Name: ポスト交配精液女性の生殖器官とマウスの精液の液状化測定からのコレクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学ぶマウスの交配後精液採取法と液状化時間測定法。女性生殖道からのサンプル採取と精子遊走性評価技術を確立し、生殖生物学研究への応用可能性を示す。

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この作品は、WW に獣医の大学 (WSU) スタートアップ資金によってサポートされます。著者は、この原稿の批判的読解のシエラ ・ オルセン (WSU) をありがとうございます。

すべての動物と本研究で使用されるプロシージャは、ワシントン州立大学 (WSU) 動物のケアおよび使用委員会のガイドラインによると、動物のプロトコルの WSU 承認 #4702 と #4735 に準拠して処理されました。
1. マウス
<ol><li>
標準 c57bl/6 j 大人男性マウスまたは興味の他の系統を使用します。温度・湿度制御環境、食糧および水の自由アクセスの下で動物を維持します。
	<ol>
<li>生後 8 週間から生後 10 ヶ月に至るまで男性のブリーダーを使用します。実験では実績のあるブリーダーのみを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
上皮細胞10 ( Esr1遺伝子によってエンコードされた) の生殖管エストロゲン受容体 α の組織選択削除と成熟雌マウスを使用 (Wnt7aCre/+;Esr1f/f、ノックアウトまたは"KO"と呼ばれる) と本研究で同腹子 (Esr1f、「ctrl キー」と呼ばれる) を制御します。
	<ol>
<li>8 週齢の雌を使用します。女性の年齢は興味の実験によって異なります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>朝 8:00 h の発情周期の段階を決定します。周期の発情期女性のみを使用します。膣スミアと細胞学的分析の詳細な方法は、以前に発行された手順11を参照してください。</li>
</ol>2. 交尾、交尾のプラグを評価します。
<ol><li>発情 (16:00 h) の日、オスのケージにメスを家します。</li>
	<li>次の朝 (8:00 h)、雄マウスから女性を区切ります。</li>
	<li>以前に発行された方法12の適応を使用して、膣または交尾プラグの存在有無を交配の指標としてアクセスします。</li>
	<li>後肢を簡単に持ち上げることの尾の根元から雌マウスを保持します。</li>
	<li>つまようじを使用して膣口でオフホワイト精液 coagulum の存在にみられる交尾栓を見つけます。みられる交尾栓が存在する場合、つまようじは膣に挿入することができません。</li>
</ol>3. 組織の採取前に、の準備
<ol><li>リーボビッツの L-15 メディア、1% 牛胎児血清を添加した 10 mL を準備 (と呼ばれる L15 メディア + 1 %fbs) 15 mL チューブに。実験で 15 分間 37 ° C でメディアを孵化させなさい。</li>
	<li>組織と下流のアプリケーションのための精子の生存率を維持するために予め温めておいた L15 メディア + 1% の分注 2 mL FB 2 mL 遠心機の管組織コレクション。</li>
	<li>37 ° c. に実体顕微鏡のステージをウォーム アップします。熱ブロックを 37 ° C に設定し、空の 1.5 mL 遠心チューブをブロックに配置します。</li>
	<li>下流のアプリケーションでは、精子の運動性のイメージングを必要とする場合暖かい 37 ° c. にスライド ガラス</li>
</ol>4. 組織の採取
<ol><li>組織コレクション領域に予め温めておいた L15 メディア + 1 %fbs 因数をもたらします。</li>
	<li>女性を安楽死させる (~ 08:30 h) 頚部転位続いて二酸化炭素の窒息を使用します。 注: これは約 8 時間、交尾後深夜に交配が行われると仮定すると。</li>
	<li>腹部領域を公開する仰臥位に動物を配置します。</li>
	<li>手足をハインドに近い腹部に 70% アルコールをスプレーします。</li>
	<li>解剖はさみを使用して、下腹部の皮膚に小さなカット (~ 1 cm) を行います。</li>
	<li>利き手を使って、尾 (および必要に応じて手足をハインド) を引く一方、非利き手は、腹部の筋肉を公開する (頭) に向かって逆方向に皮膚を引っ張る。このメソッドを使用して、内臓器官への汚染の髪の量を最小限に抑える。</li>
	<li>腹部の筋肉を内臓器官を公開する、膣に隣接する腹部の基部に V 形にカットします。</li>
	<li>腸や腹部の脂肪を生殖器官を公開する側に移動します。</li>
	<li>膀胱と膣の領域の上に他の組織を切り落とします。</li>
	<li>膣の組織へのアクセスを得るために離れて恥骨をカットします。</li>
	<li>膣口に膣組織を持ち上げて、膣管を直腸の組織から分離するはさみを使用しています。</li>
	<li>春のはさみを使って子宮の両側から腸間膜の脂肪を慎重に切り落とします。 注意: 子宮内精液と非常に壊れやすいです。子宮をパンクしないように、または他の精液は失われます。</li>
	<li>下部生殖管を持ち上げ、両側の卵巣の脂肪パッドをカットします。</li>
	<li>予め温めておいたリーボビッツの L-15 メディア + 1% のチューブに生殖器全体を移す政府短期証券。</li>
</ol>5. 子宮コンテンツ コレクションから精液液状化 (粘度) の測定
<ol><li>個人差の加熱ステージ上 35 mm 滅菌培養皿に組織に満ちて 3.5 mL 転送予め加温 L-15 メディア + 1 %fbs 血と他の汚染物質の組織をきれいにします。 注意: 洗濯中には、脂肪、子宮ではなくによって組織をつかみます。精液を期待するこの時点で、子宮の中そのままにします。</li>
	<li>研究室のワイプを使用して余分なメディアの組織をしみ。</li>
	<li>事前に加熱された遠心チューブに卵巣の両端を配置しながら膣の端に組織を保持します。膣の端を押しながら遠心チューブに落ちる子宮角をできるように子宮の下部の子宮角をカットします。</li>
	<li>精液子宮角からチューブへの流れ。そっと膣に最後に、残った精液を追放するのに卵巣から子宮角を圧迫するのに歯の鉗子を使用します。</li>
	<li>バイオハザード バッグで組織を破棄し、焼却します。</li>
	<li>簡単にスピン ・ ダウン、minicentrifuge の精液 (1 ~ 2 秒)。</li>
	<li>チューブを加熱ステージと平行に置く - 精液のうち流出は致しません。</li>
	<li>準備ができてのタイマーを持っている、'カウント' に設定。</li>
	<li>(管の壁に平行) 180 ° の角度で精液サンプルに 25 μ L キャピラリー チューブを挿入します。これは、異なる角度でキャピラリー チューブを保持してから調査員間のばらつきを最小限に抑えることです。</li>
	<li>キャピラリー チューブを作るとすぐに、タイマーを押すと精液の接触。</li>
	<li>精液 25 μ L ラインに到達するためにかかる時間 (秒) を記録します。</li>
	<li>測定が終了したら、すぐに精液に精子の運動のビデオ イメージングなど、更なる機能解析用乾熱ブロックを格納筒を置きます。</li>
	<li>10% の漂白剤溶液中 20 分間でチューブを浸すことによって精液を含むキャピラリー チューブを消毒し、シャープス コンテナーのキャピラリー チューブを破棄します。</li>
</ol>6 精子の運動のビデオ画像
<ol><li>顕微鏡とビデオ イメージング ソフトウェアを入れます。</li>
	<li>予め温めておいたガラス スライド上に残りの精液の 20 μ L のピペット ガラス スライドが加熱ステージに配置されます。</li>
	<li>ガラス基板とカバーします。</li>
	<li>顕微鏡のスライド coverslip 側を置きます。</li>
	<li>20 X 対物レンズを使用すると、興味の領域を見つけます。</li>
	<li>ビデオ画像の 100 倍対物レンズに変更します。</li>
	<li>30 の 12 フレーム/秒 (fps) でビデオを記録 s。</li>
	<li>ランダムに動物あたりの少なくとも 3 つのエリアで動画を記録します。</li>
	<li>イメージングを実行すぐに精子の運動性および生存率を維持するためにスライドを光の露出を最小限に抑える。 注: このイメージの作成手順は、2-3 分以内されるべきであります。</li>
	<li>前述8として ImageJ ソフトウェアを用いたデータ解析を実行します。</li>
</ol>

<ol><li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li>
<li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li>
<li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+semenogelin%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li>
<li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semenogelin%2C+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li>
<li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer%3A+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li>
<li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li>
<li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility%2C+capillary+tube+test%2C+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li>
<li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).</li>
<li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+semen+hyperviscosity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li>
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<li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+vaginal+lavage%2C+crystal+violet+staining%2C+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389(2012).</li>
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<li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li>
<li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

前者は、精液と.女性の生殖器官から分泌の生理学的な相互作用を説明することが、精液分析培養上の利点を提供できるマウス子宮から精液を収集本論文で示した技術は、精液性状と同様に精子の生存率と理想的な生理的条件での運動性を決定する研究者を許可します。また、子宮から精液を使用して実行できる各種の下流解析があります、たとえば、精子は子宮と精子を入力実際精子数も運動アッセイの視覚化されるを決定する数えることができます。受精能力精液を集めるための理想的な時間ポイントは1を交尾後 1 ~ 2 時間内ではずです。
前述のように下流のアプリケーションに加えて調査官は評価精子輸送に及ぼす阻害剤/化合物金利の精液の液状化 (または精液の粘度) など、道内、精子精子数のプロセス運動、または女性の生殖管の異なる領域に精子移行。化合物は、8を勘合させる前に女性の生殖器官に適用できます。後.を交配精液サンプルからのこれらの阻害剤/化合物の影響の評価、これらのメソッドは...

女性の生殖器官は、上部と下部の管で構成されます。上部の生殖器では、卵管、子宮、コルポを含まれています。下部生殖管には、子宮頸膣部と膣が含まれています。ヒトでは、射精された精液は膣、子宮頸膣部1に隣接しての前方の壁に堆積されています。ただし、マウスでは、精液が子宮に流さ交配2分以内。
精液には、はめられる精子を引き起こしている射精の秒以内に固化し、3を固定化ゲル種子にはが含まれています。液状化は、ゲル状から水様の一貫性に精液を変更する、固定化した精子を解放します。このプロセスは、精子の運動性および哺乳動物の生殖に不可欠です。精液液状化現象の知識ほとんど、精液になる培養皿で液状化したところの in vitro研究に基づいています。ヒトでは、前立腺特異抗原 PSA (として知られているカリクレイン関連ペプチダーゼ 3 または KLK3) の酵素活性は semenogelins (ゲル化蛋白質精液に存在)4 の加水分解による液状化の主な要因、5,6。Semenogelins の劣化精子の移動性を高める、精液 coagulum から精子を解放します。精子、卵を受精させる卵管に向かって泳ぐを解放しました。液状化 (または精液の粘度) テストは男性の豊饒7を評価するために不妊治療クリニックに精液の分析の標準的な初期上映の一つ。
最近発行された記事は、不妊欠陥8を引き起こす可能性がその後液状化の欠乏を説明するために雌マウスの生殖管の後交配から収集された精嚢液の分析が使えることを示しています。欠陥のある液状精液過粘稠度などは、不妊症の男性で9、通常の液状化は哺乳類の生殖に不可欠なないことを示唆しての 11.8 32.3% に貢献します。ただし、研究と液状化欠陥の治療は男性7排他的に焦点を当てています。女性の生殖器官が精液液状化で役割を果たしている可能性は検討されていません。したがって、精液採取と液化反応時間測定法、液状化が関心のモデル有機体の不妊の原因の一つかもしれないかどうかを決定するための新しい診断ツール研究者を提供します。

<table><tbody><tr><td>つまようじ</td><td>ダイヤモンド</td><td>750-フラット</td><td>オートクレーブ滅菌、鈍いつまようじを使用してください。ポイントエンド</td></tr>解<tr><td>剖ハサミ</td>は使用しないでください <td>フィッシャー</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>春ハサミ</td><td>ロボズ</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>細かい鉗子</td><td>ロボズ</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&mu;Lガラス毛細管</td><td>VWR53432-761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リーボビッツ's L-15 media</td><td>Life Technologies 11415064</td><td></td><td>1% FBS Supplement with 1% FBS</td></tr><tr><td>Fetal Uvine Serum (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>2mL 微量遠心チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>デジタル ドライブ ブロック ヒーター</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>微量遠心チューブの温め用精液採取の前に</td></tr><tr><td>ミニ遠心分離</td>機 <td>コーニング</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培養皿</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ポリプロピレン製遠心分離管</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>プレシジョン</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>加熱ステージ実体顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>MZ10F</td><td>前に組織を暖かく保つために精液採取</td></tr><tr><td>明視野顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>DMi8</td><td>オプション。精子の運動性のビデオイメージング用</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>ライカマイクロシステム</td>ズ <td>DMC2900</td><td>オプション精子の運動性のビデオイメージング用</td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>フィッシャー</td><td>12-552-3</td><td>オプション。精子の運動性のビデオイメージング用</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>オプション。精子の運動性のビデオイメージングのために</td></tr><tr><td>漂白剤</td><td></td><td></td><td>は、dH2Oで10%の濃度に希釈します</td></tr></tbody></table>

ポスト交配精液女性の生殖器官とマウスの精液の液状化測定からのコレクション

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

マウス子宮内射精精液を堆積します。射精後精液がゲル状から一貫性を変更水、プロセスという液状化。本研究ではマウス モデルにおける女性の生殖管から射精後の精液を収集する方法を紹介します。発情期の雌マウスを最初、大人は一晩男性の檻の中で収容されました。次の朝、交尾は、膣の開口部にみられる交尾栓の存在によって確認されました。交尾のプラグとメスのマウスを安楽死させ、(膣、子宮、卵管、卵巣)、全体として各生殖器を集めた精液を格納するクローズド システムを確保します。生殖器官は 1.5 mL 遠心チューブに置かれた、膣管に精液を解放する切断されました。分析のための最大の精液量を確保するため、歯の鉗子を用いた膣に終わり残り精液を追放する卵巣端から子宮角を圧迫します。全体の生殖器は、破棄されます。精液を含むチューブは簡単にスピンダウンだった。25 μ L キャピラリー ピペットは、180 ° の角度 (管壁に平行) で管に置かれました。25 μ L ラインにキャピラリー チューブを埋めるために使用時間数を記録しました。実績のある男性ブリーダーから精液は、通常 25 μ L キャピラリー チューブに合わせて約 60-180 秒をかかります。この精液コレクション手法は、精子のイメージングと運動解析など他の下流のアプリケーションで使用できます。

精液は、肥沃な CTRL 男性と交尾後 ctrl キーと KO の女性約 8 h から採取しました。液状化 (または精液の粘度) は、精液で 25 μ L キャピラリー チューブを入力するのにかかる時間によって定量化されます。CTRL 子宮から精液が 2.06 ± 0.12 min を要しました (mean±S.E.M, n = 5) キャピラリー チューブ (図 1) を記入します。ただし、KO 子宮から収集した精液は 60 分より長くかかった (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) 実験時間の。これらのデータは、精液は液化より大きく、KO 子宮に ctrl キーで粘性が低く比較をお勧めします。
女性の生殖器官から精液を収集のダウン ストリーム アプリケーションの 1 つを示すためには、ビデオ画像を用いた精子の運動性を評価しました。図 2 aのスナップショットで表される顕微鏡のフィールド内で自由に泳ぎの精...

精液液状精液のゲルから解放される精子に必要です。この研究は、女性の生殖器官の後膣から精液を収集し、精液液状化時間を測定するための手順を提供します。

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

この研究の目標は、雌の生殖管から交配後の精液を収集する方法と、マウスの精液の液化を測定する方法を決定することです。この研究で使用された動物は、ワシントン州立大学の動物管理および使用委員会のガイドラインに従って、WSUが承認した動物プロトコル4702および4735に準拠して取り扱われました。ヒトでは、射精した精液は、外頸部に隣接する膣の前壁に沈着します。しかし、マウスでは、精液は交配後数分以内に子宮に流されます。精液には精液ゲルが含まれており、射精後数秒で固化し、精子が固定されます。液化プロセスは、精液をゲル状から水っぽい粘稠度に変化させます。このプロセスは、精子の運動性と哺乳類の繁殖に不可欠です。前立腺特異抗原(PSA)の酵素活性は、精液中に存在する精液ゲルまたはゲル形成タンパク質の加水分解による液化の主な要因です。ゲル形成タンパク質の分解は、精子を精巣から解放し、精子の移動性を高め、精子が上部の女性の生殖管に向かって泳いで卵管内の卵子を受精させます。女性の生殖管から精液を採取する方法と、この研究に存在する液状化時間の測定は、研究者に新しい診断ツールを提供します 液状化が不妊の原因の1つである可能性があるかどうかを判断するための 対象生物の生物。次に、マウスを交配させ、膣栓を決定する手順です。標準的なC57BL/6成体雄マウスまたは他の関心のある系統を使用することができます。周期の発情期の女性のみを使用しました。膣塗抹標本および細胞学的分析の詳細な方法については、以前に公開された手順を参照してください。午後4時発情の日、女性は男性のケージに収容されました。翌朝8時になると、メスはオスのケージから引き離されます。滅菌済みの平らなつまようじを使用して、膣栓または交尾栓の沈着の有無を、以前に発表された方法から適応された手順を使用して交配の兆候として評価しました。次に、組織採取前の準備の手順です。10ミリリットルのLeibovitzのL-15培地に1%ウシ胎児血清またはL-15培地と1%FBSを添加した15ミリリットルのチューブを準備します。メディアを摂氏37度で15分間温めます。下流のアプリケーションのために組織と精子の生存率を維持するために、組織収集用の2ミリリットルのチューブに2ミリリットルの培地を分注します。実体顕微鏡のステージを摂氏37度に温めます。ヒートブロックを摂氏37度に設定します。空のチューブをヒートブロックに入れます。また、ダウンストリームアプリケーションで精子の運動性のイメージングが必要な場合は、スライドガラスを摂氏37度に温めます。次に、組織採取の手順です。ティッシュコレクションに使用するツールは次のとおりです。プラグを確認した直後に、二酸化炭素による窒息とそれに続く子宮頸部脱臼を使用して、女性を安楽死させます。動物を仰臥位にして腹部を露出させます。腹部に70%エタノールをスプレーします。下腹部の皮膚に約1センチの小さな切り込みを入れます。尻尾と皮膚を反対方向に引っ張って腹筋を露出させます。腹部の付け根で腹筋をV字型に切ります。腸と腹部の脂肪を横に移動して、生殖管を露出させます。膣領域の上の膀胱と他の組織を切り取ります。恥骨結合を切断して、膣組織にアクセスできるようにします。恥骨結合部をチューブ鉗子で引っ張り、膣管を露出させます。膣口で膣組織を持ち上げ、はさみを使用して膣管を下の直腸組織から分離します。スプリングハサミを使用して、子宮の両側から腸間膜脂肪を慎重にトリミングします。子宮は精液が入った状態で非常に壊れやすいです。したがって、研究者は子宮に穴を開けないように注意する必要があります、さもなければ精液が失われます。卵巣の両側から卵巣脂肪パッドを切り取ります。生殖管全体を予め温めた培地のチューブに移します。次に、精液の液化の測定方法です。こちらが精液採取の道具です。3ミリリットルの温かいメディアを3.5センチメートルの皿に移します。ティッシュを皿に移します。脂肪パッドをつかんでティッシュを数回洗います。この時点では、精液はまだ子宮内に無傷で残っているはずです。キムワイプでティッシュを拭き取り、余分なメディアを取り除きます。ティッシュを膣の端に保持し、卵巣の端を空のチューブの内側に持ち上げて、事前に温めたチューブにティッシュを入れます。膣と子宮の間の両方の子宮角を切ります。精液を子宮角からチューブに流し込みます。歯のない鉗子を使用して、子宮角に残った精液を優しく絞って排出します。精液を1〜2秒短く回転させます。チューブを加熱ステージと平行に置きます。25マイクロリットルの毛細管を精液サンプルに180度の角度で挿入します。これは、キャピラリーチューブを異なる角度で保持することによる各研究者間のばらつきを最小限に抑えるためです。精液が25マイクロリットルラインに達するのにかかる時間を記録します。液化時間は、25マイクロリットルの毛細管に精液を充填するのにかかる時間によって定量化されます。制御子宮から採取した精液は、毛細管に充填するのに約2分かかりました。しかし、ノックアウト子宮から採取した精液は、実験時間の60分以上を要した。これらのデータは、精液がノックアウト子宮と比較して対照群で有意に液化していることを示唆しています。ここでは、精子の運動性のビデオイメージングを使用したダウンストリームアプリケーションの例の1つです。ピペットチップを使用して、スライドガラスをヒーターステージに置いた状態で、残りの精液の25マイクロリットルを予熱したスライドガラスにピペットで移します。スライドをガラスのカバースリップで覆います。スライドカバースリップを下にして、スライドを顕微鏡に移します。20倍の対物レンズを使用して精子を見つけます。その後、ビデオイメージング用に100倍対物レンズに交換します。ビデオを毎秒12フレームで30秒間録画します。制御された子宮から採取された精液は、微視的な視野内で自由に泳ぐ精子を示しています。しかし、ノックアウト子宮から採取された精液は、精子の大部分が最小限の可動性で一緒に集まっていることを示しました。これらの知見は、交配後8時間で雌の生殖管から採取した精液を、さらなる解析に利用できることを示唆している。これらのダウンストリームアプリケーションに加えて、研究者は、精子輸送のさまざまなプロセス、精子の液化などのプロセス、管内の精子数、精子の運動性、または女性の生殖管のさまざまな領域での精子の移動を妨げる阻害剤または関心のある化合物の影響も評価できます。化合物は、交配前に女性の生殖管に適用することができます。次に、これらの阻害剤または化合物の影響を、交配後の精液サンプルから評価できます。この方法は、精子の輸送を阻害する避妊薬の実用性をテストするのに役立ちます。

collection-post-mating-semen-from-female-reproductive-tract

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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