子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

この手順の全体的な目標は、子宮内エレクトロポレーションを通じてCre-Lox組換えを誘導することにより、マウス大脳皮質に遺伝的モザイクを生成することです。この遺伝的モザイクの生成方法は、神経生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。例えば、ある遺伝子が特定のニューロン表現型に必要かどうかを細胞自律的に判断するなどです。

この技術の主な利点は、効果的なCre-Lox組換えシステムが、子宮内エレクトロポレーションにおいて同等に効果的な遺伝子導入技術と組み合わされることです。この方法は、第2層から第3層の皮質ニューロンを標的とすることに焦点を当てていますが、他の皮質層の深さのニューロンを標的にするために使用できます。脳組織に遺伝子モザイクを作ろうとしたとき、実験動物が出生後も生き残るためにいくつかの問題に直面したため、技術にいくつかの単純化と改良を導入しました。

胚性幹細胞注入または核移植用のピペットに典型的な、非常に長いテーパーと非常に細い先端を備えたピペットを準備します。クランプを固定した後、プログラムを引っ張りプロトコルにアクティブにし、ガラスキャピラリーにテーパーを作成します。テーパーの長さが10〜15mmであることを確認してください。

次に、ピペットの先端を折るために、50mLのビーカーで1枚重ねの作業を行い、片手でぴんと張ったように伸ばします。もう一方の手で、引っ張ったピペットをテーパー側を下にして、ワイプの中心を垂直に押し、テーパーをきれいに断ち切ります。複合光学顕微鏡で開口部のサイズを確認します。

次に、0.4%トリパンブルーとPBSの1 mcLを吸引してピペットを部分的に充填したピペットに校正し、ピペット内の1 mcLの高さに基づいて1 mcLのマーキングでピペットを卒業させます。校正されたピペットを使用して、廃棄する前に他のプルピペットを卒業させます。ピペットをほこりやその他の粒子が入らないようにピペットホルダーに入れます。

E-15.5で妊娠中のマウスに深く麻酔をかけた後、誘導チャンバーを静かに傾けてマウスの反応に注意して、立ち直り反射をテストします。立ち直反射がない場合は、マウスを手術準備領域に移し、鼻円錐を通して吸入イソフルランを投与して、麻酔の手術面を維持します。鉗子を使用してペダル反射をテストし、麻酔を確認します。

努力して呼吸数を監視し、深く規則的な呼吸と粘膜の色がピンク色で湿っていることを確認します。乾燥から保護するために、目を完全に覆うのに十分な獣医用眼科軟膏を目に塗ります。.腹部の毛皮が溶けるまで、綿棒で腹部に脱毛クリームをマッサージします。

次に、腹部の毛皮を拭き取り、残っている残留物と脱毛クリームを70%エタノールと綿棒で慎重に洗い流します。ヨウ素ベースのスクラブ溶液を円を描くように腹部に塗布します。

次に、外科用ドレープを使用して手術部位を隔離し、無菌状態を維持します。皮膚に2cmの腹側正中線切開を行った後、腹直筋の正中線を視覚化するためにlinea albaを見つけます。筋肉を引き上げて腹部から離し、無菌技術を使用して2cmの正中線切開を行い、腹腔を露出させます。

滅菌済みの10mcLマイクロピペットチップを使用して、鎮痛のためにカルプロフェンを腹腔内に分注します。次に、腹直筋切開部の左端に1つのハルトマン蚊鉗子をクランプします。切開部の左側にあるひっくり返ったペトリ皿に鉗子を置き、切開部の左側を開いたままにします。

同様に切開部の右側を固定した後、切開部の周囲にガーゼスポンジを置きます。リミットスクリューが取り付けられていないリング鉗子を使用して、組織を押しつぶしたり傷つけたりすることなく、隣接する2つの胚の間の子宮を引っ張ります。切開部からすべての胚を引き出し始め、ガーゼスポンジの上に置きます。

校正したピペットを吸引器チューブアセンブリに接続し、子宮壁を通して調製したDNA溶液を正確に1mcLを各胚の側心室に注入します。親指と人差し指を使って胚を操作し、注射中に胚を子宮壁に優しく押し付けます。側脳室は、胚の背側終脳に2つの暗い斑点として現れます。

トリパンブルーが側脳室を満たしているのを観察して、成功した注射を確認します。すべての胚を注入した後、ピンセット型電極の陰極を子宮上、内側皮質と尾側皮質の真上に配置して、視覚野を標的にします。アノードは、胚の頭のすぐ下と前方に配置します。

フットペダルを使用して、50ボルトの550ミリ秒のパルスを950ミリ秒間隔で送達します。すべての胚をエレクトロポレーションした後、子宮を見つけたときと同じ向きで腹腔に戻します。生理食塩水を使用して子宮を滑らかにし、胚を子宮内の位置からずらさないように注意しながら、手動で非常に穏やかに子宮を導きます。

吸収性縫合糸で腹部の筋肉を閉じます。単純な中断ステッチを使用し、両端を外科医の結び目で結びます。吸収性縫合糸で皮膚層を閉じます。

傷口を密封するために少量のティッシュ接着剤を塗布します。結び目にティッシュ接着剤を塗布して、緩めないようにします。マイクロピペットを使用して、吸引可能な創傷の周囲の組織接着剤をすべて取り除きます。

組織接着剤が乾いたら、動物をイソフルランから取り出し、雌が温かいケージの中で一人で回復するのを待ちます。マウスが完全に回復し、正常に動作するまで、マウスの監視を続けます。取り除いたら、メスをオスと一緒にケージに戻します。

頭蓋骨を平らな面に置き、1-x PBSで湿らせた単層タスクワイプを使用します。ピンセットを使用して、最初に後頭骨を取り除きます。次に、頭頂骨を慎重に取り除き、ピンセットを取り出して脳の表面から離します。

皮質の損傷を防ぐために、髄膜を慎重に取り除きます。ピンセットの裏側を頭蓋骨に沿って脳の下に挟み込み、脳神経を切断して脳を切除します。片刃のカミソリの刃を使用して、冠状動脈を吻側からブレグマまで約0.5 mm切断し、別の冠状動脈を目的の組織に対して尾側に約0.5 mm切断します。

これで、ティッシュブロックを切片化する準備が整いました。1 mcL に 2 mg/mL の GFP Cre を注入すると、標識細胞の分布がまばらになり、その一部が明るくなることがあります。組織は100ミクロンで切片化されているため、樹状突起のほとんどが維持されています。

胎内エレクトロポレーションが胚の15.5日目に行われると、標識は皮質層2と3で行われます。樹状突起棘は高倍率で観察できます。1.5 mcL の 2 mg/mL の GFP Cre を注入すると、非常に高密度の標識が得られますが、神経突起や樹状突起スパインの発生源を追跡するのが難しいため、最適とは言えない可能性があります。

しかし、標識された領域の周辺にある明るい細胞を選択することで、ニューロンとそのプロセスを画像化することは可能です。あるいは、SuperNovaコンストラクトの注入は、非常に明るく標識された第2層から第3層のニューロンのまばらな分布をもたらす。一度習得すると、子宮内エレクトロポレーション手術は、適切に行われれば30分もかかりません。

この手順を他のDNAコンストラクトで試みる際には、異なる濃度と体積を試すことを覚えておくことが重要です。私たちの代表的な結果は、単一のコンストラクトまたは最近発明されたSuperNovaコンストラクトのいずれかを使用しました。後者では、ニューロンの明るさを最大化しながら、優れたスパースラベリングを実現できることがわかりました。

この技術は、他の方法でモザイク脳組織を作成するために適用できます。例えば、CRISPRおよびCas9遺伝子編集は、子宮内エレクトロポレーションと組み合わせることができ、Cre-Lox組換えは、ウイルスベクターの脳室内注射と組み合わせることができる。このビデオを見た後、Cre-Lox組換えと子宮内エレクトロポレーションを組み合わせることができるように、スパースな遺伝子モザイクを実現するために使用されるいくつかの簡略化された洗練された技術についてよく理解できるはずです。

皆様のご健闘をお祈り申し上げます。