乳癌の HER2 遺伝子増幅の不均一性を評価する高スループット スクリーニング プラットフォームを構築

この検査手順の全体的な目標は、ハイスループットの銀in situハイブリダイゼーションを使用して、一連の不均一に処理された乳がんにおけるHER2腫瘍内遺伝的不均一性を同時に定義、定量化、および比較することです。この方法は、病理学アーカイブから取得された症例の大規模なコホートであるHER2遺伝子増幅の不均一性の研究など、乳がんの翻訳と研究の主要な選択に対処するのに役立ちます。この手法の主な利点は、複数の不均一に処理された乳がんのさまざまなトポグラフィー領域にわたってハイスループットのHER2統合失調症分析が可能になることです。

一般に、in situハイブリダイゼーションに不慣れな個人は、レトロスペクティブ研究は通常、異なる固定、処理、および保存手順を受けたアーカイブサンプルの分析を必要とするため、苦労するでしょう。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、2003年以降、施設のデータベースからすべての乳がんを再分類することを決定したときでした。この手順を実演するのは、当研究室の技術者であるGiulia Ercoliです。

このプロトコルは、テキストプロトコルに記載されている患者と組織標本を選択することから開始します。新しいスプレッドシート ファイルを作成して開き、各ケースの個別の領域のレコードを組み込みます。症例ID、ブロックID、エリアID、組織タイプ、トポグラフィー、形態、バイオマーカーの状態、および利用可能なその他すべての免疫組織化学的特徴について、別々の列を含めます。

TMA プロジェクトを作成します。PMA 受信者ブロックを定義するには、ファイル、新規、ブロックに移動します。最初のフィールドをクリックして入力し、パラフィンブロックの寸法を入力します。

次に、ファイル、新規、組織配列に移動して、組織配列プロジェクトを作成します。インポートアイコンをクリックし、以前に作成した受信者ブロックのテンプレートファイルを選択します。「次へ」をクリックします。

次に、丸いボタンをクリックして、スポットサイズとして1ミリメートルを選択します。スポット間隔として、隣接するスポットの 2 つの中心間のスペースである 500 ミクロンを選択します。次に、電卓のアイコンをクリックして、作成されたスポットの総数(231)を計算します。

次に、グリッドとサブグリッドを作成するために、定義ボタンをクリックします。8 列と 15 列、および中央線を削除します。向きのためにライン1の3つのスポットを維持します。

最終的なマップには、合計183のスポットが含まれている必要があります。組織タイプのリストを定義するには、ファイル、新規、組織タイプのリストに移動します。次に、ファイル、新規、ブースター プロジェクトに移動してプロジェクトを定義します。

次に、アクセプターブロックを準備します。洗浄した金型に伸縮性のあるパラフィンを摂氏65度で充填します。パラフィンブロックをフィルム温度で一晩、金型内で冷まします。

翌日、金型からパラフィンブロックを抽出します。自動アレイまたは半自動アレイアーを使用して TMA を構築するには、まずアレイアーをオンにし、次にアレイアー カルーセルにアクセプター ブロックを挿入します。矢印キーを使用してレーザー光を移動し、受信者ブロックのパラフィンの左上端に位置合わせすることで、各受信者ブロックの開始位置を定義します。

[次へ]をクリックし、垂直方向の配置についても繰り返します。もう一度 [次へ] をクリックすると、以前に定義した受信者ブロックの座標に穴が自動的に作成されます。パンチを空にします。

ドナーブロックをサンプリング用に配置し、以前にアノテーションされた対象領域から組織コアを取り出します。ドナー組織コアをレシピエントブロックの穴に挿入します。次に、アレイからドナーブロックを取り外します。

TMA が完了するまで、これらの手順を繰り返します。新しく生成されたTMAブロックの組織面を滅菌ブランクスライドに置き、摂氏45度のラボオーブンに5分間置きます。スライド上のブロックを5秒間静かに押して、組織のコアを平らにします。

1回、合計2回繰り返します。次に、TMA組織表面を65°Cの弾性パラフィンの薄層で覆います。TMAブロックを室温で2時間放置します。

最後に、TMAブロックを摂氏4度で24時間移してから、テキストプロトコルに記載されている組織化学および免疫組織化学分析を行います。TMAスライドをセットして、摂氏60度で10分間分析します。次に、免疫ステイナー装置とソフトウェアを起動します。

ホーム ビューで、プロトコル ボタンをクリックし、プロトコルの作成/編集 をクリックします。デュアル ISH カクテル手順を選択して、基本テンプレートを変更します。ボックスリストで旗を立て、温度を摂氏63度に20分間設定します。

次に、脱パラフィン化にフラグを立てます。ボックス リストの次のフラグ セル条件付け。次に、細胞コンディショニングCC2にフラグを立て、温度を摂氏86度、インキュベーション時間を4分に設定します。

マイルドなCC2に8分間、標準に12分間、8分間延長します。ボックスリストでISH-Protease 3にフラグを立て、インキュベーション時間を16分に設定します。プローブのHER2ジニトロフェニルと17番染色体ジゴキシゲニンを選択します。

16分間インキュベートした後、変性を80°Cで20分間セットします。プローブのインキュベーション時間を6時間に設定します。次に、SISH マルチマーのインキュベーション時間を 32 分に設定します。

クロム酸銀とインキュベーション時間を4分に設定します。次に、赤色のマルチマーインキュベーション時間を24分に設定します。赤色クロメートとインキュベーション時間を8分に設定します。

次に、ボックスリストで対比染色にフラグを立て、ヘマトキシリン2を選択し、インキュベーション時間を8分に設定します。ボックスリストでポスト対比染色にフラグを立て、ブルーイング試薬を選択し、インキュベーション時間を4分に設定します。最後に、HER2の統合失調症解析を行います。

HER2 染色体計計プローブ 17 比が 2.0 以上で、平均 HER2 コピー数が細胞あたり 4.0 シグナル以上の場合、HER2 遺伝子増幅を陽性と評価します。HER2 染色体計数プローブ 17 比が 2.0 未満で、平均 HER2 コピー数が細胞あたり 4.0 シグナル未満である場合は、陰性として評価します。ここに示されているのは、HER2不均一性乳がんの銀in situハイブリダイゼーション分析を示す代表的な顕微鏡写真です。

このパラダイム的な例では、特別なタイプではない高悪性度浸潤性乳がんの2つの異なる領域は、黒い点で視覚化されたHER2遺伝子増幅の点で異なる結果を示し、赤い点として視覚化されたセントロメア列挙プローブ17と比較されます。特に、腫瘍コアに属し、サイトケラチン7の不規則染色パターンを示す1つの領域はHER2増幅され、浸潤フロントの1つのスポットフロントは野生型のHER2パターンを示しました。このビデオを見れば、不均一に処理された複数の乳がんを組み込んだ組織標識アレイの読解可能な統合失調症解析の実施方法について十分に理解できるはずです。

一度習得すれば、このテクニックはケース選択から2営業日で行うことができます。この方法は乳がんに最適化されていますが、胃がんなど、HER2の不均一性が重要な他の種類のがんにも適用できます。この手法の意味は、HER2 が大規模な一連の乳がんの複数の地形領域を包括的にマッピングするために設計されているため、HER2 の単純な評価にまで及びます。

この手順に参加するときは、TMAブロックに亀裂が入らないようにすることが重要です。パラフィンのわずかな亀裂でさえ、in situハイブリダイゼーションの品質、再現性、および全体的な明瞭さを示唆しています。この手順に続いて、乳がんのプロテオミクス、特に腫瘍内および腫瘍間の不均一性に関する追加の質問に答えるために、MALDI質量分析イメージングを実行できます。

TMAパンチやホットパラフィンワックスでの作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは常に使い捨てのニトリル手袋を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。