昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現

この熱ショック誘発タンパク質発現システムの全体的な目標は、昆虫細胞内の2つの潜在的に機能的に拮抗するタンパク質におけるタンパク質の抗アポトーシス活性を評価することです。この方法は、バイオテクノロジーやプロテオミクスにおける候補タンパク質の機能と活性、例えば、その抗アポトーシス活性やタンパク質相互作用に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、遺伝子発現のタイミングが熱ショック誘導によって制御されることです。

したがって、この方法はタンパク質の機能状態に関する洞察を提供することができます。また、哺乳類のタンパク質発現など、他のシステムにも適用できます。このプロトコルで使用されるSpodoptera frugiperda、またはSf9昆虫細胞は、摂氏28度の25平方センチメートルの細胞培養フラスコで細胞培養培地で増殖します。

細胞培養フラスコを振って、細胞をフラスコから取り外します。次に、光学顕微鏡でチェックして、細胞の約80%が剥離していることを確認します。細胞懸濁液の50%を新しい25平方センチメートルの細胞培養フラスコに移し、細胞を室温で15分間接着させます。

15分後、培地を5ミリリットルの新鮮な培地と交換し、摂氏28度のインキュベーターで成長させます。細胞の増殖にもよりますが、2〜3日ごとに細胞を継代します。Sf9細胞を採取する前に、光学顕微鏡で細胞をチェックし、細菌や他の微生物による汚染がないことを確認することが重要です。

Sf9細胞を採取するには、培養フラスコを振って細胞を切り離し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。P10ピペットを使用して、細胞懸濁液の10マイクロリットルを血球計算盤に移し、光学顕微鏡下で細胞数をカウントします。24ウェルプレートの各ウェルに10〜5番目の細胞を3回プレートし、室温で15分間放置する。

15分後、メディウムを0.5ミリリットルのメッキメディウムと交換します。細胞トランスフェクションリージェントを調製します。トランスフェクションごとに、8マイクロリットルの細胞トランスフェクション試薬を100マイクロリットルの無血清細胞培養培地で希釈し、1秒間ボルテックスして混合します。

この研究では、バキュロウイルス遺伝子の3つの異なる切断、アポトーシスの阻害剤3、またはIAP3が、ショウジョウバエの熱ショック70プロモーター、完全長IAP3、RINGドメインを欠く切断、およびBIRドメインを欠く切断の制御下で発現されます。各プラスミドDNAを2マイクログラムを100マイクロリットルの無血清細胞培養培地に加え、1秒間ボルテックスして混合します。ポジティブコントロールも準備します。

希釈したプラスミドDNAと希釈した細胞トランスフェクション試薬を組み合わせ、ボルテックスして混合します。室温で30分間インキュベートします。P1000ピペットを使用して、各DNAトランスフェクション試薬混合物の210マイクロリットルを細胞に滴下します。

摂氏28度で5時間インキュベートします。5時間後、めっき培地を0.5ミリリットルの細胞培養培地と交換し、24ウェルプレートをテープで密封します。28度でインキュベートします。

翌日、プレートを42°Cの水浴に30分間浮かせてタンパク質発現を誘導するヒートショック。30分後、24ウェルプレートを摂氏28度のインキュベーターに戻します。タンパク質の発現は、その後、テキストプロトコルに記載されているように、ウェスタンブロットによって確認されます。

遺伝子による細胞アポトーシスを調べるには、まず先に示したようにSf9細胞を作製します。次に、前と同じ方法で細胞をトランスフェクションしますが、各トランスフェクション反応にアポトーシス誘導遺伝子を含むプラスミドを1マイクログラム含めます。28°Cで5時間インキュベートし、培地を交換して16時間インキュベートします。

トランスフェクションした細胞を摂氏42度で30分間熱ショックします。細胞生存率アッセイを行う前に、細胞を摂氏28度で5時間インキュベートします。化学的に誘導された細胞アポトーシスの場合、6ウェルプレートの各ウェルに6つのSf9細胞に1回10回プレートを播種します。

室温で15分間放置した後、培地を1ミリリットルのめっき用メディウムと交換します。各プラスミドDNAの4マイクログラムで細胞をトランスフェクションします。5時間後、めっき培地を1ミリリットルの細胞培養培地と交換し、細胞を28°Cで16時間インキュベー

その後、摂氏42度で30分間ヒートショックを受けます。細胞を摂氏28度で5時間インキュベートします。次に、トランスフェクションした細胞をアクチノマイシンDで処理して、アポトーシスを誘導します。

細胞生存率アッセイを実施する前に、摂氏28度で16時間インキュベートします。この手順は、処理した細胞を洗浄することから始めます。各ウェルから培地を取り出し、1ミリリットルのPBSを加え、1分間放置します。

この方法で細胞をPBSで3回洗浄します。各ウェルの細胞を04%トリパンブルーを含むPBS1ミリリットルで再懸濁し、室温で3分間染色します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロチューブに移します。

トリパンブルー染色細胞懸濁液10マイクロリットルを血球計算盤に移し、光学顕微鏡で生存可能な無傷の細胞をカウントします。最後に、テキストプロトコルで説明されているように統計分析を実行します。Lymantria xylina MNPV由来のIAP3の全長と2回の切断をSf9細胞で過剰発現させ、タンパク質発現を確認するために細胞ライセートに対してウェスタンブロットを行いました。

抗アポトーシスタンパク質Ac-P35は、ポジティブコントロールとして含まれていました。すべてのタンパク質は、熱ショックの1時間後または5時間後にトランスフェクションされた細胞で検出でき、5時間後には発現が高くなります。このシステムは、抗アポトーシス活性の評価に適合させることができます。

遺伝子誘導性細胞アポトーシスについては、アポトーシス誘導剤Drosophila Reaperを標的遺伝子プラスミドコンストラクトと同時トランスフェクトしてSf9細胞に取り込み、その後、熱ショックを受けて遺伝子発現を活性化しました。ベクターDrosophila Reaperと比較して、ポジティブコントロールは高い抗アポトーシス活性を示し、生存率の最大80%に達しました。他のコンストラクトは、抗アポトーシス活性に対してさまざまな効果を示しました。

化学的に誘導された細胞アポトーシスについては、1つのコンストラクトのみをSf9細胞にトランスフェクションし、ヒートショックの5時間後にアクチノマイシンDを添加しました。ポジティブコントロールまたはネガティブコントロールと比較して、他のコンストラクトは抗アポトーシス活性にさまざまな効果を示しました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2〜3日で完了します。

この手順を試みる際には、層流での細胞培養の操作ルールに従い、細胞の状態をこまめに確認することを忘れないようにすることが重要です。この手順に続いて、昆虫細胞で共発現する2つのタンパク質間に相互作用があるかどうかなど、追加の質問に答えるために、共免疫沈降などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、バイオテクノロジーの分野の研究者が動物や微生物のタンパク質機能を探求する道を開きました。

このビデオを見れば、このシステムを使用して外来タンパク質を発現する方法や、昆虫細胞で機能的に拮抗する可能性のあるタンパク質を評価する方法について十分に理解できるはずです。アクチノマイシンDなどの一部の化学物質の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に手袋の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。