Name: 微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶ 微小管と中心体タンパク質の免疫蛍光ラベリング法。3D腸オルガノイドとEx Vivo組織の固定・染色プロトコルを最適化し、細胞・発生生物学研究に応用する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、顕微鏡のアドバイスと支援ありがとうポール ・ トーマス。ここに関与するこの仕事は、BBSRC によって支えられた (付与なし。M.M.M. と t. w. BB/J009040/1)。

<ol><li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li>
<li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li>
<li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+centers%3A+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li>
<li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Colorectal+Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li>
<li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042(2015).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
<li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIS1%2C+CLIP-170%27s+key+to+the+dynein%2Fdynactin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li>
<li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li>
<li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

腸組織の分離 小さな腸陰窩と絨毛と体液の分離には、粘膜面、遠心分離、分別 (揺れ) 細胞の接触を緩和する EDTA 溶液処理を公開することが含まれます。提示された腸絨毛/地下室の隔離のプロトコルは、補酵素 aらとホワイト ヘッドらから変更されています。17,18
粘膜面を公開します。 我々 は、この手順の開発で腸管の粘膜表面を公開する方法の数を試しましたが。古典的なアプローチは (ターン内側) を片脚に管では、通常約 100 mm 長い、セグメントは 1 つの端をクリックし、残りのチューブで組織のひだでキャッチ金属の棒を使用してチューブ19に下落しました。マウス組織、角の丸い金属の棒 (直径 2.4 mm) が理想的です。このアプローチには、PBS と EDTA へのアクセスを許可する粘膜の表面を拡大しての利点があります。我々 は当初、このアプローチを使用が、移動距離が短い (約 5 cm) に、管を切断しこれは容易に証明されるようにはさみを解剖と各セクションを開きます。このアプローチは、適切な場合にのみ、いくつかの腸が必要です。多くの動物がするかどうか、デバイスを使用実験で、専用切削オープン チューブ縦、米田らによって記述されました。14はより効率的になります。
絨毛と陰窩筋層からの剥離 最初基になる組織17,18から粘膜を緩める 3 mM PBS と比較的長い潜伏時間最大 60 分の EDTA を使用しました。EDTA のこの集中でわかったインキュベーション時間は 30 分マウス結腸から陰窩を緩めるのに十分です.ただし、小腸クリプト/絨毛隔離のため我々 は効率的な方法であることを証明する短い時間のより集中 EDTA を使用してみました。すべての後の作品は、絨毛やへんとう陰窩に関連する分数を生成する 30 mM EDTA 法を用いて抽出した組織で行われました。陰窩、我々 は通常、修正する前に分数 3-5 をプール、それはタイミングが腸管に沿って位置などの要因の数、マウス、炎症、以前ダイエットの年齢に依存しているので、適切な分数がこれらかどうかを確認することが重要、など同様に、組織は次の効果を発揮する EDTA 処理に動揺するのに必要な時間の長さが異なる条件下で異なる場合があります。結果は絨毛と陰窩または主に絨毛または陰窩 (図 2) の混合物を含む分離組織画分です。クリプト抽出が 30 の管の組織を揺することによって 1 つのステップで達成可能かもしれない大腸に絨毛がない、s。これらの画分は固定および免疫ラベリング処理できます。
地下の行列から腸オルガノイドの分離 地下行列ドームからオルガノイドの分離は、細胞の回復ソリューションを使用して実現できます。低ゲル化地下行列が 2-8 ° c. に温度のニーズによってソリューションの作品注意は動的微小管が保持されないがあります。したがって、動的微小管の免疫標識のように、+ EBs セルなどのヒントは、固定する前に地下の行列からの回復はお勧めしません。しかし、器官毛細細胞における微小管のほとんどが比較的安定している、これらの保存された (図 6)。また、centrosomal と接合部のタンパク質として細胞マーカーの免疫標識のためによく働いた。
固定のプロトコル (新鮮な PFA 製) ホルムアルデヒドはリバーシブルを形成する比較的速効定着剤クロスリンクし、4 %pfa 免疫標識の微小管と γ-チューブリンとファロイジンで染色のアクチン フィラメントの例のためによく働きます。希薄 PFA の高濃度が動作しませんでした、クリプト幹細胞ニッチ内幹細胞マーカー Lgr5 およびパネート細胞マーカー CD24 など免疫標識のためによく働いた 1% など PFA 溶液です。
グルタルアルデヒドの追加を与える微小管と 3.7 %pfa、0.05% グルタルアルデヒド PHEMO バッファー (68 mM パイプ、25 mM HEPES、15 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 3 mM MgCl2)2で 0.5% 洗剤の混合物から成っているいわゆる PHEMO 固定のより良い保全抗原性を損なうことがなく微小管の優れた保護を提供します。それはまたファロイジンで染色のアクチン フィラメントと E-カドヘリン、β-カテニンは、γ-チューブリンの免疫標識のためによく働きます。ただし、3 D ティッシュ、器官毛細文化 PHEMO 固定は矛盾した結果を生成、使用されませんでしたので。
メタノールは、比較的良好な浸透を与える、抗原性を維持するために傾向がある凝集剤の定着剤です。100% メタノール (-20 ° C) の固定いくつかの収縮を紹介し、適度な形態保全と微小管、+ のヒント、および 2 D 細胞培養で ninein を含む多くの centrosomal の抗体のために働きます。ただし、この固定方法を使用する場合、いくつか organoids が崩壊しました。また、全体の陰窩、絨毛、または organoids を介して抗体の浸透は当初、問題が、洗浄ソリューションおよび長期の洗濯に洗剤を 0.1% 添加がより良い結果を達成しました。
ホルムアルデヒド ・ メタノールの組み合わせは、ロジャースらによって以前使用されていた20で免疫ラベル EB1ショウジョウバエ。ホルムアルデヒドの混合物に基づいて固定プロトコルとメタノールしたがって腸組織と 3% ホルムアルデヒドと 97% メタノール-20 ° C に冷やしてがロジャースによって使用された混合物から炭酸ナトリウム 5 mM を省略に基づくオルガノイドのため開発されました。ら。20また、サンプル-20 ° C で冷凍庫で修正されましたこれは特に免疫標識の井戸 + クリップ 170 など、EBs のヒントを働いたが、固定と免疫標識の微小管とアクチン組織と 3 D organoids 内の優れたはまた証明しました。非常に良い構造保全は明らかと抗原性が γ-チューブリンなど ninein、centrosomal 蛋白質と同様、いくつかの細胞骨格と関連付けられているタンパク質の維持されたメタノールより一貫して働いた ninein のラベルが固定。

政井上皮の形成は開発における基本的なプロセスを微小管と centrosomal 蛋白質の劇的な再構成が含まれます。放射状の微小管配列整理センター位置 centrosomal 微小管から発せられる (脂質) は多くの動物細胞で顕著で、比較的フラット電池に適して。対照的に、腸のような円柱状の上皮細胞より良い形状とこれらの細胞の特別な機能をサポートしている非ラジアル transcellular 微小管配列を組み立てます。Transcellular 微小管1,2のアンカレッジの責任となる頂点とを形成し、根尖部の非 centrosomal MTOCs (n MTOCs) へ移動体による微小管のこの劇的な再編を実現します。,3,4,5。
上皮細胞の分化と関連する微小管再構成の私達の知識の多くは、生体内で組織アーキテクチャを表示しない 2 Dの in vitro細胞層の調査から来ています。Clevers や同僚6、によって開拓された organoid 文化 3 D培養の開発はように模倣体内アーキテクチャと開発主要な技術の進歩を表します。上皮細胞の分化の階層は腸; で明らか陰窩の下部に幹細胞増殖し、徐々 に、彼らは完全に前に差別になる小さな腸粘膜や大腸の表面にクリプトを移行するを区別するためのセルを増幅未熟なトランジットを生じ7ルーメンに流した。重要なは、これがどこ幹細胞のニッチから細胞増殖形成嚢胞その後下部と嚢胞領域に向かって徐々 に進んで分化細胞とクリプトのような芽を生成する腸 organoids にレプリケートされます。絨毛のような8になります。腸器官毛細のためだけでなく微小管と薬と食品のスクリーニングのための理想的なプラットフォームを提供することと同様に、上皮細胞の分化が、他の多くの蛋白質の中に centrosomal の再編を検討する強力なモデルを表す化合物の潜在的な治療の利点9,10。
Organoids、蛍光付けられた蛋白質のライブ イメージングに適して両方ノック- と編集11,12CRISPR/Cas9 遺伝子を用いたノックアウト オルガノイドを生成できます。しかし、式と勉強する内因性のタンパク質の局在化の確立は重要な特にタグ付きタンパク質の動作を確認します。免疫標識 3 D organoids 地下マトリックスまたはex vivo分離の成長組織は 2 D で培養皿で育った細胞よりも複雑です。固定のプロトコルは (すなわち、結合の抗体のエピトープ) 抗体の抗原性を維持したままオルガノイドの繊細な 3 D 構造を維持する必要があります。たとえば、4% パラホルムアルデヒド (PFA)、定着剤として使用されますが、比較的迅速な演技の定着剤と形態のよい保存を与える、私たちの経験でそれ頻繁抗原性が失われる結果、多くには適していませんcentrosomal 抗体。3 D 構造と組織に浸透する定着剤および抗体の能力を考慮も必要があります。このためには、我々 が変更し、組織分離と 3 Dの in vitro organoids とex vivoの間接免疫標識の開発されたプロトコルが腸組織を分離しました。固定して地下マトリックス内免疫標識の代替として 3 D オルガノイドの隔離のためのプロトコルで、小さい腸陰窩と絨毛と大腸の組織を分離する方法をについて説明します。微小管と、ninein などの centrosomal 蛋白質 (参照も参照8、EB タンパク質やクリップ 170 など微小管プラス端までトラッキング蛋白質 (+ ヒント) 免疫標識の 3 つの代替固定のプロトコルを提案します。 13)。各プロトコルに関連付けられている賛否両論についても述べる。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコS リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td>洗浄および PFA</td></tr><tr><td>細胞回収溶液</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>単離オルガノイド</td></tr><tr><td>ロバインド微量遠心チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>細胞の固着を防ぎます</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA 溶液、pH 8.0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML</td><td>Crypt</td></tr><tr><td>isolation 70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11517532</td><td>絨毛から陰窩を分離</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ</td><td>T8787</td><td>洗剤</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>シグマ</td><td>G6767</td><td>ブロッキング剤</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td><td>シグマ</td><td></td><td>ノンスティック剤として使用</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、PBS</td><td>アルファエー</td><td>ザーJ61899</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>で4%ホルムアルデヒド溶液(36.5&ndash;H2O)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td> を<td>固定剤として使用</td></tr><tr><td>メタノール 99.9% 分析グレード</td><td>Fisher</td><td>M/4000/17</td> を<td>固定剤として使用</td></tr><tr><td>MaxFluor マウス オン マウス 免疫蛍光検出キット</td><td>Maxvision Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>市販の免疫蛍光キット; 非特異的標識を減らす</td></tr><tr><td>ローテーター SB2 または SB3</td><td>スチュアート</td><td></td><td>微量遠心チューブ回転子</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td></td><td></td>ナトリウム<td>抗原賦活化</td></tr><tr><td>ハイドロマウント</td><td>ナショナル・ダイアグノスティック</td>ス <td>HS-106</td><td>マウンタン剤</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン</td>価 <td>シグマ</td><td>D27802</td><td>退色防止剤</td></tr><tr><td>永久 正電荷、洗浄済み、90度 グランドエッジ</td><td>クラリティ</td><td>N/C366</td><td>スライド</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ -厚さ No. 1, 22 x 50 mm</td><td>クラリティ</td><td>NQS13/2250</td><td>カバースリップ</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>356231</td><td>3Dオルガノイド培養用ベースメントマトリックス</td></tr><tr><td>50 mLコニカルチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>組織/オルガノイド処理用</td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>組織/オルガノイド処理用</td></tr><tr><td>1.5 mL LoBindチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>単離されたオルガノイドの30108051</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗E-カドヘリン抗体</td><td>BDバイオサイエンス610181</td><td></td><td>一次抗体 1:500</td></tr><tr><td>ラットモノクローナル抗チューブリン YL1/2抗体</td><td>アブカム</td><td>ab6160</td><td>一次抗体 1:100</td></tr><tr><td>ウサギα-チューブリン抗体</td><td>アブカム</td><td>ab15246</td><td>一次抗体 1:100</td></tr>ウサギ<tr><td>抗β-アクチン抗体</td><td>アブカム</td><td>ab8227</td><td>一次抗体 1:100</td></tr><tr><td>ラット モノクローナル抗 p150接着抗体</td><td>BD Bioscience</td><td>610473/4</td><td>一次抗体 1:100</td></tr><tr><td>ラット モノクローナル EB3KT36抗体</td><td>Abcam</td><td>ab53360</td><td>一次抗体 1:200</td></tr><tr><td>マウス モノクローナル EB1 抗体</td><td>BD Bioscience</td><td>610535</td><td>一次抗体 1:200</td></tr><tr><td>ウサギ 抗 Lgr5 抗体</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>一次抗体 1:100</td></tr><tr><td>Dylight anti-rat 488</td><td>Jackson</td><td>112545167</td><td>seconday 抗体 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-mouse 488</td><td>Jackson</td><td>ST115545166</td><td>seconday antibody 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-rabbit 647</td><td>Jackson</td><td>111605144</td><td>seconday antibody 1:400</td></tr></tbody></table>

微小管と 3 d培養腸 organoids とex vivo腸組織における centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

体内の組織構造や形態形成を模倣する 3 Dの in vitroオルガノイドの出現細胞と発生生物学の主要な生物学的質問を勉強する能力は大きく進歩しました。さらに、遺伝子編集とウイルス遺伝子導入の技術進歩と共にオルガノイド医学研究と疾患の治療のための新薬の開発を進めることを約束します。Organoids 栽培体外地下行列の動作と様々 なタンパク質の機能を研究するため強力なモデル システムを提供して、蛍光付けられた蛋白質のライブ イメージングに適しています。ただし、 ex vivo体内と体外式と内因性のタンパク質の局在を確立する organoids はタグ付きタンパク質の動作を確認することが重要。この目的のために開発し、組織の分離、固定および腸オルガノイド培養 ex vivo腸管組織に微小管、centrosomal、および関連付けられている蛋白質の局在の免疫分類のプロトコルを変更します。また抗体抗原性を維持し、良好な浸透と定着剤および抗体のクリアランスを有効にしながらオルガノイド培養用の 3 D 構造を維持する定着剤の目的であった。寒さへの暴露は、安定した微小管がすべて depolymerizes し、さまざまなプロトコルを変更する場合、これは重要な要因だった。エチレンジアミン酸 (EDTA) 濃度 3 mM から 30 mM に絨毛と小腸の陰窩の効率的な剥離を与えたこと 3 ミリメートルの EDTA はでしたが体液がわかった。開発したホルムアルデヒド ・ メタノール固定プロトコルは、微小管、アクチン、および結合 (EB) 蛋白質の効果的な分類のための抗原性を維持しながら非常に良い構造保全を与えた。メタノールのプロトコルはより一貫して働いていたが、また centrosomal タンパク質 ninein の働いた。さらに、固定と微小管と関連するタンパク質の免疫標識を organoids から分離したまたは地下マトリックス内に残ると達成できることを設立しました。

体内組織から腸管の 3 D 構造の隔離のためのプロトコルを提案して地下行列体外埋め込み organoids、ディテールの異なる固定と、微小管の免疫分類のために最適化されたプロトコルを汚すcentrosomal、および接合部のタンパク質だけでなく細胞マーカー Lgr5 幹細胞タンパク質を含みます。

微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

この手順の全体的な目標は、3D in vitro ベースメントマトリックス包埋腸オルガノイドを単離し、その後、微小管および中心体を固定して免疫標識することです proteins. 3D in vitro オルガノイドは、細胞生物学および発生生物学における主要な生物学的問題を研究するための理想的なモデルです。しかし、3Dモデルでの内因性タンパク質と構造の局在化は、2D培養よりも複雑です。重要なことは、固定剤は、抗体の抗原性を維持しながら、繊細な3D構造を維持する必要があるということです。提示された方法には、単離、固定、および3Din vitro腸オルガノイドの免疫標識が含まれます。しかし、固定および免疫標識プロトコルは、ex vivoで単離された組織にも使用できます。提示されたホルムアルデヒドメタノール固定プロトコルの主な利点は、抗原性を維持しながら3D構造を維持することです。固定後テベル抗体の良好な浸透性とクリアランスを可能にし、微小管、アクチンフィラメント、結合タンパク質、およびナイニンを含むいくつかのセントロソームタンパク質を効果的に標識します。その手順を実演するのは、私の研究室の正式なポスドクであるデボラ・ゴールズピンク博士と、共著者のゾーイ・マシューズ博士です。腸管陰窩および絨毛の単離後、単離された上皮構造を固定して免疫染色することができる。孤立した地下室は、マトリックスドームに交互に座ることができ、マトリックスドームはオルガノイドを形成します。約5〜7日間のインキュベーション後、オルガノイドが形成されます。500マイクロリットルのRT-PBSを使用して、地下マトリックスドームを含むウェルをオルガノイドで洗浄します。次に、250マイクロリットルのコールドセル回収溶液を各ウェルに加えます。次に、P1000マイクロピペットを使用して、地下のマトリックスドームをこすり落とし、井戸全体で慎重に上下にピペットで動かして、プラスチックから地下のマトリックスを分解して取り除きます。マトリックスを分解するために、リカバリーソリューションが冷えていることを確認してください。スクレイピングの際は、オルガノイドが壊れないように、またオルガノイドが無傷のままになるように、P1000マイクロピペットのみを使用してください。上清を1.5ミリリットルの低結合性微量遠心チューブに集めます。次に、チューブを数回反転させ、顕微鏡で50倍率でオルガノイドが分離され、自由に動いており、凝集していないことを確認します。オルガノイドを1, 000 gおよび室温で5分間遠心分離することによりペレット化します。その後、回収試薬を取り出し、すぐに固定に進みます。以前に単離したオルガノイドをホルムアルデヒドとメタノールで固定するには、オルガノイドをマイナスの20°Cホルムアルデヒドメタノール固定液に再懸濁します。オルガノイドをマイナス20°Cの冷凍庫で15分間インキュベートし、5分ごとにチューブを反転させます。次に、オルガノイドを1, 000 gで5分間遠心分離してペレット化します。固定液を取り出し、PBSと1%二次抗体種の血清、またはPBSと0.1%洗剤と1%の血清からなる洗浄液を添加します。前回と同様にサンプルをペレット化した後、洗浄液を取り出し、サンプルを新しい洗浄液に再懸濁します。チューブローテーターを使用して合計1時間細胞を洗浄し、15分ごとに遠心分離してオルガノイドをペレット化し、洗浄液を交換します。腸管オルガノイドサンプルをブロックするには、10%の二次抗体種の血清をPBSに添加します。オルガノイドを1, 000 gで5分間ペレット化し、上清を取り除きます。各サンプルに1ミリリットルのブロッキング溶液を添加し、異なる抗体でインキュベートします。次に、サンプルとブロッキング溶液をチューブローテーター上で室温で1時間インキュベートします。次に、一次抗体を10%の血清と0.1%の界面活性剤を含むPBSで希釈します。次に、サンプルを回転させてブロッキング溶液を除去した後、一次抗体溶液を使用してオルガノイドペレットを再懸濁します。チューブを20 RPMと摂氏4度で一晩回転させて、オルガノイドを懸濁状態に保ちます。翌日、サンプルをチューブローテーターで室温に1時間戻します。サンプルを回転させた後、一次抗体溶液を取り出し、各チューブに1ミリリットルの洗浄液を加え、オルガノイドペレットを再懸濁します。その後、直ちに遠心分離により溶液を取り出します。1ミリリットルの新鮮な洗浄液を加え、チューブローテーターで20RPMで細胞を2時間混合します。次に、二次抗体をPBSで1%血清と0.1%界面活性剤で希釈します。次いで、組織をペレット化した後、ペレットを200マイクロリットルの二次抗体溶液に再懸濁する。チューブローテーター上でチューブを室温で1時間インキュベートします。遠心して上清を除去した後、ペレットを洗浄液に再懸濁し、すぐにサンプルを遠心分離してオルガノイドをペレット化します。次に、上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルの新鮮な洗浄液に再懸濁します。チューブローテーターでサンプルを室温で1.5〜2時間混合し、前述のように20〜30分ごとに洗浄液を交換します。オルガノイドをマウントするには、回転させてすべての洗浄溶液を取り除いた後、ペレットに色あせ防止剤を含む硬化硬化性封入剤を2滴加えます。P200マイクロピペットの端を切断し、ペレットを封入剤に慎重に再懸濁します。固定染色したオルガノイドを封入剤に再懸濁する際は、気泡が入らないように注意してください。気泡が存在する場合は、気泡を表面に浮かべてから、スライドに移らないようにします。マイクロピペットを使用して、顕微鏡スライドの中央に沿って一列に並んで、オルガノイドに封入剤を分注します。次に、カバーグラスを慎重に上に置き、気泡が発生しないようにします。スライドガラスをスライドブックに入れ、封入剤をセットするために冷蔵庫で一晩保管してから、共焦点顕微鏡で分析します。ここに示されているのは、絨毛と陰窩の両方を含む単離された小腸組織の画分2からの画像と、主に陰窩を含む画分3からのサンプルです。これらの画像に見られるように、このビデオで説明されているホルムアルデヒドメタノール固定および免疫標識プロトコルにより、絨毛と陰窩の両方で微小管とアクチンの良好な保存と標識が達成されました。小腸オルガノイドは、このビデオで示されているように、地下マトリックスで3週間以上生成および増殖させた後、単離されました。オルガノイド絨毛ドメイン内の分化した細胞には、ほとんどの場合、適切に標識された安定した頂端基底微小管が含まれています。EB1は微小管格子に沿っても見られました。ここに示されているのは、嚢胞期と陰窩発達の初期段階のオルガノイドです。両方のサンプルをホルムアルデヒドメタノールに固定し、微小管とニニンの免疫標識を行いました。これは、頂端の非セントロソーム微小管組織化センターでの良好な微小管の保存と標識を示しています。一度習得すると、このテクニックは複数のサンプルで2日間にわたって実行できます。この手順を試みる際には、オルガノイドを採取する際にウェルを慎重に削り取ることが大切で、オルガノイドの3D構造を乱さないようにすることが重要です。また、染色手順全体でオルガノイドが失われないように、溶液を追加したり取り外したりする際には注意してください。このビデオを見れば、単離されたオルガノイドや腸管陰窩などの他の上皮構造を固定、免疫標識、マウントする方法を十分に理解できるはずです。この手順で固定剤を使用することは非常に危険であることを忘れないでください。この手順の実施中は、この手順のリスク評価を実施し、適切な封じ込め措置とPPEを常に講じる必要があります。

immuno-fluorescent-labeling-microtubules-centrosomal-proteins-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、無傷の前立腺がんオルガノイドの免疫蛍光染色の技術と、ホールマウント共焦点顕微鏡によるそれらのイメージングについて説明しています。この手法は、基底細胞および管腔前立腺上皮細胞のex...

ホールマウント免疫蛍光イメージング:インタクトオルガノイドを評価するための固定および染色技術

このビデオは、自由浮遊マウス空腸切片の腸房細胞を可視化するための免疫蛍光法を示しています。腸絨毛内では、管腔先端に緑色の蛍光が広がり、赤い細根の塊が広がっていることは、房状細胞の存在を示しています。...

空腸凍結切片における房状細胞の可視化のための免疫蛍光法

改良されたイメージング技術により、発生中の臓器の3次元イメージングが可能になりました。ここでは、マウス胎児の腸で発生中の絨毛をライブイメージングできる全臓器培養システムについて説明します。...

マウス胎児腸全体培養システム生体外シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

腸内神経系(ENS)は、腸壁に位置するニューロンとグリアのネットワークで、腸の反射を制御します。このプロトコルは、Ca2+イメージングを使用してENSのライブ調製物中の腸管ニューロンおよびグリアの活動を記録する方法を説明しています。...

腸神経系のその場のCa 2+イメージングに

透明な線虫の腸、「体内組織商工会議所「多細胞 tubulogenesis の中に apicobasal の膜と内腔の生合成単一セルおよび細胞内レベルでの勉強のためとして使用できます。このプロトコルでは、分子レベルでこれらのプロセスを分析するミクロ アプローチ、機能喪失遺伝的/RNAi...

細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

このプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いたヒトの腸オルガノイドのリアルタイム次の薬理学的治療における上皮バリア透過性の測定について説明し、細胞顕微鏡検査をライブします。...

人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

久我らはリン酸化状態アクチン結合タンパク質 girdin チロシン 1798 (pY1798) のリン酸化などに対する特異抗体できる房細胞 (TCs) をラベルに使用することを発見しました。このプロトコルは、pY1798 抗体を用いた浮遊空腸凍結切片の免疫蛍光染色を使用して Tc...

フローティング マウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

逆紡糸円盤共焦点顕微鏡によるマウス小腸のインビタルイメージングを用いてGFP標識γΔ...

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

ここでは、細胞の超微細構造に関連する希少タンパク質の局在を調査するためのツールとして、内因性蛍光標識に基づく最適化されたオンセクション相関光電子顕微鏡法のプロトコルを紹介します。このアプローチの威力は、バフィロマイシン処理を行わない飢餓細胞における内因性LC3の超微細構造局在によって実証されています。...

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

ここでは、基本的な3次元(3D)腸細胞株モデルシステムの構築と、固定された腸当等物の光学顕微鏡的評価のためのパラフィン包埋プロトコルについて説明します。選択したタンパク質を染色することで、1回の実験で複数の視覚的パラメータを解析し、前臨床薬物スクリーニング研究に活用することができます。...

免疫成分を用いた基本的な3次元(3D)腸管モデルシステム

低コヒーレンスホロトモグラフィーを使用したオルガノイドの高解像度、ラベルフリー、3次元イメージングのための段階的なプロトコルを提示します。このプロトコルは、オルガノイド培養の調製、画像取得、および計算画像解析を詳細に説明し、生きたオルガノイドの構造ダイナミクスと薬物応答のリアルタイムの視覚化を可能にします。...

低コヒーレンスホロトモグラフィーによる腸管オルガノイドのラベルフリー、高解像度3Dイメージングおよび機械学習解析

学ぶ 微小管と中心体タンパク質の免疫蛍光ラベリング法。3D腸オルガノイドとEx Vivo組織の固定・染色プロトコルを最適化し、細胞・発生生物学研究に応用する。

微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

さらに動画を探す