Name: 乳癌の HER2 遺伝子増幅の不均一性を評価する高スループット スクリーニング プラットフォームを構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 学ぶ高スループット銀インプローブハイブリダイゼーションを用いた乳癌HER2遺伝子増幅不均一性の定量化手法。病理アーカイブ由来の多数検体を効率的に解析し、腫瘍内異質性を評価する信頼性の高いスクリーニングプラットフォームを構築します。

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著者は、利害の衝突があります。

ここでは、異質加工乳癌の高収率 TMAs のHER2遺伝子およびその対応するセントロメアの SISH 解析を実行する研究所戦略の詳細しています。このメソッドは、コスト効果の高い、乳房癌取得フォーム病理アーカイブの大規模コホートであるHER2遺伝子増幅の不均一性の研究のためのほとんどの実験室で実施することができます。
臨床的重要性のため HER2 の乳がんとその異種の式によって生成された課題テスト、イントラ- と間-tumor HER2の遺伝学的不均一性を評価する高スループット テスト プロトコルを開発しました。分析エリアには、特定の細胞学的, 建築, と IHC 機能に基づいて、事前侵襲性と侵襲的なコンポーネントが含まれます。
このプロトコルでは慎重に管理する必要がありますいくつかの重要な段階があります。1 つの重要なステップは、関心領域の選択です。学際的なアプローチを通じてさまざまな地形領域の注釈が最終的な分子分析の品質を確保する重要なことを定めています。特に、病理学者に...

HER2が過剰に発現して、すべての侵襲乳房癌1,2の 15-30% の増幅において。HER2 過剰発現の有無による推論は > 染色 (3 +)、遺伝子増幅遺伝子コピー数は ≥6、または HER2/セントロメア比は ≥2 が評価されることができます中にカウントで強い膜免疫組織化学 (IHC) と 10% セル少なくとも 20 細胞の in situハイブリダイゼーション (っぽい)3。
内腫瘍の遺伝学的不均一性は、バイオ マーカーの評価と治療応答4潜在的有害寄稿している乳癌に広く記載されています。よると、大学のアメリカの病理学者 (CAP)、HER2 の不均一性が存在でHER2増幅される場合 > 5% と <5細胞の浸潤腫瘍の 50%。残念ながら、HER2 乳癌の空間的不均一性の実際の発生率は病理学者の間で論争の何人かの著者は、それを維持する極めてまれなイベントだし、40% の症例が他の人まで示唆HER2 異種1,5,6,7,8,9,10。にもかかわらず、この状態を支える生物学的メカニズムはまだ完全には明らかにできなかった内腫瘍 HER2 の不均一性の予後の臨床影響乳房癌患者11にとって重要であります。
最近、発色っぽい (CISH) とシルバーっぽい (SISH) など、明るいフィールド分子技術は、蛍光の ISH (魚)12と比較していくつかの利点を持つ FFPE 組織で HER2 の不均一性を検出するための信頼できる方法として浮上しています。残念ながら、単一症例のバルク分析の大規模コホート研究で非現実的なままです。いくつかのグループは、組織化学、IHC や ISH TMA 技術との組み合わせががん生物学13,14,15,16の研究で貴重な戦略を表すことができますを示唆しています。この広く採用されている方法で、異なる患者から組織サンプル分析できます同時に、組織・採用し、育成の場合14の大シリーズの一様解析試薬を最小限に抑えます。ただし、同時別処理試薬、固定時刻、および保全方法雇用などの面で、アーカイブを受けた複数の組織サンプルのハイスループット分子特性解析できるプロトコルがありません。ブロック。
乳癌の HER2 の空間的不均一性の予後および臨床的影響を与え、異質加工例の大シリーズに評価する分子統合プラットフォームを開発しました。ここでは、我々 は生成および SISH による高収率 TMAs 乳癌のHER2増幅の内腫瘍の不均一性を分析する研究所戦略を描きます。次のプロトコルを開発した腫瘍径 > 5 mm (> TNM 2017 に従って pT1b)17。小さい病変は、フルフェイスの連続切片の解析を実行することをお勧めします。私たちの手順は、ケースごとに 6 の領域 (範囲 4-8) の意味を包含まで 30 の乳癌の同時 IHC と SISH の分析のためことができます。全体で、500 μ m のコアとグリッドとエッジの間に 2 mm の間で、直径 1 mm の 180 のティッシュのコアは、TMA ブロックごとに生成されます。

<table><tbody><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU</td><td>39601006</td><td>組織包埋培地, 56 &deg;C融点</td></tr><tr><td>EosinY&nbsp; 1%水溶液</td><td>Bio Optica、ミラノ、イタリア、EU</td><td>510002</td><td>Eosin黄色がかった、水溶性</td></tr><tr><td>Carazzi's hematoxylin</td><td>Bio Optica, Milan, Italy, EU</td><td></td><td>506012 Alum hematoxylin ripened using potassium</td></tr><tr><td>iodate Diamond quality</td><td>Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU</td><td>33533</td><td>26x76 mm microscope slides</td></tr><tr><td>Leica CV Mount</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU</td><td>14046430011</td> キシレンFLEX IHC顕微鏡<td>スライド中のブチルメタクリレートのポリマーをベースにした、モノマーを含まない封入剤</td></tr><tr><td></td><td>アジレント・テクノロジーズ(ダコ),&nbsp;米国カリフォルニア州サンタクララ</td><td>K8020</td> IHC BenchMark ULTRA Ventana医療システム、米国アリゾナ州ツーソンで使用するための<td>FFPE接着用コーティング顕微鏡スライド</td></tr><tr><td></td><td></td><td>N750-BMKU-FS</td><td>スライド染色システム</td></tr><tr><td>CONFIRM 抗エストロゲン受容体(ER)(SP1) ウサギモノクローナル一次抗体</td><td>ベンタナ医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>790-4324</td><td>一次抗体、すぐに使用可能</td></tr><tr><td>CONFIRM 抗プロゲステロン受容体 (PR) (1E2) ウサギモノクローナル一次抗体</td><td>Ventana 医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>790-2223</td><td>一次抗体、すぐに使用できる</td></tr><tr><td>CONFIRM 抗Ki-67 (30-9) ウサギモノクローナル一次抗体</td><td>Ventana 医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>790-4286</td><td>一次抗体、すぐに使用できる</td></tr><tr><td>PATHWAY HER2 (4B5) ウサギモノクローナル一次抗体</td><td>ベンタナ医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>790-4493</td><td>一次抗体、すぐに使える</td></tr><tr><td>ultraView ユニバーサルDAB検出キット</td><td>ベンタナ医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>760-500</td><td>マウスIgG、マウスIgM、ウサギ一次抗体を検出するための間接的なビオチンフリーシステム</td></tr><tr><td>INFORM HER2 デュアルISH DNAプローブカクテル</td><td>ベンタナ医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>780-4422</td><td>INFORM HER2 Dual ISH assay - 乳がん患者のHER2遺伝子の状態を決定するためのFDA承認のデュアルカラーin situハイブリダイゼーション自動アッセイ&nbsp;</td></tr><tr><td>ultraView Silver ISH DNP Detection Kit</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>800-098</td><td></td></tr><tr><td>ultraView Red ISH DIG Detection Kit</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>800-505</td><td></td></tr><tr><td>ISH Protease 3</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>780-4149</td><td>ISHプロセスで使用され、目的のターゲットDNA配列を囲むタンパク質を除去します</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>ベンタナ医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>760-2021</td><td>修正されたギルのヘマトキシリン対比染色試薬</td></tr><tr><td>ヘマトキシリンII対比染色</td><td>ベンタナ医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>790-2208</td><td>修正されたマイヤーのヘマトキシリン対比染色試薬</td></tr><tr><td>ブルーイング試薬</td><td>ベンタナ医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>760-2037</td><td>スライドガラス上のヘマトキシリン染色切片をブルーイングするための緩衝炭酸リチウムの水溶液</td></tr><tr><td>HybReady</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>780-4409</td><td>ISHアッセイ用ホルムアミドベースの緩衝液</td></tr><tr><td>EZ Prep (10x)</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>950-102</td><td>IHCおよびISH反応中の組織サンプルからパラフィンを除去するための濃縮液で、1:10に希釈します。</td></tr><tr><td>SSC バッファー (10X)</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>950-110</td><td>塩化ナトリウム クエン酸ナトリウム緩衝液は、ストリンジェンシー洗浄や染色ステップ間のスライドのすすぎに使用され、in situハイブリダイゼーション反応のための安定した水性環境を提供します。1:5に希釈します。</td></tr><tr><td>ULTRA LCS</td><td>Ventana医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>650-210</td><td>IHCおよびISH反応の蒸発を防ぐために、水性試薬と空気との間のバリアとして使用される希釈済み(すぐに使用できる)カバースリップ溶液</td></tr><tr><td>反応緩衝液(10x)</td><td>ベンタナ医療システム、アリゾナ州ツーソン、米国</td><td>950-300</td><td>IHCおよびISH中の染色ステップ間のスライドをすすぐためのトリスベースの緩衝液(pH 7.6 &plusmn; 0.2)。1:10に希釈します。</td></tr><tr><td>ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>950-223</td><td>IHCおよびISH中の組織サンプルの処理における前処理ステップ。すぐに使用できます。</td></tr><tr><td>ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>950-224</td><td></td></tr><tr><td>ultraView Silver Wash II</td><td>Ventana medical system, Tucson, AZ, USA</td><td>780-003</td><td>Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU</td><td>RM 2255</td><td>Automated rotary microtome</td></tr><tr><td>Multistainer</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU</td><td>ST 5020</td><td>Workstation for automated staining and coverslipping</td></tr><tr><td>Minicore 1</td><td>Alphelys, Plaisir, France, EU</td><td>00-MICO-1</td><td>Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software</td></tr><tr><td>Aperio ScanScope CS2</td><td>Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU</td><td>K080254</td><td>画像キャプチャデバイス - デジタルパソロジースキャナー</td></tr><tr><td>Tissue-Tek IIIユニカセット</td><td>Sakura Finetek Europe B.V</td><td>4135</td><td>Cassette</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold</td><td>Sakura Finetek Europe B.V</td><td>7055</td><td>Stainless-Steel base metal mold</td></tr></tbody></table>

乳癌の her2 遺伝子増幅の不均一性を評価する高スループット スクリーニング プラットフォームを構築

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

ひと上皮成長因子受容体 2 (HER2) に対して目標とされた療法は HER2 陽性乳癌患者の結果根本的に変わった。ただし、少数の場合では、主要な臨床的課題を生成する HER2 陽性細胞の不均質分布が表示されます。日には、特性評価および大規模なコホートでHER2異種遺伝子増幅の定量化の信頼性と標準化されたプロトコルは提案されていません。複数の乳癌のさまざまな地形部分に HER2 状況を同時に把握する高スループット方法論を紹介します。特に、強化されたティッシュのマイクロ アレイ (TMAs) 腫瘍のターゲット マッピングを組み込むを作成する検査法を示します。TMA のすべてのパラメーターは、具体的には銀の in situハイブリダイゼーション (SISH) ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 乳房組織のために最適化されています。(すなわちER、PR、キ67、HER2) 予後と予測バイオ マーカーの免疫組織化学的解析自動化されたプロシージャを使用して実行してください。カスタマイズされた SISH プロトコルは、異なる固定、処理、および保管の手順を受けた複数の組織間で高品質の分子分析を許可するように実装されています。本研究では、証拠の原理特定の DNA シーケンスを効率的かつコスト効果の高い方法を使用して同時に複数の明瞭な地形区域のローカライズと異質加工乳癌できるを提供します。

全体的に、444 侵襲乳房癌っぽい分析用に最適化された 15 TMAs に組み込まれていた。サンプリング 2,664 スポット、2,651 (99.5%) 以前に選択したエリアの代表、以降の解析に従うと考え。内腫瘍の不均一性は腫瘍の異なる地形エリアの HER2 陽性クローンの不均質分布の特定のフォーカスを持つ IHC と SIH、により決定しました。表 3は、異なる histotypes 内 ER、PR、キ67、HER2 の状態に焦点を当てて、分析例の生物学的特徴を示しています。特に、例の 18% が HER2 陽性細胞を表示する発見された &gt; 腫瘍細胞の 10% したがって HER2 陽性評価特性と照合し、。興味深いことに、この値は、報告率の範囲の HER2 陽性乳癌の低い方の端に近いです。その一方で、HER2 の状態だった HER2 陽性、HER2 陰性乳がん (図 3表 4)、乳癌が非常に異質の病気である概念を提供するさらなる信憑性の...

HER2 陽性細胞の不均質分布は、乳癌のサブセットに観察することができ、臨床のジレンマを生成します。信頼性が高く、コスト効率の高いプロトコルを定義し、定量化、HER2 内腫瘍遺伝的異質加工乳癌の大規模な一連の不均一性を比較を紹介します。

乳癌の HER2 遺伝子増幅の不均一性を評価する高スループット スクリーニング プラットフォームを構築

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

この検査手順の全体的な目標は、ハイスループットの銀in situハイブリダイゼーションを使用して、一連の不均一に処理された乳がんにおけるHER2腫瘍内遺伝的不均一性を同時に定義、定量化、および比較することです。この方法は、病理学アーカイブから取得された症例の大規模なコホートであるHER2遺伝子増幅の不均一性の研究など、乳がんの翻訳と研究の主要な選択に対処するのに役立ちます。この手法の主な利点は、複数の不均一に処理された乳がんのさまざまなトポグラフィー領域にわたってハイスループットのHER2統合失調症分析が可能になることです。一般に、in situハイブリダイゼーションに不慣れな個人は、レトロスペクティブ研究は通常、異なる固定、処理、および保存手順を受けたアーカイブサンプルの分析を必要とするため、苦労するでしょう。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、2003年以降、施設のデータベースからすべての乳がんを再分類することを決定したときでした。この手順を実演するのは、当研究室の技術者であるGiulia Ercoliです。このプロトコルは、テキストプロトコルに記載されている患者と組織標本を選択することから開始します。新しいスプレッドシート ファイルを作成して開き、各ケースの個別の領域のレコードを組み込みます。症例ID、ブロックID、エリアID、組織タイプ、トポグラフィー、形態、バイオマーカーの状態、および利用可能なその他すべての免疫組織化学的特徴について、別々の列を含めます。TMA プロジェクトを作成します。PMA 受信者ブロックを定義するには、ファイル、新規、ブロックに移動します。最初のフィールドをクリックして入力し、パラフィンブロックの寸法を入力します。次に、ファイル、新規、組織配列に移動して、組織配列プロジェクトを作成します。インポートアイコンをクリックし、以前に作成した受信者ブロックのテンプレートファイルを選択します。「次へ」をクリックします。次に、丸いボタンをクリックして、スポットサイズとして1ミリメートルを選択します。スポット間隔として、隣接するスポットの 2 つの中心間のスペースである 500 ミクロンを選択します。次に、電卓のアイコンをクリックして、作成されたスポットの総数(231)を計算します。次に、グリッドとサブグリッドを作成するために、定義ボタンをクリックします。8 列と 15 列、および中央線を削除します。向きのためにライン1の3つのスポットを維持します。最終的なマップには、合計183のスポットが含まれている必要があります。組織タイプのリストを定義するには、ファイル、新規、組織タイプのリストに移動します。次に、ファイル、新規、ブースター プロジェクトに移動してプロジェクトを定義します。次に、アクセプターブロックを準備します。洗浄した金型に伸縮性のあるパラフィンを摂氏65度で充填します。パラフィンブロックをフィルム温度で一晩、金型内で冷まします。翌日、金型からパラフィンブロックを抽出します。自動アレイまたは半自動アレイアーを使用して TMA を構築するには、まずアレイアーをオンにし、次にアレイアー カルーセルにアクセプター ブロックを挿入します。矢印キーを使用してレーザー光を移動し、受信者ブロックのパラフィンの左上端に位置合わせすることで、各受信者ブロックの開始位置を定義します。[次へ]をクリックし、垂直方向の配置についても繰り返します。もう一度 [次へ] をクリックすると、以前に定義した受信者ブロックの座標に穴が自動的に作成されます。パンチを空にします。ドナーブロックをサンプリング用に配置し、以前にアノテーションされた対象領域から組織コアを取り出します。ドナー組織コアをレシピエントブロックの穴に挿入します。次に、アレイからドナーブロックを取り外します。TMA が完了するまで、これらの手順を繰り返します。新しく生成されたTMAブロックの組織面を滅菌ブランクスライドに置き、摂氏45度のラボオーブンに5分間置きます。スライド上のブロックを5秒間静かに押して、組織のコアを平らにします。1回、合計2回繰り返します。次に、TMA組織表面を65°Cの弾性パラフィンの薄層で覆います。TMAブロックを室温で2時間放置します。最後に、TMAブロックを摂氏4度で24時間移してから、テキストプロトコルに記載されている組織化学および免疫組織化学分析を行います。TMAスライドをセットして、摂氏60度で10分間分析します。次に、免疫ステイナー装置とソフトウェアを起動します。ホーム ビューで、プロトコル ボタンをクリックし、プロトコルの作成/編集 をクリックします。デュアル ISH カクテル手順を選択して、基本テンプレートを変更します。ボックスリストで旗を立て、温度を摂氏63度に20分間設定します。次に、脱パラフィン化にフラグを立てます。ボックス リストの次のフラグ セル条件付け。次に、細胞コンディショニングCC2にフラグを立て、温度を摂氏86度、インキュベーション時間を4分に設定します。マイルドなCC2に8分間、標準に12分間、8分間延長します。ボックスリストでISH-Protease 3にフラグを立て、インキュベーション時間を16分に設定します。プローブのHER2ジニトロフェニルと17番染色体ジゴキシゲニンを選択します。16分間インキュベートした後、変性を80°Cで20分間セットします。プローブのインキュベーション時間を6時間に設定します。次に、SISH マルチマーのインキュベーション時間を 32 分に設定します。クロム酸銀とインキュベーション時間を4分に設定します。次に、赤色のマルチマーインキュベーション時間を24分に設定します。赤色クロメートとインキュベーション時間を8分に設定します。次に、ボックスリストで対比染色にフラグを立て、ヘマトキシリン2を選択し、インキュベーション時間を8分に設定します。ボックスリストでポスト対比染色にフラグを立て、ブルーイング試薬を選択し、インキュベーション時間を4分に設定します。最後に、HER2の統合失調症解析を行います。HER2 染色体計計プローブ 17 比が 2.0 以上で、平均 HER2 コピー数が細胞あたり 4.0 シグナル以上の場合、HER2 遺伝子増幅を陽性と評価します。HER2 染色体計数プローブ 17 比が 2.0 未満で、平均 HER2 コピー数が細胞あたり 4.0 シグナル未満である場合は、陰性として評価します。ここに示されているのは、HER2不均一性乳がんの銀in situハイブリダイゼーション分析を示す代表的な顕微鏡写真です。このパラダイム的な例では、特別なタイプではない高悪性度浸潤性乳がんの2つの異なる領域は、黒い点で視覚化されたHER2遺伝子増幅の点で異なる結果を示し、赤い点として視覚化されたセントロメア列挙プローブ17と比較されます。特に、腫瘍コアに属し、サイトケラチン7の不規則染色パターンを示す1つの領域はHER2増幅され、浸潤フロントの1つのスポットフロントは野生型のHER2パターンを示しました。このビデオを見れば、不均一に処理された複数の乳がんを組み込んだ組織標識アレイの読解可能な統合失調症解析の実施方法について十分に理解できるはずです。一度習得すれば、このテクニックはケース選択から2営業日で行うことができます。この方法は乳がんに最適化されていますが、胃がんなど、HER2の不均一性が重要な他の種類のがんにも適用できます。この手法の意味は、HER2 が大規模な一連の乳がんの複数の地形領域を包括的にマッピングするために設計されているため、HER2 の単純な評価にまで及びます。この手順に参加するときは、TMAブロックに亀裂が入らないようにすることが重要です。パラフィンのわずかな亀裂でさえ、in situハイブリダイゼーションの品質、再現性、および全体的な明瞭さを示唆しています。この手順に続いて、乳がんのプロテオミクス、特に腫瘍内および腫瘍間の不均一性に関する追加の質問に答えるために、MALDI質量分析イメージングを実行できます。TMAパンチやホットパラフィンワックスでの作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは常に使い捨てのニトリル手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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学ぶ高スループット銀インプローブハイブリダイゼーションを用いた乳癌HER2遺伝子増幅不均一性の定量化手法。病理アーカイブ由来の多数検体を効率的に解析し、腫瘍内異質性を評価する信頼性の高いスクリーニングプラットフォームを構築します。

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