Name: 子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学ぶ子宮内エレクトロポレーションによるマウス大脳皮質のCre-Lox組換え誘導法。特定の遺伝子が神経細胞表現型に必要かを細胞自律的に調べる技術で、発生神経科学の研究に有用です。

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著者らは、ジェームズ ・ マディソン大学生物教室・ ジェームズ ・ マディソン大学光顕微鏡イメージング施設の寛大なサポートをありがとうございます。夫妻ジャスティン ・ w ・ ブラウンとコーリー ・ l ・ クレランド手術材料と空間の寛大な調整のために博士マーク ・ l ・ ガブリエレ若い生後ティッシュの準備、に関する有益な助言を。この研究はだった 4-バージニア州、連邦のバージニア州 (G.S.V.) を推進するための共同パートナーシップとによってバージニア州アカデミーの科学小プロジェクト研究助成金 (G.S.V.) 共同研究助成金によって一部で賄われて。学部研究生奨学金 (K.M.B.) に、ファレル夏研究奨学金 (K.M.B.) をジェームズ ・ マディソン大学第 2 世紀への奨学金 (K.M.B.)、寛大サポート ベティ Jo 愛するバトラー 58年基金によって提供されているジェームズマディソン大学百周年記念奨学金 (C.J.H.) に、ジェームズ ・ マディスン大学ルーシー ロビンソン検索 30年記念奨学金 (Z.L.H.) に、科学と数学教員援助交付金 (G.S.V.) にジェームズ ・ マディソン大学。

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<li>Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ars2+maintains+neural+stem-cell+identity+through+direct+transcriptional+activation+of+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2.</a> Nature. 481, 195-198 (2011).</li>
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<li>Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Multimodal+Analgesia+on+the+Success+of+Mouse+Embryo+Transfer+Surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).</li>
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<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047(2010).</li>
</ol>

著者はある利益相反を開示します。

モザイク脳組織を生成する floxed マウスにおける Cre リコンビナーゼとエレクトロポレーションの子宮内の組み合わせを紹介します。このアプローチの利点は、新しいマウス行が異なる細胞サブタイプが対象とするたびに生成する必要はありません: 興奮性ニューロン、抑制ニューロンまたは時間によってグリア細胞を対象に子宮内でエレクトロポレーションを使用できますエレクトロポレーション15,16,17,18,19,20,21,34のと場所。我々 のアプローチで大脳皮質をターゲットが一貫...

興味の遺伝子の機能を理解するための古典的な実験パラダイムは、遺伝のモザイクを生成します。遺伝子は細胞の表現型に必要なかどうかを決定するには、最も簡単な方法は有機体 (例えばノックアウト) を通して遺伝子の機能の損失を引き起こしています。ただし、遺伝子が特定の細胞型で特に必要なかどうかを決定、生物全体の遺伝子のノックアウトは有効なアプローチではありません。代わりに、メソッドが必要なしの野生型 (すなわち遺伝的摂動) 組織に囲まれている間特定のセルに遺伝子の機能の損失と、-つまり、モザイク組織を作成します。突然変異体の細胞が突然変異体の表現型を示していますが、周囲の野生型細胞は、細胞自律的方法で遺伝子機能。解析モザイク組織、変異細胞が野生型組織に囲まれているは、遺伝子、特にニューロンとグリア細胞が組織の広大な相互接続ネットワークを形成する脳の細胞の自律的機能の理解に最適です。
モザイク脳組織のいくつかのフォームは、遺伝子の細胞の自律的機能を調べるための強力なモデルを提供しています。神経移植1、女性 X-リンクされてモザイク2,3,4に焦点を当てた研究とモザイクに基づいて彼らの結論を描画している内因性の体細胞モザイク5,6脳組織。Cre lox 組換えシステムを介して遺伝子の条件削除は、トランスジェニック マウス線の偉大な可用性を最大限に活用する方法です。このメソッドは、loxP サイト同じ方向 ("floxed") の両方の顔が並ぶそれを残して (エクソン) など遺伝子の必要なシーケンスのいずれかの側で 2 つの loxP サイトを紹介しています。Cre リコンビナーゼ loxP サイト7間のシーケンスを切り取る。Cre を介する組み換えは、セル (「Cre 記者ライン」) のサブセットに蛍光マーカーと一緒に Cre リコンビナーゼを表現する別のマウス線横断 floxed マウスで実現できます。これは、さまざまな興奮性神経細胞やアストロ サイト8などの細胞のサブセットの遺伝子の機能を明らかにする方法で実証されています。Cre 記者行クレエT2 (単一ニューロン誘導 Cre を介したノックアウトまたは滑らかでラベル付け) という薬物誘導する Cre を介した結合を許可するを表すことができます9。ダブル マーカー (MADM)10,11モザイク解析と呼ばれる別の戦略、Cre を介した染色体間組換えホモ接合体変異ヘテロ接合体組織と一緒に作成することができます。これらのアプローチのマウスの新しい行は各候補遺伝子またはテストされる細胞のサブタイプのたびに生成される必要があります。イオントフォレシス12通したり、ウイルスのベクトル (例えばアデノ随伴ウイルス13またはレンチ14細胞サブタイプに固有を運ぶ Cre リコンビナーゼを後天的導入できる代わりに、発起人)。この戦略は、強いと生後のラベルを作成します。まばらと胎生期大脳皮質ニューロンの開発を対象とするには、理想的な戦略は蛍光マーカーで Cre リコンビナーゼのエレクトロポレーション子宮内です。
体内組織モザイク エレクトロポレーション子宮内で生成する Cre lox 再結合を結合することに加えて、その他公開プロトコルから15,16、手順にいくつかの適応を紹介 17,18,19,20,21。繁殖タイミング妊娠した女性の成功を改善するために情報を提供いたします。我々 はまた、大脳皮質組織の神経細胞の疎と明るいラベリングを導入する我々 の 2 つの戦略を概説: Cre リコンビナーゼの蛍光マーカー22single コンストラクト コーディングのレベルを滴定する戦略の 1 つです。別の戦略は、心23,24でこれらのパラメーターを具体的に設計された「超新星」システムを使用することです。さらに、一貫性のあるマイクロインジェクション ピペットと子宮の穿孔手術を簡素化の生産の改善を提供しています。最後に、我々 はさらに汚れるか、または免疫組織化学を樹状突起スパインの樹状突起と軸索のアーバー、分析できる簡易組織の準備で重要な手順を概説します。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6Jマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>#000664</td><td>「1.マウスのセットアップ」(ステップ1.1「野生型マウス」)</td></tr><tr><td>GFP.Cre empty vector</td><td>AddGene</td><td>#20781</td><td>「2.DNAセットアップ」(ステップ2.1「Creリコンビナーゼと蛍光マーカーをコードする単一のDNAコンストラクト」)。GFPです。Cre empty vectorはTyler Jacksからの贈り物でした。</td></tr><tr><td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69138</td><td>「2.DNAセットアップ」(ステップ2.1「超新星」システム)と http://snsupport.webcrow.jp/。pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) は、岩里卓司さんからのプレゼントでした。</td></tr><tr><td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69136</td><td>「2.DNAセットアップ」(ステップ2.1「超新星」システム)と http://snsupport.webcrow.jp/。pK031.TRE-Cre (Supernova) は岩里卓司さんからのプレゼントでした。</td></tr><tr><td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (超新星)</td><td>AddGene</td><td>#85006</td><td>「2.DNAセットアップ」(ステップ2.1「超新星」システム)と http://snsupport.webcrow.jp/。pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) は、岩里卓司さんからのプレゼントでした。</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>#12362</td><td>「2.DNAセットアップ」(ステップ2.3「エンドトキシンフリープラスミド精製キット」)</td></tr><tr><td>トリパンブルーパウダー、バイオ試薬グレード</td><td>Sigma</td><td>T6146-5G</td><td>「2.DNAセットアップ」(ステップ2.5「トリパンブルー」)</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム、ACS、2.5kgVWR</td><td></td><td>BDH9286-2.5KG</td><td>「2.DNA setup-up" (step 2.5 "NaCl")</td></tr><tr><td>塩化カリウム、ACS、500 g</td><td>VWR</td><td>#97061-566</td><td>「2.DNAセットアップ」(ステップ2.5「KCl」)</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム、ReagentPlus、100 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-100G</td><td>「2.DNA setup-up" (step 2.5 "Na2HPO4")</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性、ReagentPlus、100g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td>「2.DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")</td></tr><tr><td>塩酸、ACS試薬、500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>「2.DNA set-up" (step 2.5 "HCl")</td></tr><tr><td>P-97 マイクロピペットプーラー</td><td>サッター器具</td><td>P-97</td><td>「3.ピペットセットアップ」(ステップ3.1「ガラスキャピラリープーラー」)</td></tr><tr><td>3.0mm幅トラフフィラメント</td><td>サッターインストゥルメント</td><td>FT330B</td><td>「3.「ピペットのセットアップ」(ステップ3.1「ガラスキャピラリープーラー」)</td></tr><tr><td>薄肉ガラスキャピラリー、4インチ、1 / 0.75 OD / ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>「3.ピペットのセットアップ」 (ステップ3.1.1「ガラスキャピラリー」)</td></tr><tr><td>単層ソフトテックワイプ、4.5インチ</td> <td>フェニックス</td><td>LW-8148</td><td>「3.ピペットのセットアップ」(ステップ3.2.1「単層タスクワイプ」);他の単層ワイプ(キムワイプなど)も使用できます。</td></tr><tr><td>Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth</td><td>World Precision Instruments</td><td>#14140</td><td>「4.In Utero electroporation" (step 4.1 "Graefe Forceps")</td></tr><tr><td>Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503708-12</td><td>「4.In Utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")</td></tr><tr><td>Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503728-12</td><td>「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.1「ハートマン蚊鉗子」)</td></tr><tr><td>汎用不織布スポンジ、2インチ×2インチ、4層</td><td>Medrepexpress</td><td>#2204-c</td><td>「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.1「不織布ガーゼスポンジ」)</td></tr><tr><td>リング先端鉗子、10cm、ストレート、内径2.2mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503203</td><td>「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.1「リング先端鉗子」)</td></tr><tr><td>パイレックスペトリ皿が完成し、O.D. &times;高さ100 mm&時間;20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160102-12EA</td><td>「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.1「ペトリ皿」)</td></tr><tr><td>フラットタイプインスツルメントトレイ、ステンレス鋼、13-5/8インチ x 9-3/4インチ x 5/8インチ</td> <td>アマゾン</td><td>B007SHGAHA</td><td>「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.1「ステンレス製トレー」)</td></tr><tr><td>プラチナピンセット、5mm</td><td>BTX</td><td>#45-0489</td><td>「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.3および4.16「ピンセット型電極」)</td></tr><tr><td>ECM 830フットペダル</td><td>BTX</td><td>#45-0211</td><td>「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.3および4.17「フットペダル」)</td></tr><tr><td>ECM 830 Generator</td><td>BTX</td><td>#45-0052</td><td>「4.In Utero Electroporation" (step 4.3 "generator")</td></tr><tr><td>Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box</td><td>Harvard Apparatus</td><td>#72-6468</td><td>「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.4および4.6「ノーズコーン」、ステップ4.4「誘導室」)</td></tr><tr><td>眼科用軟膏</td><td>ハンナファーマシューティカルサプライCo</td><td>#0536108691</td><td>「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.7「獣医眼軟膏」)</td></tr><tr><td>Space Gel(AIMS)</td><td>VWR</td><td>#95059-640</td><td>「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.8「過飽和塩溶液を充填した密封パウチ」)</td></tr><tr><td>脱毛ジェルクリーム、センシティブフォーミュラ</td><td>Veet</td><td>#062200809951</td><td>「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.9「脱毛クリーム」)</td></tr><tr><td>10ul ローリテンションチップスターター(960チップ/パック)</td><td>フェニックスリサーチプロダクツ</td><td>TSP-10LKIT</td><td>「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.12「滅菌10&micro;Lマイクロピペットチップ")</td></tr><tr><td>校正済みマイクロキャピラリーピペット用アスピレーターチューブアセンブリ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.15「吸引器チューブアセンブリ」)は</td></tr><tr><td>、編組吸収性縫合糸、4-0、ニードルNFS-2(FS-2)、27インチ</td>MedrepexpressMV-J397<td></td><td></td><td>「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.19「吸収性縫合糸」)</td></tr><tr><td>」リキベットラピッド」ティッシュ接着剤</td><td>Medrepexpress</td><td>VG3</td><td>「4.「子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.20「ティッシュ接着剤」)</td></tr>皮<tr><td>下注射器、ポリプロピレン、ルアーロックチップ、容量1.0mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>「4.In Utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")</td></tr><tr><td>BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192392-100EA</td><td>「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.21 "26G、&frac12;&rdquo;needle")</td></tr><tr><td>ネスレネスティングマテリアル</td><td>Ancare</td><td>NES3600</td><td>「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.24「ネスティング材料」)</td></tr><tr><td>ヒマワリの種、ブラックオイル、滅菌</td><td>バイオサーブ</td><td>S5137</td><td>「4.子宮内エレクトロポレーション」(ステップ4.24「ヒマワリの種」)</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、97%</td><td>アルファAesar</td><td>A11313</td><td>「5.Histology" (step 5.1.1 "PFA")</td></tr><tr><td>エコノミーピンセット #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips</td><td>World Precision Instruments</td><td>#501976</td><td>「5.「組織学」(ステップ5.5「ピンセット」)</td></tr><tr><td>寒天粉末</td><td>Alfa Aesar</td><td>#10752</td><td>「5.組織学」(ステップ5.8.1「寒天」)</td></tr><tr><td>片刃カミソリ刃、#9刃</td>スタン<td>レーツール</td><td>#11-515</td><td>「5.「組織学」(ステップ5.9「片刃カミソリ刃」)</td></tr><tr><td>標本ディスク S D 50mm</td><td>ライカ</td><td>#14046327404</td><td>「5.「組織学」(ステップ5.9「振動するミクロトーム標本ディスク」)</td></tr><tr><td>バッファートレイSアセンブリ</td><td>ライカ</td><td>#1404630132</td><td>「5.「組織学」(ステップ5.10「バッファートレイ」)</td></tr><tr><td>VT1000 S ビブレーターライ</td><td>カ</td><td>#14047235612</td>「<td>5.「組織学」(ステップ5.10「振動ミクロトーム」)</td></tr><tr><td>両刃カミソリ刃ペル</td><td>ソナ</td><td>BP9020</td><td>「5.「組織学」(ステップ5.10「ブレード」)</td></tr><tr><td>ナイフホルダーS</td>ライ<td>カ</td><td>#14046230131</td><td>「5.「組織学」(ステップ5.10「ナイフホルダー」)</td></tr><tr><td>スタジオエレメンツゴールデンタクロンショートハンドルラウンドブラシセット</td><td>アマゾン</td><td>B0089KU6XE</td><td>「5.Histology" (step 5.12.1 "fine tiped paintbrush")</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>#71869-11</td><td>「5.Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml</td><td>Thermofisher</td><td>P36970</td><td>「5.「組織学」(ステップ5.12.3-5.12.4「封入剤」)</td></tr><tr><td>カバーガラス、24×50 mm、No.1</td><td>フェニックス研究製品</td><td>MS1415-10</td><td>「5.Histology" (step 5.12.4 "coverslip")</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>「5.組織学」(ステップ5.13.1「DAPI」)</td></tr><tr><td>固定ステージ正立顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>BX51WI</td><td>「5.「組織学」(ステップ5.15「光学顕微鏡」)</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>TE2000/C2Si</td><td>「5.組織学」(ステップ5.15「共焦点顕微鏡」)</td></tr><tr><td>4倍対物レンズ、NA=0.20</td>ニ<td>コン</td><td>CFIプランアポラムダ4倍</td><td>「5.Histology」(ステップ5.15「低電力対物レンズ」)</td></tr><tr><td>20倍対物レンズ、NA=0.75</td>ニ<td>コン</td><td>CFIプランアポラムダ20倍</td><td>「5.Histology" (step 5.15 "medium-power objective")</td></tr><tr><td>60x 対物レンズ、NA = 1.40</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td><td>「5.組織学」(ステップ5.15「高倍率対物レンズ」)</td></tr></tbody></table>

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における cre lox 組換えを誘導します。

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

遺伝子の細胞自律神経機能の損失を引き起こすことによって明らかになることやニューロンの小さく、まばらな人口の遺伝子の機能を得る。そうニューロンの損失または遺伝子の機能のゲインが遺伝的摂動組織に囲まれているモザイクを生成する必要があります。ここでは、我々 はニューロンの遺伝子の細胞の自律的機能を研究するために使用できるモザイク脳組織を生成するために子宮内でエレクトロポレーションと Cre lox 組換えシステムを組み合わせます。DNA コンストラクト (リポジトリを通じて利用可能)、蛍光ラベルと Cre リコンビナーゼのコーディングが両脇に loxP サイトで子宮を用いたマウス胚の脳における遺伝子を含む皮質ニューロンの開発に導入します。エレクトロポレーション。さらに、子宮内でエレクトロポレーション法の存続性と再現性を向上させる様々 な適応について述べる。このメソッドはまた、ニューロンのスパースまたは密な人口の Cre 介する組み換え価を確立します。ラベル付けされた脳組織の組織学的準備を必要としない (しかしに合わせることができる) の免疫組織化学。使用構造を保証する蛍光ニューロン キャリー Cre リコンビナーゼの遺伝子に分類します。組織学的準備は、アーバーの樹状突起と軸索と樹状突起スパインの共焦点イメージングによるニューロンの形態素解析を許可します。損失または利得関数のスパース モザイク組織で実現するため、このメソッドは、遺伝子製品生体内での細胞の自律的必要性の検討とを許可します。

シングルは、GFP を構築します。Cre は E15.5 で electroporated をされ、P14 の可視化 (材料の一覧を参照してください)。コンストラクトの濃度や注入量、に応じてスパースまたは高密度の結果22,26を取得できます。たとえば、2 mg/mL GFP の 1 μ l 注入。明るい (図 1 a)、および、ローカライズされた層 II/III (図 1 b) をすることができますいくつかのラベル付きセルの希薄な分布で Cre の結果。組織が 100 μ m 厚には、樹状のアーバーのほとんどは (図 1) が保持されます。高倍率 (60 X での樹状突起棘を観察できます。図 1)。同じ濃度で 1.5 μ...

脳における遺伝子の細胞の自律的機能損失を誘導することによって学ぶことができるまたは細胞のまばらな人口の機能を得る。ここでは、関数の vivoの損失を引き起こす floxed の遺伝子を持つ皮質ニューロンの開発のまばらな人口に Cre リコンビナーゼを提供する子宮内エレクトロポレーションについて述べる。

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

この手順の全体的な目標は、子宮内エレクトロポレーションを通じてCre-Lox組換えを誘導することにより、マウス大脳皮質に遺伝的モザイクを生成することです。この遺伝的モザイクの生成方法は、神経生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。例えば、ある遺伝子が特定のニューロン表現型に必要かどうかを細胞自律的に判断するなどです。この技術の主な利点は、効果的なCre-Lox組換えシステムが、子宮内エレクトロポレーションにおいて同等に効果的な遺伝子導入技術と組み合わされることです。この方法は、第2層から第3層の皮質ニューロンを標的とすることに焦点を当てていますが、他の皮質層の深さのニューロンを標的にするために使用できます。脳組織に遺伝子モザイクを作ろうとしたとき、実験動物が出生後も生き残るためにいくつかの問題に直面したため、技術にいくつかの単純化と改良を導入しました。胚性幹細胞注入または核移植用のピペットに典型的な、非常に長いテーパーと非常に細い先端を備えたピペットを準備します。クランプを固定した後、プログラムを引っ張りプロトコルにアクティブにし、ガラスキャピラリーにテーパーを作成します。テーパーの長さが10〜15mmであることを確認してください。次に、ピペットの先端を折るために、50mLのビーカーで1枚重ねの作業を行い、片手でぴんと張ったように伸ばします。もう一方の手で、引っ張ったピペットをテーパー側を下にして、ワイプの中心を垂直に押し、テーパーをきれいに断ち切ります。複合光学顕微鏡で開口部のサイズを確認します。次に、0.4%トリパンブルーとPBSの1 mcLを吸引してピペットを部分的に充填したピペットに校正し、ピペット内の1 mcLの高さに基づいて1 mcLのマーキングでピペットを卒業させます。校正されたピペットを使用して、廃棄する前に他のプルピペットを卒業させます。ピペットをほこりやその他の粒子が入らないようにピペットホルダーに入れます。E-15.5で妊娠中のマウスに深く麻酔をかけた後、誘導チャンバーを静かに傾けてマウスの反応に注意して、立ち直り反射をテストします。立ち直反射がない場合は、マウスを手術準備領域に移し、鼻円錐を通して吸入イソフルランを投与して、麻酔の手術面を維持します。鉗子を使用してペダル反射をテストし、麻酔を確認します。努力して呼吸数を監視し、深く規則的な呼吸と粘膜の色がピンク色で湿っていることを確認します。乾燥から保護するために、目を完全に覆うのに十分な獣医用眼科軟膏を目に塗ります。.腹部の毛皮が溶けるまで、綿棒で腹部に脱毛クリームをマッサージします。次に、腹部の毛皮を拭き取り、残っている残留物と脱毛クリームを70%エタノールと綿棒で慎重に洗い流します。ヨウ素ベースのスクラブ溶液を円を描くように腹部に塗布します。次に、外科用ドレープを使用して手術部位を隔離し、無菌状態を維持します。皮膚に2cmの腹側正中線切開を行った後、腹直筋の正中線を視覚化するためにlinea albaを見つけます。筋肉を引き上げて腹部から離し、無菌技術を使用して2cmの正中線切開を行い、腹腔を露出させます。滅菌済みの10mcLマイクロピペットチップを使用して、鎮痛のためにカルプロフェンを腹腔内に分注します。次に、腹直筋切開部の左端に1つのハルトマン蚊鉗子をクランプします。切開部の左側にあるひっくり返ったペトリ皿に鉗子を置き、切開部の左側を開いたままにします。同様に切開部の右側を固定した後、切開部の周囲にガーゼスポンジを置きます。リミットスクリューが取り付けられていないリング鉗子を使用して、組織を押しつぶしたり傷つけたりすることなく、隣接する2つの胚の間の子宮を引っ張ります。切開部からすべての胚を引き出し始め、ガーゼスポンジの上に置きます。校正したピペットを吸引器チューブアセンブリに接続し、子宮壁を通して調製したDNA溶液を正確に1mcLを各胚の側心室に注入します。親指と人差し指を使って胚を操作し、注射中に胚を子宮壁に優しく押し付けます。側脳室は、胚の背側終脳に2つの暗い斑点として現れます。トリパンブルーが側脳室を満たしているのを観察して、成功した注射を確認します。すべての胚を注入した後、ピンセット型電極の陰極を子宮上、内側皮質と尾側皮質の真上に配置して、視覚野を標的にします。アノードは、胚の頭のすぐ下と前方に配置します。フットペダルを使用して、50ボルトの550ミリ秒のパルスを950ミリ秒間隔で送達します。すべての胚をエレクトロポレーションした後、子宮を見つけたときと同じ向きで腹腔に戻します。生理食塩水を使用して子宮を滑らかにし、胚を子宮内の位置からずらさないように注意しながら、手動で非常に穏やかに子宮を導きます。吸収性縫合糸で腹部の筋肉を閉じます。単純な中断ステッチを使用し、両端を外科医の結び目で結びます。吸収性縫合糸で皮膚層を閉じます。傷口を密封するために少量のティッシュ接着剤を塗布します。結び目にティッシュ接着剤を塗布して、緩めないようにします。マイクロピペットを使用して、吸引可能な創傷の周囲の組織接着剤をすべて取り除きます。組織接着剤が乾いたら、動物をイソフルランから取り出し、雌が温かいケージの中で一人で回復するのを待ちます。マウスが完全に回復し、正常に動作するまで、マウスの監視を続けます。取り除いたら、メスをオスと一緒にケージに戻します。頭蓋骨を平らな面に置き、1-x PBSで湿らせた単層タスクワイプを使用します。ピンセットを使用して、最初に後頭骨を取り除きます。次に、頭頂骨を慎重に取り除き、ピンセットを取り出して脳の表面から離します。皮質の損傷を防ぐために、髄膜を慎重に取り除きます。ピンセットの裏側を頭蓋骨に沿って脳の下に挟み込み、脳神経を切断して脳を切除します。片刃のカミソリの刃を使用して、冠状動脈を吻側からブレグマまで約0.5 mm切断し、別の冠状動脈を目的の組織に対して尾側に約0.5 mm切断します。これで、ティッシュブロックを切片化する準備が整いました。1 mcL に 2 mg/mL の GFP Cre を注入すると、標識細胞の分布がまばらになり、その一部が明るくなることがあります。組織は100ミクロンで切片化されているため、樹状突起のほとんどが維持されています。胎内エレクトロポレーションが胚の15.5日目に行われると、標識は皮質層2と3で行われます。樹状突起棘は高倍率で観察できます。1.5 mcL の 2 mg/mL の GFP Cre を注入すると、非常に高密度の標識が得られますが、神経突起や樹状突起スパインの発生源を追跡するのが難しいため、最適とは言えない可能性があります。しかし、標識された領域の周辺にある明るい細胞を選択することで、ニューロンとそのプロセスを画像化することは可能です。あるいは、SuperNovaコンストラクトの注入は、非常に明るく標識された第2層から第3層のニューロンのまばらな分布をもたらす。一度習得すると、子宮内エレクトロポレーション手術は、適切に行われれば30分もかかりません。この手順を他のDNAコンストラクトで試みる際には、異なる濃度と体積を試すことを覚えておくことが重要です。私たちの代表的な結果は、単一のコンストラクトまたは最近発明されたSuperNovaコンストラクトのいずれかを使用しました。後者では、ニューロンの明るさを最大化しながら、優れたスパースラベリングを実現できることがわかりました。この技術は、他の方法でモザイク脳組織を作成するために適用できます。例えば、CRISPRおよびCas9遺伝子編集は、子宮内エレクトロポレーションと組み合わせることができ、Cre-Lox組換えは、ウイルスベクターの脳室内注射と組み合わせることができる。このビデオを見た後、Cre-Lox組換えと子宮内エレクトロポレーションを組み合わせることができるように、スパースな遺伝子モザイクを実現するために使用されるいくつかの簡略化された洗練された技術についてよく理解できるはずです。皆様のご健闘をお祈り申し上げます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

E15マウス胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

子宮内エレクトロポレーションでは発達中の中枢神経系（CNS）における空間的および時間的に制御された方法で迅速な遺伝子デリバリーを可能にする。ここでは、終脳、間脳や網膜など、複数の胚中枢神経系領域、中に発現構築物を提供するために使用することができる子宮内エレクトロポレーションプロトコルにおける適応性の高いを説明します。...

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

発展途上のマウス脳への遺伝子導入法は、ユニークな手術法と電極の特殊な形状を用いて記述されます。このユニークな手法は、脳の発達の研究に多くの神経科学者を支援する時間的および空間的にプラスミドDNAのトランスフェクションすることができます。...

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。...

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

このビデオでは、遺伝子組み換えマウスの仔マウスに、loxP部位とエストロゲン受容体に融合したCre組換え遺伝子を持つマウスの仔を使用して、脳海綿状奇形(CCM)を誘発しています。4-ヒドロキシタモキシフェンの投与は、内皮細胞のCreを活性化し、Ccm2の欠失と脳内のCCMの形成につながります。...

Cre-LoxPを介した脳海綿状奇形のマウスモデルにおける誘導

出典: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。...

マウス皮質介在ニューロン前駆細胞におけるアガロース包埋エレクトロポレーション支援遺伝子導入

ニューロンの移動は、多数の細胞自律的および非細胞自律的要因によって調節されています。 このプロトコルは、トランスジェニックマウスの表現型が細胞内因性メカニズムの破壊によるものか、ニューロンとその環境との間の相互作用の障害によるものかを判断するために、子宮内エレクトロポレーションをどのように使用できるかを示しています。...

タンパク質の削除の誘導を介して子宮内でエレクトロポレーションは、トランスジェニックモデルにおいて神経細胞の移動の欠損を定義する

二元的な遺伝的戦略を利用して、Creを介した組換え後に相補的な経シナプストレーサーを発現するマウスの神経回路トレースのための詳細なプロトコルを提供します。細胞特異的トレーサー産生は遺伝的にコードされているため、私たちの実験的アプローチは、マウス胚の脳発生中の神経回路の形成と成熟を単一細胞分解能で研究するのに適しています。...

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

このプロトコルは、子宮内エレクトロポレーションを介してC57BL/6中枢神経系の異なる領域を特異的にトランスフェクションする方法を詳細に説明しています。このプロトコルには、皮質、海馬、視床、視床下部、外側中隔核、線条体に発達する領域のトランスフェクションに関する詳細な指示が含まれています。...

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

子宮エレクトロポレーションの二重は、空間的および時間的に分離された細胞集団を標的にすることを可能にする。この技術は、通常の条件で蛍光タンパク質を使用して、また、目的の遺伝子を摂動する機能実験の後に、それらの細胞集団間の相互作用を視覚化するのに有用である。...

時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重

アストロサイトは大脳皮質を均一にタイル化し、複雑な形態の分析を細胞レベルで困難にします。ここで提供されるプロトコルは、子宮内のエレクトロポレーションに基づく多色標識を使用して、皮質アストロサイトを単一にし、ユーザーフレンドリーな画像解析パイプラインでボリュームと形態を分析します。...

多アドレス可能なゲノム積分色(MAGIC)マーカーを皮質マウスアストロサイトに個別化する子宮内電気的

学ぶ子宮内エレクトロポレーションによるマウス大脳皮質のCre-Lox組換え誘導法。特定の遺伝子が神経細胞表現型に必要かを細胞自律的に調べる技術で、発生神経科学の研究に有用です。

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