血の N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体に対する自己抗体を検出する単純な細胞ベースの蛍光抗体法

このアッセイの全体的な目標は、自己免疫性脳炎が疑われる患者の血液中のNMDA受容体に対する自己抗体を検出することです。この指標は、急性神経精神症状のある患者の鑑別診断における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルで信頼性の高いスクリーニング手段であることです。

この手順は、ゼラチンでコーティングされた培養プレートを準備することから始めます。200マイクロリットルの2%ゼラチン溶液を48ウェル培養プレートの各ウェルに分注し、プレートを摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。30分後、ウェルからゼラチン溶液を吸引します。

10%FBSを含有する200マイクロリットルの細胞培養培地中のHEK293細胞を各ウェルに5回10〜4回播種する。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートし、5%の二酸化炭素を供給した加湿インキュベーターでインキュベートします。翌日、各ウェルの使用済み培地を、10%FBSを含む200マイクロリットルの新鮮な培地と交換します。

実験のウェルの総数に応じてスケールアップし、NR1-GFPプラスミドを培地と混合して溶液Aを調製します。トランスフェクション試薬を培地と混合して溶液Bを調製します。溶液Aと溶液Bを混合し、室温で20〜30分間インキュベートすることにより、溶液Cを調製します。

次に、HEK293細胞を含む各ウェルに40マイクロリットルの溶液Cを分注します。プレートを穏やかに回転させ、5%の二酸化炭素を供給した加湿インキュベーターでプレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。細胞ベースの免疫蛍光アッセイに進む前に、40倍から200倍の倍率の蛍光顕微鏡下で宿主細胞におけるNR1-GFP組換えタンパク質の発現を確認してください。

このアッセイを開始するには、まず培養プレートのウェルから使用済み培地を吸引し、次に各ウェルを200マイクロリットルのPBSで3回洗浄します。200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒド溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で15分間インキュベートします。ウェルからパラホルムアルデヒド溶液を吸引し、各ウェルを200マイクロリットルのPBSで3回洗浄します。

次に、PBST溶液中の10%スキムミルク200マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートを室温で1時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。ウェルからPBST溶液で10%スキムミルクを吸引し、ウェルを200マイクロリットルのPBSTで一度洗浄します。PBSTで1〜100に希釈した血漿を一次抗体としてウェルをインキュベートし、室温で1時間穏やかに振とうします。

1時間後、希釈した血漿をウェルから吸引し、各ウェルを200マイクロリットルのPBSTで3回洗浄します。各ウェルに、Alexa Fluor 594と結合させた200マイクロリットルのヤギ抗ヒトIgGを加え、培養プレートを室温で1時間穏やかに振とうしながらインキュベートします。次に、Alexa Fluor 594溶液で結合したヤギ抗ヒトIgGを吸引し、各ウェルを200マイクロリットルのPBSTで3回洗浄します。

3回目のPBST洗浄後、DAPIを含む100マイクロリットルのグリセロール溶液を各ウェルに加えます。蛍光顕微鏡で、各色素に適したフィルターと、4倍、10倍、20倍の対物レンズを持つ10倍接眼レンズを使用して、細胞を観察し、画像化します。トランスフェクションの24時間から30時間後に撮影されたこれらの代表的な画像は、NR1-GFPを発現するHEK293細胞を示しています。

細胞の約30%が蛍光顕微鏡下で緑色のシグナルを持っていました。対応するAlexa Fluor 594の画像では、パネルBの赤色の信号は、抗NMDA受容体自己抗体がHEK293細胞で発現するNR1に結合していることを示しています。パネルEの弱い赤色の信号は、Alexa Fluor 594画像のバックグラウンドノイズを示しています。

NR1-GFPを発現する細胞は、ヒト血漿サンプル中の抗NMDA受容体自己抗体の存在をスクリーニングするために使用されました。これらの合成画像では、黄色はNR1-GFPと抗NMDA受容体自己抗体の共局在を示しています。矢印は、共局在が顕著な細胞の例を示しています。

この場合、緑と赤の信号が 30% 以上重なっているプラズマサンプルは陽性と解釈されます。ネガティブコントロールのマージされた画像では、緑と赤のシグナルの重なりがほとんどなく、アッセイ中の抗NMDA受容体自己抗体のNR1-GFPへの特異的結合が確認されています。一度習得すると、適切に実行すれば、このテクニックは4時間で完了します。

この手法を試みる際には、それが単なるスクリーニング手段であることを覚えておくことが重要です。これらの手順に続いて、ウェスタンブロット解析や組織ベースの解析などの他の手段を実行して、陽性症例の特異性などの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、精神医学の分野の研究者が急性メンタルヘルスの緊急事態の患者の鑑別診断を探求するための道を開きます。

このビデオを見れば、血液中のNMDA受容体に対する自己抗体をスクリーニングするためのアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。