Name: 下大静脈狭窄: 深部静脈血栓症のマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: 学ぶ マウス下大静脈狭窄術による深部静脈血栓症モデルの作成方法。血流障害を模倣し血栓形成メカニズムを解析する手術技術を解説。D-dimer上昇で血栓活性を評価可能な有用な研究モデルです。

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この作品は、英国心臓財団 (PG/13/60/30406) およびバーミンガムの大学によって支えられました。

動物のすべてのプロシージャは、動物福祉倫理的な調査機関および英国ホーム オフィス (イギリス、プロジェクト ライセンス 40/3745) によって承認されました。C57BL/6 背景、8-12 週齢、体重 19 25 g、両方の性別の上でマウスを使用します。
1. 動物の麻酔
<ol>
	<li>誘導室にマウスを置き、5% 100% 酸素とイソフルランの混合物によって麻酔を誘導します。使用マウスは完全に移動を停止するまでの 0.5 L/min の流量を待つと呼吸の頻度は稀になります。</li>
	<li>商工会議所からマウスを外し、電気クリッパーと腹部を剃る。腹腔内の汚染を避けるために可能な限り徹底的に腹部から髪を削除します。</li>
	<li>仰臥位でマウスを置き、マウスの鼻に麻酔システムにリンクされている円錐を配置します。2-3% (正確な割合が動物から動物を異なる場合) にイソフルランの割合が低下します。動物は寝ているその呼吸あえぎ通常、回避よりも低くされていることを確認します。あえぎが発生した場合、0.5% イソフルランの割合を減らします。
	<ol>
		<li>適切な anesthetization を確認し、それが否定的な場合にのみ手術を開始するペダルの反射を確認します。乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>適用抗殺菌液 (1% ヒビテン) マウスの腹部とワイプ滅菌綿を使用して領域は、手術部位 (例えば、内側から循環的に外側へ) の潜在的な再汚染を除く方法で芽します。3 回繰り返します。</li>
</ol>
2. 下大静脈狭窄とマウスの回復のアプリケーション
注: すべての楽器同様 (綿棒、ガーゼ、生理食塩水等) の材料として手術領域の接触を滅菌する必要があります。オペレーターは、手術前にスクラブし、プロシージャの間に滅菌手袋とガウンを着用する必要があります。顕微鏡のハンドルは、滅菌アルミホイルでラップされます。
<ol>
	<li>手術前と全体の実験期間中に、マウス抗痛み治療を与えます。たとえば、ブプレノルフィン 0.1 mg/kg 皮下 30 分前に手術、その後 12 時間毎まで動物を安楽死を使用します。この方法では血栓症は無菌性炎症に同様に成長するとは、麻酔前投薬として抗炎症薬を使用しないでください。</li>
	<li>滅菌ドレープとマウスをカバーし、外科サイトを公開するドレープに穴をあけます。はさみを使って、腹部正中線、胸骨からダウン 1.5 cm に沿って切開を行います。綿棒を使用して、マウスの左側に腸を外在、乾燥を避けるために暖かい (37 ° C) を生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで覆います。</li>
	<li>下大静脈と左腎静脈と下大静脈の融合のサイトから尾側方向の側枝 (場合があります 0、1、またはそれらの 2) を特定します。として可能な限り下大静脈に近い不活性プロレン縫合を 7-0 のすべての目に見える側面枝を縛る。
	<ol>
		<li>鉗子と側枝ではなく、直接片手に鉗子とそれらを囲む脂肪質のティッシュを持ってそれらを引き出すし、一方で鉗子で枝の下にトンネルを作るを保持しないでください。背面枝は閉じないでください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鉗子で周囲の組織を持ち、プルを下大静脈と左と下大静脈、大動脈正確下大静脈と左腎静脈の間の角度で小さい区域の張力を作り出します。下大静脈も 2-3 mm 以下 (尾側方向) から大動脈を区切ることは事実上不可能であることを考慮します。</li>
	<li>右手を大動脈と下大静脈の穴鉗子先端の左右逆の動きを使用してください。覚えておいてより多くの動きを作った、容器の損傷の可能性が高く。理想的には、3 - 5 の動きの数を最小化しようとします。</li>
	<li>約 2 cm の長さの 7-0 不活性プロレン縫合の部分を準備します。演算子の左側下大静脈に近くでマウスの腹腔内にそれを配置します。</li>
	<li>下大静脈と左もう一度プルします。下大静脈の反対側に、ヒントが表示される大動脈と下大静脈間の穴にあなたの右の鉗子の先端を挿入します。貫通穴 (図 3A) 縫合糸とそれを引き戻すを取る。</li>
	<li>縫合糸で仮結び目を作るが、終了しません。結び目にフックとして曲がって 30 G 針 (「スペーサー」) を配置して今閉じます (図 3B)。</li>
	<li>スペーサー (図 3C) を削除します。</li>
	<li>綿と腹腔内に腸の芽、それ均等にそれらを配布を返します。</li>
	<li>連続的なループを使用して 6-0 vicryl の縫合糸で腹膜を閉じます。結び目として最初と最後のループを閉じます。</li>
	<li>金属のステープルを使用して近い皮。</li>
	<li>マウスを暖かい (37 ° C) の 0.5 ml 注入有機物の液体のバランスを回復する皮下グルコースを生理食塩水。</li>
	<li>暖かい (25 ° C) 商工会議所や部屋で個々 のケージにマウスを置くし、食べ物を入れてケージの中の水をゲルします。マウスは完全に (通常、約 1 h) 回復までを観察します。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここでは、血流歪み、深部静脈血栓症の主要なトリガー因子を模倣した下大静脈狭窄のプロトコルが表示されます。48 時間以内 c57bl/6 マウスの 65-100%、25-50 %2-6 h6,8,23内でマウスの血栓症、下大静脈狭窄を誘導する (ブリル、未発表データ、2016)。メソッドの主要な制限は、血栓のサイズ24 (図 4)、短期 (6 h) と長期 (48 h) 下大静脈狭窄後観察の変動です。そのような変動の理由 (ことを考えると、スペーサーなど、条件の同じ麻酔等が使用される) あいまいなままですが、1 つはその解剖学的推測可能性がありますマウス (例えば、幅下大静脈、数、サイドとバックの両方の位置の間の変化枝) この現象の根底にあります。血栓サイズの可変性は主な結果血栓症有病率 (血栓マウスの %) をなります。血栓症の有病率は、分割表とフィッシャーの正確確率検定を使用して比較できます。例外は、ポドプラニン抑制抗体の注射が7が観察された後に減らされた血栓が同じ血栓症有病率とサイズ実験の 1 つでした。
このメソッドは、静脈血栓症の開始を検討するときに便利です。それは血栓症に最終的につながる細胞の募集など、血管壁の初期イベントを調査することができます。薬のプロまたは反 thrombotic 効果は、プライマリの読み出しをされている血栓症有病率とこのモデルを使用して評価できます。48 h の狭窄は、するプロトロンビンの表現型が予想される場合、6 h 狭窄を使用できるに対し、抗血栓性の表現型を明らかにするのに適用されます。血栓と周囲の下大静脈壁の組織学的解析を行うもできます。
結紮または特許左サイドの枝かどうかすべき質問は開いたままになります。1 つのグループは、側枝の結紮は血栓のサイズを増加せず、側枝下大静脈結紮サイトに 1.5 mm 厚よりも近くの場所は劇的に血栓開発25を損なうことを示しています。側枝の閉鎖可能性がありますそれらの血管内皮細胞障害を誘発しても手術26の時間を増やします。私たちの手で側枝の閉鎖の欠如大幅に減少 (48 h 狭窄後 10-30% に血栓症の有病率ブリル、未発表)、したがって我々 はすべての目に見える側面枝を縛る。
理想的には、マウス、同じ背景にも、さまざまなソースから可能性がありますがあるわずかに異なる血栓症有病率としては、濾胞を使用ください。(たとえば、生化学的な) 任意のパラメーターに DVT 自体の影響を検討すると、偽手術動物が使わなければなりません。Sham 群は、同じ手術を受けるが、下大静脈を結紮が緩く閉じられ、狭窄を生じることがなく残っています。
このプロトコルの最も頻繁な間違い (重要なステップ) 大動脈、それは出血の結果は正確に若干低くはなりますが、船舶間の角度で下大静脈を分離する努力であります。大量の出血が発生すると、マウスの良い回復なりそう、実験を停止し、動物を安楽死させるをお勧め。通常、マウスも回復、ケージ内を移動し、重量を大幅に失うことはありません。男性と女性の両方の 20 グラム以上のマウスを使用してお勧めし、戦闘および傷害を避けるために実験終了時まで手術後個々 のケージに動物 (特に男性) を維持します。それは、雄マウスが女性27より大きい血栓を作り出す深部静脈血栓症の別の (電解) モデルで報告されています。我々 のデータの分析は雌雄マウス (ブリル、未発表) の血栓症有病率の相当な違いを発表していません。したがって、研究者は、男女両方のマウスで下大静脈狭窄症モデルを用いて実験を行うよう奨励されます。
縫合やステープルを解き明かすことが否定できない特に長い実験 (週そして長い)。このように、マウスは縫合の整合性のために特別 1 日少なくとも 2 回チェックする必要があり、血のトレース、床敷の外観に特別な注意を与えられるべき。
その他の動物のモデルのような下大静脈狭窄は人間への翻訳の面で限界があることに留意。たとえば、人間の深部静脈血栓症は静脈弁内部に生じるに対し、マウス IVCs にはバルブはありません。また、人間は、静脈の血流の重要なメカニズム加速されて筋肉ポンプと脊髄縦書きをあります。対照的に、マウス脊髄横向きには役割の心臓に血液を返すを支える筋肉ポンプがあります。ひと疾患へのマウスのデータを変換するとき、これらの制限を考慮する必要があります。

深部静脈血栓症 (DVT) 深部静脈血栓症の開発は、通常 (しかしだけでなく) の足。肺塞栓症と組み合わせて (PE; 一緒に静脈血栓塞栓症、静脈血栓塞栓症として示される) それは年間約 90万人で開発し、深刻な健康問題と経済問題を抱えて1,2を表します。PE、深部静脈血栓症の合併症は、血栓が元の場所から戸建を取得し、呼吸不全と死を引き起こすことができる肺に達するときに発生します。静脈血栓塞栓症による死者数は、エイズ、乳房癌や交通事故、結合された3から死亡率を超えています。
以外にも深部静脈血栓症を引き起こす主要な要因の理由を知られている癌や外傷など、移動4、5の欠如です。手術 (特に整形外科)、麻痺、長距離路線やその他の理由からこれがあります。静脈の血流は筋ポンプに依存し、したがって血液の停滞で手足固定結果フロー静脈弁の血栓症に 。記載方法の目的は、このような血液流れ歪み6,7を要約することです。下大静脈 (IVC) の流量制限人間血栓6の構造のような人間の静脈弁の血栓の形成の結果作成された条件を模倣しています。血栓の大部分は赤く、赤い血球、フィブリン、血小板の結合で構成されています。血栓は、小さな「ザンのライン」を人間静脈血栓で説明に似ている (図 1)、血小板の濃縮「白い部分」を持っています。血栓の両方の部分含むも好中球8、将来血栓6,9サイトで募集する最初の細胞の間であります。赤い部分の好中球は、白い部分に好中球網8は欠けているように見えるに対し好中球細胞外トラップ (網) を放出します。同様に人間の深部静脈血栓症にマウスでの血栓症は血中 D ダイマー レベル (図 2) を伴います。低分子量ヘパリン (エノキサパリン) 患者における深部静脈血栓症予防のため使用はまたマウスの血栓症を防ぐ。この方法の重要な利点は、人間の深部静脈血栓症10の特徴である内皮侵食9の不在です。この機能により、下大静脈狭窄、血栓症の誘導などよりも深部静脈血栓症のより臨床的に関連するモデル塩化第二鉄、内皮細胞の侵食を誘導して血栓が血小板11,の主に成っている12,13。下大静脈完全な停滞のモデルは、いくつかのチーム14,,1516が優先されます。狭窄、容器、維持は残差流と対照をなしてうっ滞のアプリケーションは流れが完全に停止し、こうして血栓症サイトに全身投与物質のアクセシビリティを制限します。また、狭窄やうっ滞による血栓症のメカニズムが異なっているようだ: 狭窄により局所炎症の開発 (内皮、Weibel Palade 本体のコンテンツのリリース、免疫細胞の活性化と血管壁への血小板) うっ滞ではなく血栓症を誘発するようであるに対し"immunothrombosis"6,9,17の原因に基づいて、特に、組織因子とその他の凝固、線溶機構18,19,20。したがって、狭窄症、うっ血のモデルは、その機構は確かに重なる可能性がありますが、静脈血栓開発のわずかに異なる側面を反映してください。DVT21,22の電解 IVC モデル (EIM) は、血管壁を部分的にのみ遮蔽血栓を誘導します。したがって、さまざまな薬物の全身投与の血栓の成長に及ぼす影響をテストするために便利です。ただし、このモデルには、この機構の病態生理学的関連性の少なくとも議論の余地を作って電流による下大静脈壁の保全 (針の挿入) の中断と血栓症の誘導が想定しています。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6</td><td>マウス チャールズ リバー</td><td></td><td>8 - 10 週齢、性別</td></tr> は<tr><td>さみ</td><td>WPI</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>WPI</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>デュモン 5/45 鉗子</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>7-0 プロレン縫合糸</td><td>エチコン</td><td>W8725</td><td></td></tr><tr><td>6-0 ビクリル縫合</td>糸 <td>エチコン</td><td>W9981</td><td></td></tr><tr><td>綿棒ス</td><td>パー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミルスワブ滅菌&nbsp;</td><td>ミルプレッジ獣医&nbsp;</td><td>611950</td><td></td></tr><tr><td>ドレープ</td><td>クルーゼ</td><td>141765</td><td></td></tr><tr><td>グルコース生理食塩水-Aqupharm3</td><td>アニマルケア</td><td>XVD589</td><td></td></tr><tr><td>クリア H20 HydroGel 98% 滅菌水&nbsp;</td><td>Clearh2o</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>National Veterinary Supplies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 気化器</td><td>一般麻酔サービス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IsoFlo 100% W/W 吸入蒸気、液体</td><td>National Veterinary Supplies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌器 Steri350</td><td>Inotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 オリンパス SZX10</td><td>オリンポス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

下大静脈狭窄: 深部静脈血栓症のマウスモデル

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

深い静脈の血栓症 (DVT) とその壊滅的な合併症、肺塞栓症、高い死亡率に深刻な健康問題があります。静脈血栓形成のメカニズムは曖昧のまま。(例えば手術や長距離飛行後) 流動性の欠如は、深部静脈血栓症につながる主な要因の 1 つです。流動性の欠如の病態生理学的結果は、静脈弁の血流停滞です。ここでは、モデル、血栓症運転要因としてこのような流れの妨害を模倣するを説明します。このモデルでは、流量制限 (狭窄) 下大静脈 (IVC) が作成されます。48 h の IVC 内腔の約 90% の閉鎖血栓人間のそれらに構造的に類似の開発で起因します。類似: i) 血栓検索ボリュームのほとんどは赤、すなわち、iii) 裸内皮化単分子膜、iv) 血中 D ダイマー レベル、および v) 可能性を防ぐために赤血球とフィブリン、ii) 白い部分 (ザーンの行) の存在から成ります低分子ヘパリンによる血栓症です。制限には血栓と実際の変数のサイズが含まれている野生型マウスの一定割合 (0 - 35%) 血栓をもたらさないことがあります。目視および計測のほか血栓は血栓性の動態は、超音波検査などの非侵襲的技術によって視覚化が可能します。イベント (例えば血管壁細胞の募集) を直接観察に適用可能性があります短い時間ポイント (1-6 h)、生体顕微鏡血栓形成の前します。世界中の複数のチームによるこのメソッドの使用は、深部静脈血栓症発生の基本的なメカニズムを明らかにし、その予防のために有益かもしれない潜在的なターゲットを識別する可能になりました。

ここ、下大静脈の偏流による深部静脈血栓症のモデルを説明します。下大静脈狭窄症の誘導が歪みを開始し、(この場合は 48 h) でしばらくして血流の停滞による血栓、人間に似たような構造の DVT の開発血栓 (図 1A)。下大静脈内血栓の存在は視覚的に容易に検出できる (図 1B)。モデルと人間の深部静脈血栓症の重要な類似は血中 D ダイマー レベル (図 2) です。フィブリン分解産物である D ダイマーと血でのプレゼンス アクティブな血栓性プロセスが起こっていることを示唆しています。
モデルは図 3の Cのステップバイ ステップが表示されます。下大静脈は慎重に公開、下大静脈と大動脈の間の穴をあけて、縫合 (プロレン 7-0) が下大静脈の下にある穴から引っ張られます。[スペーサーが削除されます後スペーサー (30 G 針、図 3D)、上、下大静脈を縫合糸で結紮します。この手順により、約 90% の残りの 10% の特許を残して IVC 内腔の閉鎖。これにより最終的に血栓症につながる血流停滞であります。
図 4では、変数血栓サイズ モデルの主要な欠点を示しています。これらの血栓が同じ実験で得られたすべては同じ起源、年齢と同じような体重の男性マウスを野生型で実行されます。塞栓 (血栓症有病率 100%) を生産マウスのすべてのサイズは明らかに広い範囲で異なります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56697/56697fig1.jpg"> 
図 1:48 時間制限/狭窄後の代表的な血栓。(A) 典型的な血栓後 48 h 下大静脈狭窄。(赤血球濃縮) 赤と白 (血小板濃縮) 部品に注意してください。(左) と (B) を下大静脈 (右) 血栓の有無。スケール バー = 2 mm.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56697/56697fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56697/56697fig2.jpg"> 
図 2: 下大静脈狭窄後の D ダイマー上昇します。マウスは、下大静脈狭窄に服従しました。血液が示された時点で取られた、遠心分離 (2,300 × g、5 分) によって準備された 3.8% クエン酸ナトリウム、プラズマを安定化 1:9、D-ダイマー濃度は、製造元の指示に従って ELISA キットによって定められました。サークル指定 sham 群、十字架は、下大静脈狭窄を指定します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56697/56697fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56697/56697fig3.jpg"> 
図 3:マウスにおける DVT の下大静脈 (IVC) モデルの制限/狭窄症の流れ。モデルの連続段階が掲載されています。(A) 下大静脈と大動脈の間の穴をあけて、下大静脈の周りそれを縫合糸は引っ張られます。(B) 結び目はスペーサー (30 G 針) で閉じられます。(C)スペーサーを削除: マウスを閉じる前に外科医を見て最終的なビュー。黄色の破線は、下大静脈を設定します。LRV は、左腎静脈を略します。スケール バー = 0.2 mm。 (D) スペーサー (30 G 針)。スケール バー = 2 mm.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56697/56697fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56697/56697fig4.jpg"> 
図 4.血栓のサイズの変動。 マウスは、48 h 下大静脈狭窄に服従しました。血栓が同じ実験で得られたが提示します。スケール バー 2 mm.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56697/56697fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

私たちは深部静脈血栓症のマウスモデルとして下大静脈狭窄をここで記述します。このモデルは、人間の静脈血栓症の主要なトリガーの 1 つ、血流制限を繰り返します。

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

この外科的処置の全体的な目標は、下大静脈の狭窄を作成して、深部静脈血栓症の開始のための血流の歪みを模倣することです。この方法は、深部静脈血栓症の開始のメカニズムに関する静脈血栓症領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、静脈内の血栓症開始の重要なメカニズムである血流障害をシミュレートすることです。下大静脈を大動脈から分離し、これらの組織の間に穴を開けることは口頭で説明するのが難しいため、この方法を視覚的に示示することは非常に重要です。生後8〜12週の麻酔をかけた19〜25グラムのマウスの腹部を剃ることから始め、マウスを加熱パッドの仰臥位に置きます。滅菌綿棒を使用して、露出した皮膚を抗菌液で3回消毒します。つま先のつま先つまみに対する反応の欠如によって適切な鎮静レベルを確認し、手術部位に穴が開いた滅菌ドレープでマウスを覆います。解剖顕微鏡下で、腹部の正中線に沿って胸骨の下1.5センチメートルから切開し、綿棒を使用して腸を動物の左側に外部化します。腸組織を摂氏37度の生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで覆います。組織開創器を配置して切開部を拡大し、下大静脈(IVC)とその側枝を左腎静脈の尾側に配置します。鉗子を使用して、側枝を囲む脂肪組織を引き上げ、次に2番目の鉗子を使用して枝の下にトンネルを掘ります。そして、すべての側枝をIVCにできるだけ近づけて、7-0の不活性プロレン縫合糸で結紮します。鉗子で周囲の組織を保持し、IVCを上下に引っ張り、IVCと大動脈の間の小さな領域、正確にはIVCと左腎静脈の間に張力を発生させます。大動脈とIVCの間に2組目の鉗子を挿入し、鉗子を3〜5回以上開閉して穴を開けます。IVCが左腎静脈と収束する点に正確に穴を開けることが非常に重要です。左手を使って、2cmの7-0不活性プロレン縫合糸を腹腔の左側、IVCの近くに配置し、IVCを引き上げて再び左に引き上げます。大動脈とIVCの間の穴に2番目の鉗子を挿入して、先端がIVCの反対側に見えるようにし、縫合糸を穴から引き戻します。緩い暫定的な結び目を作り、フックに曲げられた30ゲージの針スペーサーを結び目に入れます。結び目を締めた後、スペーサーを取り外し、綿棒を使用して腸を腹腔に戻します。連続ループを使用して、6-0 VICRYL縫合糸で腹膜を閉じ、金属ステープルで皮膚を閉じます。マウスに0.5ミリリットルの37°Cグルコサリンを皮下注射します。次に、マウスを摂氏25度のチャンバー内の個々のケージに入れ、餌とゲル水を入れ、完全に回復するまで監視します。IVCでの狭窄の誘発は、血流の歪みと停滞を開始し、その結果、ヒトで観察される深部静脈血栓と構造的に類似した血栓が発生し、肉眼的に容易に視覚化できます。また、このIVC狭窄モデルでは、血漿中にフィブリン分解の産物であるD-ダイマーの上昇が観察され、ヒトで見られるのと同様の活性血栓形成過程が存在することが示されています。このモデルでは、ほとんどの実験動物が血栓を産生していましたが、大きな欠点は、動物間で観察される血栓の大きさにばらつきがあることです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば15分で完了できます。この技術は、その開発後、静脈血栓症の分野の研究者がマウスモデルでDVTのメカニズムを探求する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

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下大静脈狭窄: 深部静脈血栓症のマウスモデル

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