセチル化し、第一次アミンの置換反応が続きます。標準化学研究所16,18,19、で優秀な利回りとペプチドを手動で合成できる自動合成プロトコルは、peptoid 合成の日常的に適用されているが20。
当研究室は、手動 peptoid 合成法を採用したあり、既存のメソッドで使用される装置を簡略化します。ペプチド ・ MS/MS テクニック21,22,23を使用して一連の分裂パターンは学んだこともあります。衝突誘起解離 (CID)21,23にさらされるまたは電子捕獲解離 (ECD)22実験時、ペプチドが特徴的な分裂を生成することが分かった。この記事では、標準的な化学実験室でのオリゴ ペプチドの合成方法、トリプル四重極の質量分析計を用いた CID 実験を実行する方法およびスペクトル データを分析する方法を示しています。合成して特徴付けられる peptoid は、N 末端アセチル化、C 末端アミド化、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2と nonamer です。Peptoid の構造を図 1に示します。

<table><tbody><tr><td>ESI三重四重極質量分析計、Varian 320L</td><td>アジレント・テクノロジーズ社</td><td></td><td>質量分析計はVarian, Inc.から取得されました。</td></tr><tr><td>Varian MS ワークステーション バージョン 6.9.2、データ取得およびデータレビューソフトウェア</td><td>ヴァリアン社</td><td></td><td>このソフトウェアはVarian 320Lパッケージの一部です</td></tr><tr><td>バレル・サイエンティフィック・リストアクションシェーカー、モデル75 DD</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・インターナショナル社</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>ヘルムル遠心分離機、モデルZ 206 A</td><td>ハームレ・ラボテクニク GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固体相反応容器、10 mL</td><td>トルヴィク</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>反応容器用の圧力キャップ</td><td>トルヴィク</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター、孔径0.2 & mu;m</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター、孔径0.45 & mu;m</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン遠心分離機の牽引装置、50 mL</td><td>VWRインターナショナル合同会社。</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン遠心分離機の牽引装置、15 mL</td><td>VWRインターナショナル合同会社。</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw Ultra バージョン 12.0</td><td>ケンブリッジソフト・コーポレーション</td><td></td><td>ケンブリッジソフトは現在、パーキンエルマー社の一部となっています。</td></tr><tr><td>発泡スチロールカップ、12オンス</td><td>コモン・スーパーマーケット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リンクアミド樹脂</td><td>ケム・インペックス・インターナショナル社</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>ピペリジン</td><td>ケム・インペックス・インターナショナル社</td><td>02351</td><td>非常に有害です</td></tr><tr><td>N、N'-ジイソプロピルカルボジイミド</td><td>ケム・インペックス・インターナショナル社</td><td>00110</td><td>非常に有害です</td></tr><tr><td>臭酢酸</td><td>ケム・インペックス・インターナショナル社</td><td>26843</td><td>非常に有害です</td></tr><tr><td>2-フェニルエチルアミン</td><td>VWRインターナショナル合同会社。</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-メチオキシエチルアミン</td><td>シグマ・オルドリッチ社 LLC。</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-ボック-エチレンジアミン</td><td>VWRインターナショナル合同会社。</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>酢酸無水物</td><td>シグマ・オルドリッチ社 LLC。</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N、N-ジメチルホルムアミド</td><td>VWRインターナショナル合同会社。</td><td>BDH1117-4LG</td><td>使用前のさらなる蒸留</td></tr><tr><td>N、N-ジイソプロピルチルアミン</td><td>ケム・インペックス・インターナショナル社</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>トリイソプロピルシラン</td><td>ケム・インペックス・インターナショナル社</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>ケム・インペックス・インターナショナル社</td><td>00289</td><td>非常に有害です</td></tr><tr><td>ミリポーアMILLI-Q学術水浄化システム</td><td>ミリポア・コーポレーション</td><td>ZMQP60001</td><td>HPLCグレードの水を生成するために</td></tr><tr><td>HPLCグレードの水</td><td></td><td></td><td>ミリポア製 MILLI-Q&reg;学術水浄化システム</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ファームコ・アーパー</td><td>339USP/NF</td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・インターナショナル社</td><td>A998-4</td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>VWRインターナショナル合同会社。</td><td>BDH1121-19L</td><td>使用前のさらなる蒸留</td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>VWRインターナショナル合同会社。</td><td>BDH1113-19L</td><td>使用前のさらなる蒸留</td></tr><tr><td>窒素ガス</td><td>フレズノ酸素/バーンズサプライ</td><td>NIT 50-C-F</td><td>超高純度、99.9995%</td></tr><tr><td>アルゴンガス</td><td>フレズノ酸素/バーンズサプライ</td><td>ARG 50-C-F</td><td>超高純度、99.9995%</td></tr></tbody></table>

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

ペプチドは、N-アルキル グリシン ユニットで構成されるシーケンス制御ペプチド模倣オリゴマーです。多くの潜在的なアプリケーション間で、ペプチドは、分子情報ストレージの種類としての考えられてきました。質量分析は、配列ペプチドの選択の方法を考えられています。ペプチドは、繰り返し 2 段階反応サイクルを用いた固相化学経由で合成できます。タンデム質量分析 (MS/MS) 技術を用いたペプチドの順序を分析する手動でオリゴ ペプチドを合成する方法をご紹介します。サンプル peptoid は、n-(2-アミノエチル) グリシン (ナエ) N 末端と同様に n-(2-methyloxyethyl) グリシン (Nme) と n-(2-フェニルエチル) グリシン (Npe) を交互に構成される nonamer です。Peptoid のシーケンス式は Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2Ac がアセチル基であります。合成は、市販の固相反応容器で行われます。スケート リンクのアミド樹脂は C 末端にアミド基をもつ peptoid を生成する固体のサポートとして使用されます。結果の peptoid 製品は、エレクトロ スプレー イオン化ソースに結合トリプル四重極質量分析計を用いたシーケンス解析を受けます。MS/MS 測定は、充電 peptoid の解離から生じるフラグメント イオンのスペクトルを生成します。フラグメント イオン質量電荷比 (m/z) の値を基に並べ替えられます。フラグメント イオンの m/z 値は peptoid 断片化のスキームに従って理論的に予測されたフラグメント イオンの名目の固まりと比較されます。分析は、充電 peptoid のフラグメント パターンを生成します。断片化パターン中立的な peptoid のモノマー シーケンスに相関しています。この点で、質量分析は、ペプチドのシーケンス情報を読み出します。

N 末端アセチル化、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2と 9 mer の peptoid の構造を図 1に示します。Peptoid は、固相によるガラスフリットのポリプロピレン製反応容器に手動で合成されました。スケート リンク アミド樹脂 (0.047 ミリ モル、0.56 ミリ モル/g の読み込みに 84 mg) は、化の C 末端と peptoid を生成する固体のサポートとして使用されます。Peptoid チェーンは、モノマーを添加の複数のサイクルによって構築されます。各モノマー添加サイクルには、2 つの反応の手順、bromoacetylation、変位が含まれます。0.8 M BMA ソリューションと 0.8 M DIC ソリューションを追加することによって、bromoacetylation を実現し、反応は 20 分。1.0 M アミン水溶液をアセチル化製品に追加することで変位を達成し、無水酢酸の 92 μ L、DIPEA、43.5 μ、DMF の ...

プロトコルは質量分析法によるオリゴ ペプチドの配列解析に続いての手動合成についてください。

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

この手法の全体的な目的は、オリゴペプトイドを手動で合成する方法と、質量分析技術を用いてそのモノマー配列を解析する方法を示すことです。この方法は、ペプトイドの作り方やモノマー配列の特徴付けなど、ペプトイド分野の重要な質問に初心者が答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、特殊なモノマー残基を持つペプトイドを標準的な分析化学実験室で合成・分析できることです。この方法はオリゴペプトイドに焦点を当てていますが、ペプチドやオリゴヌクレオチドなど他のシステムにも応用可能です。一般的に、この技術に慣れていない人は、最適な質量分析条件を得るのに視覚的な実証がなければ難しいため苦労します。この方法のアイデアは、タンデム質量分析法でペプトイドの構造特徴を特徴づけたいときに思いつきました。まず84ミリグラムのリンクアミド樹脂を計量し、10ミリリットルのポリプロピレン固相反応容器に加えます。次にプランジャーを容器に挿入します。次に、反応容器に2ミリリットルのTMFを加え、圧力キャップで容器を覆います。シェーカー上で、約12度の動き角度で約12度、毎分385回の振動で30分間攪拌します。キャップを外した後、反応容器のプランジャーを押して溶液を廃棄物容器に排出します。DMFに20%ピペリジンを2ミリリットル加え、容器にキャップをします。容器を2分間攪拌した後、溶液を廃棄物容器に排水します。同じ手順を繰り返し、20%Pep DMF溶液を2ミリリットル加えて容器にキャップを閉めます。シェーカーで12分間かき混ぜてから、溶液を廃棄物容器に排水します。樹脂を洗浄した後、ビーカー内で0.8モル臭酸1ミリリットルとDMFに0.8モルDIC1ミリリットルを混ぜてブロモアセチル化反応を行います。混合物を樹脂を含む反応容器に移し、容器にキャップをします。シェーカーの容器を室温で20分間攪拌します。攪拌後、廃棄物容器に溶液を排出します。樹脂を洗浄した後、置換反応を行い、DMFに1ミリリットル/1モル2メトキシエチルアミンを加えます。容器に蓋を閉めた後、室温で60分間攪拌します。その後、溶液を廃棄物容器に排水します。モノマー付加サイクルが完了したら、ビーカーで無水酢酸92マイクロリットル、DIPEA43.5マイクロリットル、DMF2ミリリットルを混ぜてアセチル化カクテルを作ります。樹脂を入れた容器にアセチル化カクテルを加えます。容器に蓋を閉めた後、室温で60分間攪拌します。終わったら、溶液を廃棄物容器に排水します。樹脂をDCMで洗浄した後、ビーカーでTFA3.8ミリリットル、トリイソプロピルシラン100マイクロリットル、HPLC級水100マイクロリットルを混ぜて切り分けカクテルを作ります。すぐに樹脂を入れた容器に切り割りカクテルを加えます。室温で2時間攪拌した後、キャップを外し、ろ液溶液を50ミリリットル

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

迅速な方法は、細胞外マトリックス中の多糖類の構造についての洞察を得るために説明されています。方法はglycosylhydrolasesの特異性と材料の微量を分析できるように質量分析の感度を利用しています。この手法は、組織自体に直接使用するための適応です。...

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

安定同位体の標準と抗ペプチド抗体（SISCAPA）によって、それぞれのタンパク質の代用物としてのペプチドの定量的な測定を提供するために、安定同位体希釈質量分析法（MRM -...

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

基本的な機器と市販の試薬を含む単純で一般的なマニュアルペプトイド合成法は、簡単に多くのラボで合成されるペプトイドを可能にする、概説されています。両親媒性ペプトイドの36merの合成、精製および特徴は、同様に高秩序のナノシートに、その自己組織化として、記述されています。...

高秩序のナノシートにペプトイドポリマーおよびそれらの自己組織化の固相Submonomer合成

ペプチドの第三級アミド（PTAは）が含まれるが、ペプチド、ペプトイドおよびN-メチル化ペプチドに限定されないが、ペプチドミメティックのスーパーファミリーである。ここでのPTAの1ビーズ1化合物ライブラリーを合成するためにスプリット·アンド·プールとサブモノマー戦略の両方を組み合わせた合成法を記載している。...

ペプチド第三級アミドライブラリのスプリット·アンド·プールの合成とキャラクタリゼーション

ここでは、固体粉末中のタンパク質に対する固体アミド水素/重水素交換質量分析(ssHDX-MS)および固体光分解標識質量分析(ssPL-MS)の詳細なプロトコルを紹介します。この手法は、アモルファス固体におけるタンパク質の立体構造と相互作用に関する高分解能情報を提供し、製剤設計に役立つ可能性があります。...

質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

このプロトコルは、酵素(エンドキシラナーゼ)加水分解の前にREを2つのアミノベンザミドでタグ付けし、その後、質量分析(MS)および核磁気共鳴(NMR)を使用して得られたオリゴ糖を分析することにより、ヘテロキシランの還元末端(RE)および内部領域のグリコシル配列の構造特性評価に使用される特定の技術について説明しています。...

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

この記事では、C2'- O-位置で修飾されたRNAのドデカマーの固相合成、精製、およびキャラクタリゼーションに関する詳細な手順を提供します。 UV-visおよび円二色性光度分析を用いて、構造的側面、 すなわち一本鎖または二本鎖を定量化および特徴づける。...

2 &#39;末端を含むRNAのオリゴマーの固相合成のためのプロトコール<em&gt; O</em&gt;チオフェンメチル修飾と環状二色性によるキャラクタリゼーション

情報コード化されたペプトイドオリゴマーの合成と、アミンとアルデヒドを動的な共有反応物の対とルイス酸性希土類として使用して、これらのペプトイドの分子ラダーへの配列指向の自己集合のためのプロトコルが提示される金属トリフラはマルチロール試薬として...

情報を持つペプトイドの合成と、その配列指向動的共有自己集合

このプロトコルは、液体クロマトグラフィー質量分析と高度な特徴抽出およびバイオインフォマティクス分析ソフトウェアを組み合わせたペプチドグリカン組成の詳細な分析をカバーしています。...

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

このプロトコルは、iSCATベースの画像処理と単粒子追跡アプローチを記述し、脂質膜と相互作用する高分子の分子量と拡散挙動の同時調査を可能にします。サンプル調製、質量コントラスト変換、ムービー取得、および後処理に関するステップバイステップの手順が、潜在的な落とし穴を防ぐための指示とともに提供されます。...

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

オリゴヌクレオチド5'-三リン酸は、必須の生物学的経路におけるユビキタス成分であり、バイオテクノロジー用途での使用が増加している。ここでは、標準的な自動合成技術によって調製されたオリゴヌクレオチドから出発して、オリゴヌクレオチド5'-三リン酸の日常的な合成および精製のための技術について述べる。...

オリゴヌクレオチドの化学的三リン酸化

学ぶオリゴペプチドの手動合成と質量分析によるモノマー配列解析の手法。初心者向けの視覚的ガイドとして、標準的分析化学ラボで特殊モノマー残基を持つペプチドの合成と構造同定を支援します。

合成とオリゴペプチドの質量分析

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