Name: 血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学ぶ 細胞ベースの蛍光抗体法を用いて、HEK293細胞でNMDA受容体に対する自己抗体を検出する方法。GFP標識NR1サブユニットを発現させ、蛍光顕微鏡で自己抗体の結合を可視化することで、自己免疫性脳炎のスクリーニング診断に応用できます。

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この作品は、チャン庚医学財団 (許可番号 CMRPG3C1771、CMRPG3C1772、CMRPG3E0631、CMRPG3E0632、および CMRPG3E0633) によって支えられました。

研究は、制度のレビュー委員会の長庚記念病院 Linkuo、桃園、台湾 (102-2577A3) で承認されました。
1. NR1 GFP 発現プラスミドの作製
<ol><li>遠心分離機管、ピペットで移しなさい混合物の優しくまで上下のエシェリヒア属大腸菌の有能なセルひずみ DH5α 滅菌 1.5 mL の 100 μ L の NR1 GFP プラスミドのミックス 10 ng 4-6 回、20 分間氷の上管を孵化させなさいと。</li>
	<li>水のお風呂で 1 分の 42 ° C でチューブをインキュベート水浴からチューブを削除、管に 1 mL ホストゲノム スープ (LB) 媒体を追加し、37 ° c 1 時間振とうしながらインキュベーターでチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>アンピシリン (0.1 Mg/ml) を含む LB 寒天培地プレート上に混合物の 50 μ L を広がり、インキュベーターの 37 ° C で LB 寒天培地プレートを一晩インキュベートします。</li>
	<li>一晩 LB 寒天培地滅菌チップを使用して単一コロニーを拾うし、渦の先端を 5 mL の LB 培地とアンピシリン (0.1 mg/mL) の管内細菌培養の。一晩中揺れでインキュベーターで 37 ° C でチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>250 mL 滅菌 LB 培地とアンピシリン (0.1 mg/mL) が含まれています 500 mL フラスコに一晩培養分注 3 mL。揺れで 37 ° C でフラスコを孵化させなさい。600 の波長で細菌培養の光学濃度 (OD) を定期的にチェック、OD600 0.6 1.0 に達するまでに分光器を用いた nm。 注: は、グリセロール ストックを準備し、グリセロール ストック将来使用するため-80 ° C 以下での保存を 200 μ l 添加グリセリンと一晩培養も 800 μ L を混ぜます。</li>
	<li>250 mL の細菌文化から NR1 GFP 発現プラスミドを準備します。<ol>
<li>4 ° C で 15 分間 6,000 × g で遠心分離によって細胞を収集します。</li>
		<li>RNase A を含む 10 mL 再懸濁バッファーで細菌のペレットを再懸濁します渦塊は見られないまでに徹底的に。</li>
		<li>細菌懸濁液を 10 mL の溶解バッファーを追加、穏やかに 4-6 回、混合物を反転し、室温 (RT) 5 分でライセートを孵化させなさい。</li>
		<li>やさしく転倒させる混合物 4-6 回、ライセートを 10 mL 中古冷蔵沈殿バッファーを追加します。</li>
		<li>キャップとフィルター カートリッジの樽の中に溶解液を注ぐ室温 10 分待つ</li>
		<li>カートリッジ出口ノズルのキャップを外し、ピストンをカートリッジに挿入し、ピストンを軽く押します。フィルタ リングされた収集 50 mL のチューブに溶解。</li>
		<li>2.5 mL 独自バッファーの製造元からフィルタ リングされたライセートを加えてチューブ約 10 倍の反転によって混合物を混ぜる混合物 30 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
		<li>適用 10 mL 平衡バッファーで平衡は事前フィルター列をフィルター選択されたライセート混合物。重力によって排出する列を許可します。</li>
		<li>30 mL 洗浄バッファーの列を 2 回洗浄し、15 mL の溶出バッファーを使用して、列から DNA を溶出します。</li>
		<li>10.5 mL (0.7 ボリューム) イソプロパノールを加える溶離された DNA バッファー、よく混ぜ、4 ° C で 30 分間 20,000 × g で混合物を遠心分離機</li>
		<li>慎重に上清をデカントし、一度、5 mL エンドトキシン フリー 70% エタノールによる DNA ペレットを洗浄し、10 分 20,000 × g で遠心。</li>
		<li>上清をデカント、化学フードで 5-10 分のペレットを乾燥、エンドトキシン フリー バッファーの 300-500 μ L のペレットを溶解します。</li>
		<li>紫外線 260/280 nm の吸光度で溶液の吸収を測定することによってプラスミド濃度を決定します。 注: は、同じプロトコルを使用して GFP 発現プラスミドを準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NR1 GFP 発現プラスミドを HEK293 細胞のトランスフェクション
<ol><li>それぞれに 2% のゼラチン溶液 200 μ L 分注 48 ウェル培養プレートのと少なくとも 30 分の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>10% 牛胎児血清 (FBS) 各井戸を含む細胞培養液 200 μ L でよくとシード 5 × 104 HEK293 細胞からゼラチン溶液を吸引します。一晩 5% CO2付属の加湿インキュベーターで 37 ° C でプレートを孵化させなさい。 注: 診断、セルがカウントされます。</li>
	<li>10% を含む新鮮な培養液 200 μ L で過ごした培を交換して次の日にもあたり FBS。</li>
	<li>各シングルの 100 を混合することによって、溶液を準備 20 μ L の培養液と 20 μ L の培養液中で 0.8 μ L のトランスフェクション試薬を混合することによってソリューション B NR1 tGFP プラスミドの ng。各実験のための総容積の準備に必要な井戸の数を乗算します。</li>
	<li>ソリューション A と B のソリューションを混合することによって C のソリューションを準備し、RT で 20-30 分のための混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>C の解決策も HEK293 細胞を含むそれぞれの 40 μ L 分注プレートを軽く、旋回し、一晩 5% CO2付属の加湿インキュベーターで 37 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>40 X-200 X 倍率と蛍光顕微鏡下で宿主細胞の NR1 GFP 遺伝子組換えタンパク質の発現を確認 (励起/蛍光: 482/502 nm)、細胞を用いた蛍光抗体法に進みます。 注: を使って同じプロトコルを使用して HEK293 細胞に発現プラスミド GFP。</li>
</ol>3. 細胞を用いた蛍光抗体法
<ol><li>井戸から使用済の培地を吸引、その後洗ってリン酸を 200 μ l 添加の各ウェル バッファー生理食塩水 (PBS) 3 回。</li>
	<li>4% パラホルムアルデヒド溶液 200 μ L を加えるごとによく15 分間常温プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>、井戸からパラホルムアルデヒド ソリューションを吸引させ、各 200 μ L の PBS を 3 回も。</li>
	<li>10% スキムミルク 200 μ L を加えて PBST (0.1 %pbs でトゥイーン 20) それぞれがよく、穏やかな揺れで 1 h の RT でプレートをインキュベートするソリューション。</li>
	<li>PBST ソリューションだけでなくからの 10% のスキムミルクを吸引して 200 μ L PBST で井戸を一度洗ってください。</li>
	<li>1 h の RT で穏やかな揺れで一次抗体として希薄プラズマ (pbst; で 1: 100) と井戸を孵化させなさい。 注: プラズマが自己免疫性脳炎が疑われる患者の血液から得られます。</li>
	<li>、井戸から希薄プラズマを吸引し、それぞれを洗ってよく PBST の 200 μ L で 3 回。</li>
	<li>ヤギ抗ひと IgG が Alexa Fluor 594 (1:1, 000 PBST 希釈) を各ウェルに共役の 200 μ L を追加し、1 h の穏やかな揺れで常温培養プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>ヤギ抗ひと IgG 共役 Alexa Fluor 594 ソリューションを吸引し、それぞれを洗ってよく PBST の 200 μ L で 3 回。</li>
	<li>各ウェルに 100 μ L のグリセロールの解決 (PBS と 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) の 1: 100,000 の 50% のグリセロール) を追加します。</li>
	<li>観察し、接眼レンズと 4 X、10 X、20 X 目標 X 10 を使用して蛍光顕微鏡下で細胞をイメージします。 注: 正しいフィルターを使用して、各染料のため: NR1 GFP の (励起/蛍光 = 482/502 nm)、Alexa Fluor 594 の (励起/蛍光 = 561/594 nm)、DAPI のため (励起/蛍光 = 358/461 nm)。同じ方法で GFP を発現する HEK 細胞を使用して負の制御を行います。</li>
</ol>

<ol><li>Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+surface+antibody-mediated+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis.</a> Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).</li>
<li>Lancaster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+treatment+of+autoimmune+Encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis.</a> J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Pruss, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+NMDA+receptor+antibodies+in+encephalitis+of+unknown+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin.</a> Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).</li>
<li>Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Autoimmune encephalopathies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li>
<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).</li>
<li>Chapman, M. R., Vause, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+diagnosis%2C+psychiatric+presentation%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment.</a> Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).</li>
<li>Gable, M., Glaser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+encephalitis+appearing+as+a+new-onset+psychosis%3A+disease+course+in+children+and+adolescents+within+the+california+encephalitis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project.</a> Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).</li>
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<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methyl-D-aspartate+antibody+encephalitis%3A+temporal+progression+of+clinical+and+paraclinical+observations+in+a+predominantly+non-paraneoplastic+disorder+of+both+sexes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes.</a> Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).</li>
<li>Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+antibody+encephalitis%3A+performance+evaluation+and+laboratory+experience+with+the+anti-NMDA-receptor+IgG+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay.</a> Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).</li>
<li>Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+glutamate+receptor+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes.</a> Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).</li>
<li>Ramberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+diagnostic+accuracy+of+microscopy+and+flow+cytometry+in+evaluating+n-methyl-d-aspartate+receptor+antibodies+in+serum+using+a+live+cell-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay.</a> PLoS One. 10 (3), e0122037(2015).</li>
<li>Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+a+severe%2C+multistage%2C+treatable+disorder+presenting+with+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis.</a> J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).</li>
<li>Dahm, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+autoantibodies+against+brain+antigens+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease.</a> Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).</li>
<li>Jézéquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+single+molecule-based+methods+to+detect+anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+autoantibodies+in+patients+with+first-episode+psychosis+from+the+OPTiMiSE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project.</a> Biol Psychiatry. , (2017).</li>
</ol>

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生きている細胞を用いた蛍光アッセイ11、固定細胞を用いた蛍光抗体法9 を含む文献で報告された NMDA 受容体に対する自己抗体の存在を画面にいくつか細胞を用いた免疫学的アッセイには、流れの cytometry ベース測定14。生きている細胞を用いた蛍光抗体法は、流れの cytometry ベース試金は、訓練された人員および特別な装置を必要とする間、異所萌出へ NR1 蛋白質を発現する細胞の準備の後まもなく実行必要があります。固定のセル ベースの蛍光抗体法は臨床設定で行うことができる便利な試金です。したがって、多くの研究は、血清と髄液の標本12,15画面抗 NMDA 受容体抗体に商業間接固定のセル ベースの蛍光抗体法を使用しました。キットに使用される (参照材料のテーブル) には、NMDA 受容体の遺伝子組換えの NR1 サブユニットを異所萌出へエクスプレス固定 HEK293 細胞...

抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎は、すべての年齢の患者に発生することができます、主に女性患者1,2に影響を与える新たに認められた疾患エンティティです。脳炎3の初期原因不明患者の間で最も頻繁に診断された脳炎の一つです。通常抗 NMDA 受容体脳炎で被害を受けた患者は、頭痛や発熱、意識レベルの変化、様々 な撹拌、過敏症など急性の神経精神症状の迅速な開発が続くの前駆症状を持っています。、不安、不眠、幻覚、妄想、侵略、奇妙な行動、運動異常、自律神経の調節不全や発作の攻撃4,5。この条件とタイミング療法と免疫療法を早期より良い結果と影響を受ける患者6も完全復旧のため重要です。したがって、抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎は急性または新規発症の精神機能7、8を呈する患者の鑑別診断として考慮されるべきことをお勧めします。
臨床的特徴のほかに血液や脳脊髄液の NMDA 受容体に対する自己抗体の検出は抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎9の正確な診断に不可欠です。ほとんどの抗 NMDA 受容体抗体を検出する免疫学的テストがいくつか研究所10,11, で利用可能なスクリーニングのための 1 つだけの市販細胞を用いた蛍光抗体法、抗 NMDA 受容体抗体12。本研究の目的は抗 NMDA 受容体の臨床研究を促進する抗 NMDA 受容体抗体の存在感を画面に実験室で便利に使用できる単純な社内細胞を用いた蛍光抗体を開発するには自己免疫性脳炎。NMDA 受容体は heterotetramer イオン チャネル蛋白質の複合体、脳で特異的に発現します。それはの 2 つの強制 NR1 サブユニットと NR2A、NR2B、NR2C、NR2D の13の 1 つまたは 2 つのサブユニットの組み合わせでください。以前の研究は、その抗体の対象となる主なエピトープは NR1 サブユニット5の細胞外 N 末端ドメインを報告しました。したがって、このプロトコルでは我々 は人間の萌芽期の腎臓上皮細胞株 (HEK293) で緑色蛍光タンパク質 (GFP) が付いた NMDA 受容体の人間の組換えの NR1 サブユニット蛋白質を表現し、検出する細胞を用いた蛍光抗体法を開発血液中の抗 NMDA 受容体抗体の IgG クラス。

<table><tbody><tr><td>GRIN1(GFPタグ付き)-ヒトグルタミン酸受容体、イオノトロピック、N-メチルD-アスパラギン酸1(GRIN1)、転写バリアントNR1-1</td><td>Origene(メリーランド州ロックビル、米国)</td><td>RG219368</td><td>C末端tGFP配列</td></tr><tr><td>pCMV6-AC-GFP</td><td>Origene(メリーランド州ロックビル、米国)</td><td>PS100010</td><td>C末端tGFPタグ付き哺乳類</td></tr><tr><td>ベクターEndoFreeプラスミドMaxi Kit</td><td>Qiagen(ヒルデンドイツ)</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose, Pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Featured Fetal Bovine Serum, US Origin</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ヒトIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 594コンジュゲート</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA-11014</td><td></td></tr><tr><td>ポジティブコントロール:抗グルタミン酸受容体(NMDA型)</td><td>Euroimmun AG、L&uuml;ベック、ドイツ</td><td>CA 112d-0101</td><td></td></tr><tr><td>Euroimmunアッセイキット</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

血の n-メチル-d-アスパラギン酸 (nmda) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

抗 NMDA 受容体抗体の存在は、影響を受ける患者は、抗 NMDA 受容体自己免疫性脳炎と呼ばれるさまざまな神経精神症状を引き起こします。血液や脳脊髄液 (CSF) の NMDA 受容体に対する特定の自己抗体の検出は、この条件の正確な診断のために不可欠です。NMDA 受容体は、イオン チャネル蛋白質複合体 2 つ必須 NMDA 受容体サブユニット 1 (NR1) と 1 つまたは 2 つの NMDA 受容体を含む 4 つのサブユニットを含むサブユニット 2 a (NR2A) NMDA 受容体サブユニット 2B NR2B、NMDA 受容体サブユニット 2 C (NR2C) または NMDA 受容体サブユニット 2 D (NR2D)。抗 NMDA 受容体抗体のエピトープは、NMDA 受容体の NR1 サブユニットの細胞外 N 末端ドメインに存在すると報じられました。本研究の目的は臨床および基礎研究を容易にするために血液の NMDA 受容体の NR1 サブユニットに対する抗体の存在を検出するスクリーニング検査として使用できる単純な細胞を用いた蛍光抗体法を開発、します。抗 NMDA 受容体の自己免疫性脳炎。

平均では、プロトコルのセクション 1 で説明されている手順に従って 250 mL の細菌文化から 200 〜 300 μ エンドトキシン発現プラスミド NR1 GFP の GFP を取得私たちでした。100 ng/よく発現プラスミドの量は、プロトコルのセクション 2 の説明に従って 48 ウェル プレートで培養した HEK293 細胞のトランスフェクションに使用されました。トランスフェクション後 24-30 時間、細胞表現 NR1 遺伝子の発現と GFP 遺伝子組換えタンパク質を蛍光顕微鏡下で検出できます。図 1 aは、図 1を示して GFP を発現している細胞、NR1 遺伝子の発現を表現する宿主細胞のイメージを示しています。緑の信号は、アッセイの品質コント ローラーとして使用できる: 細胞の約 30% であった蛍光顕微鏡下で緑の信号。図 1 aと1 Dは、NR...

我々 は異所萌出へ自己免疫性脳炎が疑われる患者の血中 NMDA 受容体に対する自己抗体を検出する抗原としてヒト胚性細胞 (HEK293) で緑色蛍光タンパク質が付いた NMDA 受容体の NR1 サブユニットを表明しました。この単純な方法はスクリーニング目的のため臨床現場で適切な可能性があります。

血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

このアッセイの全体的な目標は、自己免疫性脳炎が疑われる患者の血液中のNMDA受容体に対する自己抗体を検出することです。この指標は、急性神経精神症状のある患者の鑑別診断における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで信頼性の高いスクリーニング手段であることです。この手順は、ゼラチンでコーティングされた培養プレートを準備することから始めます。200マイクロリットルの2%ゼラチン溶液を48ウェル培養プレートの各ウェルに分注し、プレートを摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。30分後、ウェルからゼラチン溶液を吸引します。10%FBSを含有する200マイクロリットルの細胞培養培地中のHEK293細胞を各ウェルに5回10〜4回播種する。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートし、5%の二酸化炭素を供給した加湿インキュベーターでインキュベートします。翌日、各ウェルの使用済み培地を、10%FBSを含む200マイクロリットルの新鮮な培地と交換します。実験のウェルの総数に応じてスケールアップし、NR1-GFPプラスミドを培地と混合して溶液Aを調製します。トランスフェクション試薬を培地と混合して溶液Bを調製します。溶液Aと溶液Bを混合し、室温で20〜30分間インキュベートすることにより、溶液Cを調製します。次に、HEK293細胞を含む各ウェルに40マイクロリットルの溶液Cを分注します。プレートを穏やかに回転させ、5%の二酸化炭素を供給した加湿インキュベーターでプレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。細胞ベースの免疫蛍光アッセイに進む前に、40倍から200倍の倍率の蛍光顕微鏡下で宿主細胞におけるNR1-GFP組換えタンパク質の発現を確認してください。このアッセイを開始するには、まず培養プレートのウェルから使用済み培地を吸引し、次に各ウェルを200マイクロリットルのPBSで3回洗浄します。200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒド溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で15分間インキュベートします。ウェルからパラホルムアルデヒド溶液を吸引し、各ウェルを200マイクロリットルのPBSで3回洗浄します。次に、PBST溶液中の10%スキムミルク200マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートを室温で1時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。ウェルからPBST溶液で10%スキムミルクを吸引し、ウェルを200マイクロリットルのPBSTで一度洗浄します。PBSTで1〜100に希釈した血漿を一次抗体としてウェルをインキュベートし、室温で1時間穏やかに振とうします。1時間後、希釈した血漿をウェルから吸引し、各ウェルを200マイクロリットルのPBSTで3回洗浄します。各ウェルに、Alexa Fluor 594と結合させた200マイクロリットルのヤギ抗ヒトIgGを加え、培養プレートを室温で1時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。次に、Alexa Fluor 594溶液で結合したヤギ抗ヒトIgGを吸引し、各ウェルを200マイクロリットルのPBSTで3回洗浄します。3回目のPBST洗浄後、DAPIを含む100マイクロリットルのグリセロール溶液を各ウェルに加えます。蛍光顕微鏡で、各色素に適したフィルターと、4倍、10倍、20倍の対物レンズを持つ10倍接眼レンズを使用して、細胞を観察し、画像化します。トランスフェクションの24時間から30時間後に撮影されたこれらの代表的な画像は、NR1-GFPを発現するHEK293細胞を示しています。細胞の約30%が蛍光顕微鏡下で緑色のシグナルを持っていました。対応するAlexa Fluor 594の画像では、パネルBの赤色の信号は、抗NMDA受容体自己抗体がHEK293細胞で発現するNR1に結合していることを示しています。パネルEの弱い赤色の信号は、Alexa Fluor 594画像のバックグラウンドノイズを示しています。NR1-GFPを発現する細胞は、ヒト血漿サンプル中の抗NMDA受容体自己抗体の存在をスクリーニングするために使用されました。これらの合成画像では、黄色はNR1-GFPと抗NMDA受容体自己抗体の共局在を示しています。矢印は、共局在が顕著な細胞の例を示しています。この場合、緑と赤の信号が 30% 以上重なっているプラズマサンプルは陽性と解釈されます。ネガティブコントロールのマージされた画像では、緑と赤のシグナルの重なりがほとんどなく、アッセイ中の抗NMDA受容体自己抗体のNR1-GFPへの特異的結合が確認されています。一度習得すると、適切に実行すれば、このテクニックは4時間で完了します。この手法を試みる際には、それが単なるスクリーニング手段であることを覚えておくことが重要です。これらの手順に続いて、ウェスタンブロット解析や組織ベースの解析などの他の手段を実行して、陽性症例の特異性などの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、精神医学の分野の研究者が急性メンタルヘルスの緊急事態の患者の鑑別診断を探求するための道を開きます。このビデオを見れば、血液中のNMDA受容体に対する自己抗体をスクリーニングするためのアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。

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このビデオは、ラット海馬ニューロン培養を使用してサンプル中の特定の抗原に対する抗体を同定する技術を示しています。N-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)を標的とする自己抗体を含む患者サンプルに培養ニューロンを曝露することにより、神経細胞表面に結合した自己抗体の存在が免疫染色によって明らかになります。...

海馬神経細胞培養を用いたヒト血清中の自己抗体検出法

近年、生細胞ベースのアッセイは、表面とコンフォメーション抗原に対する抗体を検出するために首尾よく使用されている。ここでは、患者の大規模コホートの分析を可能にするフローサイトメトリーのハイスループット流を用いた方法を記載している。新規な抗体の検出は、免疫媒介性障害の診断および治療を改善する。...

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

ここでは、ヒトとマウスの血清IgGとIgMの自己抗体を同時に検出するために使用できるカスタマイズ可能な抗原マイクロアレイを生成する方法について説明します。これらのアレイにより、目的の抗原やエピトープに対する抗体をハイスループットかつ定量的に検出することができます。...

IgGおよびIgM自己抗体の同時検出のための二色抗原マイクロアレイの生成

DFS70 抗体は、従来 HEp 2 基板を使用して、正確な解釈を挑戦的な共通の抗核抗体の病気に関連するパターンを模倣します。プロトコルでは、スクリーニングと抗と混合 ANA 陽性で高信頼の DFS70 パターンを区別するアナに従来 HEp 2 に新規設計された HEp 2...

抗と新規 HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト基板アナ選考において混合 DFS70 パターンの同時の区別

このプロトコルの目標より大きな規模での NMDA 受容器 (NMDAR)...

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析

細胞に基づく試金は広く使用されている血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン g.

細胞ベースのアッセイによるひと血清抗アクアポリン 4 免疫グロブリン G の検出

7つの自己抗体アッセイを組み合わせた単純なマルチプレックスECLアッセイをモデル化します。このアッセイは、T1Dと、セリアック病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性多腺症候群など、他の複数の自己免疫疾患を同時にスクリーニングすることができます1。...

1型糖尿病と複数の自己免疫疾患を同時にスクリーニングするハイスループット電気化学発光7-Plexアッセイ

自己免疫性脳炎は、中枢神経系の抗体媒介性疾患の新しいカテゴリーです。海馬ニューロンは、これらの抗体を発見し、特徴付けるために使用することができる。この記事では、患者の血清および脳脊髄液中の自己抗体を決定するための初代細胞培養および免疫染色のプロトコルを提供します。...

自己免疫性脳炎に関与する新しい病原性抗体を検出および研究するための海馬神経培養

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の動物モデルであり、ヒトの疾患と強力な体液性自己免疫応答を共有しています。ここでは、EAE免疫マウスの血清中の自己抗体を定量するためのシンプルで柔軟なELISAプロトコルを報告します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するマウスにおける自己反応性抗体の定量化

抗MDA5を検出するための段階的な免疫細胞化学(ICC)方法論を提供します。このアプローチには、細胞固定、透過処理、抗体インキュベーション、およびイメージング技術が含まれており、抗 MDA5 自己抗体の正確な検出を可能にし、筋炎患者の急速に進行する間質性肺疾患の診断に役立ちます。...

HeLa細胞を用いた抗MDA5自己抗体の検出と光学顕微鏡による免疫細胞化学

ここでは、無細胞合成生物学の原理と、ヒトおよび動物の血清における抗体応答のカスタマイズ可能な検出のためのドットブロット技術に基づいて最近開発されたイムノアッセイプラットフォームについて説明します。...

ヒトおよび動物の血清中の抗体応答を検出するための実用的で適応性の高いイムノアッセイプラットフォームとしての無細胞ドットブロット

学ぶ 細胞ベースの蛍光抗体法を用いて、HEK293細胞でNMDA受容体に対する自己抗体を検出する方法。GFP標識NR1サブユニットを発現させ、蛍光顕微鏡で自己抗体の結合を可視化することで、自己免疫性脳炎のスクリーニング診断に応用できます。

血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法

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