微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

この手順の全体的な目標は、3D in vitro ベースメントマトリックス包埋腸オルガノイドを単離し、その後、微小管および中心体を固定して免疫標識することです proteins. 3D in vitro オルガノイドは、細胞生物学および発生生物学における主要な生物学的問題を研究するための理想的なモデルです。しかし、3Dモデルでの内因性タンパク質と構造の局在化は、2D培養よりも複雑です。

重要なことは、固定剤は、抗体の抗原性を維持しながら、繊細な3D構造を維持する必要があるということです。提示された方法には、単離、固定、および3Din vitro腸オルガノイドの免疫標識が含まれます。しかし、固定および免疫標識プロトコルは、ex vivoで単離された組織にも使用できます。

提示されたホルムアルデヒドメタノール固定プロトコルの主な利点は、抗原性を維持しながら3D構造を維持することです。固定後テベル抗体の良好な浸透性とクリアランスを可能にし、微小管、アクチンフィラメント、結合タンパク質、およびナイニンを含むいくつかのセントロソームタンパク質を効果的に標識します。その手順を実演するのは、私の研究室の正式なポスドクであるデボラ・ゴールズピンク博士と、共著者のゾーイ・マシューズ博士です。

腸管陰窩および絨毛の単離後、単離された上皮構造を固定して免疫染色することができる。孤立した地下室は、マトリックスドームに交互に座ることができ、マトリックスドームはオルガノイドを形成します。約5〜7日間のインキュベーション後、オルガノイドが形成されます。

500マイクロリットルのRT-PBSを使用して、地下マトリックスドームを含むウェルをオルガノイドで洗浄します。次に、250マイクロリットルのコールドセル回収溶液を各ウェルに加えます。次に、P1000マイクロピペットを使用して、地下のマトリックスドームをこすり落とし、井戸全体で慎重に上下にピペットで動かして、プラスチックから地下のマトリックスを分解して取り除きます。

マトリックスを分解するために、リカバリーソリューションが冷えていることを確認してください。スクレイピングの際は、オルガノイドが壊れないように、またオルガノイドが無傷のままになるように、P1000マイクロピペットのみを使用してください。上清を1.5ミリリットルの低結合性微量遠心チューブに集めます。

次に、チューブを数回反転させ、顕微鏡で50倍率でオルガノイドが分離され、自由に動いており、凝集していないことを確認します。オルガノイドを1, 000 gおよび室温で5分間遠心分離することによりペレット化します。その後、回収試薬を取り出し、すぐに固定に進みます。

以前に単離したオルガノイドをホルムアルデヒドとメタノールで固定するには、オルガノイドをマイナスの20°Cホルムアルデヒドメタノール固定液に再懸濁します。オルガノイドをマイナス20°Cの冷凍庫で15分間インキュベートし、5分ごとにチューブを反転させます。次に、オルガノイドを1, 000 gで5分間遠心分離してペレット

固定液を取り出し、PBSと1%二次抗体種の血清、またはPBSと0.1%洗剤と1%の血清からなる洗浄液を添加します。前回と同様にサンプルをペレット化した後、洗浄液を取り出し、サンプルを新しい洗浄液に再懸濁します。チューブローテーターを使用して合計1時間細胞を洗浄し、15分ごとに遠心分離してオルガノイドをペレット化し、洗浄液を交換します。

腸管オルガノイドサンプルをブロックするには、10%の二次抗体種の血清をPBSに添加します。オルガノイドを1, 000 gで5分間ペレット化し、上清を取り除きます。各サンプルに1ミリリットルのブロッキング溶液を添加し、異なる抗体でインキュベートします。

次に、サンプルとブロッキング溶液をチューブローテーター上で室温で1時間インキュベートします。次に、一次抗体を10%の血清と0.1%の界面活性剤を含むPBSで希釈します。次に、サンプルを回転させてブロッキング溶液を除去した後、一次抗体溶液を使用してオルガノイドペレットを再懸濁します。

チューブを20 RPMと摂氏4度で一晩回転させて、オルガノイドを懸濁状態に保ちます。翌日、サンプルをチューブローテーターで室温に1時間戻します。サンプルを回転させた後、一次抗体溶液を取り出し、各チューブに1ミリリットルの洗浄液を加え、オルガノイドペレットを再懸濁します。

その後、直ちに遠心分離により溶液を取り出します。1ミリリットルの新鮮な洗浄液を加え、チューブローテーターで20RPMで細胞を2時間混合します。次に、二次抗体をPBSで1%血清と0.1%界面活性剤で希釈します。

次いで、組織をペレット化した後、ペレットを200マイクロリットルの二次抗体溶液に再懸濁する。チューブローテーター上でチューブを室温で1時間インキュベートします。遠心して上清を除去した後、ペレットを洗浄液に再懸濁し、すぐにサンプルを遠心分離してオルガノイドをペレット化します。

次に、上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルの新鮮な洗浄液に再懸濁します。チューブローテーターでサンプルを室温で1.5〜2時間混合し、前述のように20〜30分ごとに洗浄液を交換します。オルガノイドをマウントするには、回転させてすべての洗浄溶液を取り除いた後、ペレットに色あせ防止剤を含む硬化硬化性封入剤を2滴加えます。

P200マイクロピペットの端を切断し、ペレットを封入剤に慎重に再懸濁します。固定染色したオルガノイドを封入剤に再懸濁する際は、気泡が入らないように注意してください。気泡が存在する場合は、気泡を表面に浮かべてから、スライドに移らないようにします。

マイクロピペットを使用して、顕微鏡スライドの中央に沿って一列に並んで、オルガノイドに封入剤を分注します。次に、カバーグラスを慎重に上に置き、気泡が発生しないようにします。スライドガラスをスライドブックに入れ、封入剤をセットするために冷蔵庫で一晩保管してから、共焦点顕微鏡で分析します。

ここに示されているのは、絨毛と陰窩の両方を含む単離された小腸組織の画分2からの画像と、主に陰窩を含む画分3からのサンプルです。これらの画像に見られるように、このビデオで説明されているホルムアルデヒドメタノール固定および免疫標識プロトコルにより、絨毛と陰窩の両方で微小管とアクチンの良好な保存と標識が達成されました。小腸オルガノイドは、このビデオで示されているように、地下マトリックスで3週間以上生成および増殖させた後、単離されました。

オルガノイド絨毛ドメイン内の分化した細胞には、ほとんどの場合、適切に標識された安定した頂端基底微小管が含まれています。EB1は微小管格子に沿っても見られました。ここに示されているのは、嚢胞期と陰窩発達の初期段階のオルガノイドです。

両方のサンプルをホルムアルデヒドメタノールに固定し、微小管とニニンの免疫標識を行いました。これは、頂端の非セントロソーム微小管組織化センターでの良好な微小管の保存と標識を示しています。一度習得すると、このテクニックは複数のサンプルで2日間にわたって実行できます。この手順を試みる際には、オルガノイドを採取する際にウェルを慎重に削り取ることが大切で、オルガノイドの3D構造を乱さないようにすることが重要です。

また、染色手順全体でオルガノイドが失われないように、溶液を追加したり取り外したりする際には注意してください。このビデオを見れば、単離されたオルガノイドや腸管陰窩などの他の上皮構造を固定、免疫標識、マウントする方法を十分に理解できるはずです。この手順で固定剤を使用することは非常に危険であることを忘れないでください。

この手順の実施中は、この手順のリスク評価を実施し、適切な封じ込め措置とPPEを常に講じる必要があります。