地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

この手順の全体的な目標は、地理的萎縮の大きな目の動物モデルを作成して、ヒト胚由来の網膜色素上皮細胞を眼に移植し、光干渉断層撮影法を使用してドナー細胞の統合を評価することです。この方法は、幹細胞を用いた変性疾患の治療など、再生医療の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手術環境の主な利点は、健康な細胞の無制限の供給源と、患者を対象とした手術と多くの類似点を持つ網膜下注射の手術環境です。

この技術の意味は、ヒト胚性幹細胞に由来する網膜色素上皮細胞の誇示を通じて、加齢性黄斑変性症の治療にまで及びます。私たちの動物技術者であるモニカ・アロンソンは、光干渉断層撮影で網膜を視覚化および画像化できるように、ウサギを所定の位置に保持しています。テキストプロトコルに従ってウサギに麻酔をかけた後、頭を外科医に向けてウサギを手術用顕微鏡の下に置きます。

次に、まぶたの開創器を使用してまぶたを取り外し、滅菌布を使用してnictitans膜を取り除きます。マイクロサージェリーには、マイクロサージェリー器具の挿入に、2ポートまたはオプションの3ポート25ゲージ経光子パースプラナ技術を使用します。多機能硝子体切除術装置には、輸液カニューレ、エンドイルミネーション、硝子体、エンドレーザーを接続するためのポートがあります。

網膜下注射の場合、内照光のみが必須であるため、2ポートのセットアップで十分です。血栓鉗子を使用して結膜をつかんで変位させ、挿入部位に上線を引きます。2つの上部トロカールのうちの1つを、リンバスから1〜2ミリメートルのところに、30〜45度のリンバス平行角度で経強膜に挿入します。

先端の中央にトロカールを挿入します。次に、トロカールを90度回転させて、後極を目指して目の中に進みます。これにより、この硬化切開術による術後の漏れを防ぎ、眼内炎のリスクも減少します。

2番目の上部トロカールで繰り返します。.トロカールを挿入するときは、挿入をトンネルするためにリンバスから1〜2ミリメートル離れ、感染、硝子体出血、網膜剥離、およびレンズタッチのリスクを最小限に抑えるために後極を狙うことが重要です。合成涙液を収縮ゲルとして角膜に塗布し、角膜に使い捨てのフラットコンタクトレンズを配置して網膜を視覚化します。

次に、500マイクロリットルのヨウ素酸ナトリウムを、助手が操作する延長チューブと外科医が操作する38ゲージのポリチップカニューレに接続された1ミリリットルの注射器に落とします。左上のトロカールにエンドイルミネーションプローブを挿入します。次に、右上のトロカールから注射カニューレを挿入し、視神経頭のすぐ下の領域を目指して、硝子体腔を通って網膜に向かってカニューレを進めます。

カニューレの先端をゆっくりと網膜に触れさせ、焦点のホワイトニングが見えるまで待ちます。カニューレを網膜に浸透させないでください、出血を引き起こす可能性があります。次に、針で網膜を貫通し、50マイクロリットルのヨウ素酸ナトリウムを5秒間にわたって網膜下に注入します。

網膜とその下にある脈絡膜との間には自然な劈開面があるため、注射中にはっきりと見える半透明のブレブが徐々に形成されます。注入中は、針をゆっくりと引っ込めますが、逆流を最小限に抑えるために先端がブレブ内に保たれていることを確認してください。エンドイルミネーションと注射カニューレを取り外した後、血栓鉗子を使用してトロカールを取り外します。

次に、先端または鉗子の鈍い端を使用して、ソフトシール縫合のない硬化切開術に30秒間軽い圧力を加えます。回復中は、テキストプロトコルに従って動物に付き添い、移植まで7日間待ちます。ヨウ素酸ナトリウムの注入の7日後および硝子体内トリアムシノロンの投与の後で、テキストのプロトコルに従って、24の井戸のconfluent hESC-RPEの単層から細胞分化培地を取除き、各井戸を洗うためにカルシウムおよびマグネシウムなしでPBSの500マイクロリットルを使用して下さい。

細胞をトリプシンした後、プレートを傾けてトリプシンを慎重に取り除き、細胞がプレートに付着したままになるようにします。800マイクロリットルの新鮮な摂氏37度の予熱分化培地に細胞を、穏やかにピペッティングするか、必要に応じて掻き取ることにより、単一細胞懸濁液を得ることによって収集します。ゼロポイント2パーセントトリパンブルーを使用して、製造元の指示に従って血球計算盤チャンバー内の細胞をカウントします。

次に、細胞懸濁液に5ミリリットルの分化培地を加え、細胞を300倍のgで室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを新たにろ過した滅菌PBSに、最終濃度1マイクロリットルあたり1000個の細胞で再懸濁します。前の細胞懸濁液を600マイクロリットルのアリコートに分注し、手術までおよび手術中に氷上に保ちます。

ウサギに麻酔をかけ、テキストプロトコルに従って瞳孔を拡張した後、ウサギの頭を外科医に向けて置きます。まぶたのリトラクターを使用してまぶたを取り外し、滅菌布を使用してニクタイタンの膜を取り除きます。マイクロサージェリーでは、このビデオで前述したのと同じ位置にトロカールを配置した2ポートまたはオプションの3ポート25ゲージの経光部扁平法を使用します。

以前の硬化症が見える場合は、術後の漏出のリスクを最小限に抑えるために、これらの挿入部位に隣接して、ただしこれらの挿入部位を介してではなく、トロカール挿入を行います。以前と同様に合成涙液を目に塗布し、角膜の溶液の上に使い捨てのフラットコンタクトレンズを置いて網膜を視覚化します。先端を適切に配置し、ヨウ素酸ナトリウム前処理領域の中心を目指した後、特徴的な金属内視鏡反射によって区別され、穏やかに混合されたhESC-RPE懸濁液を50マイクロリットルを網膜下で注入します。

神経感覚網膜は簡単に分離し、はっきりと見えるブレブを作成するはずです。注射中は、針をゆっくりと引っ込めますが、逆流を最小限に抑えるために先端がブレブ内に保たれていることを確認してください。.エンドイルミネーションと注射カニューレを取り外した後、血栓鉗子を使用してトロカールを取り外し、鉗子の鈍端を使用して以前と同様に30秒間軽い圧力を加えます。

スペクトル領域光干渉断層撮影法(SD-OCT)装置と付属のソフトウェアを使用して、製造元の指示に従って、治療された動物の断面B-スキャンを取得します。麻酔をかけ、瞳孔拡張した動物を調整可能なマウントに置き、器具の光源からウサギの網膜までの遮るもののない経路を取得します。画像のぼやけを避けるために、30〜60秒ごとに局所生理食塩水で洗い流して角膜を湿らせてください。.

同時赤外線共焦点走査型レーザー検眼鏡検査または共焦点SLO反射率参照画像を使用して、注入領域の上部、中央部、および下部を表す少なくとも3回のOCTスキャンを取得します。共焦点SLOの青、緑、赤外線、および多色のレーザー反射率を使用して、顔面眼底画像の複数のレーザー色を同時に取得します。SD-OCTデバイスの青色光レーザー機能を使用して青色光自家蛍光画像をキャプチャします。

ここでは、正常なアルビノウサギ網膜のBAF、IR-cSLO、およびSD-OCTの代表的なin vivo画像を示します。SD-OCT画像のブローアップは、SD-OCT装置によってキャプチャされた光の反射の異なるレベルと、さまざまな網膜層を示しています。このSD-OCT画像に示すように、1ミリモルのヨウ素酸ナトリウム溶液を50マイクロリットル注入してから3か月後に撮影された、ブレブが作成され、外側の網膜が分解され、徐々に変性します。

SD-OCTおよび低BAF領域の最も外側の神経網膜層の薄化が観察され、RPE損失に対応し、GA様表現型が再現されます。損傷部位が特定されると、5万個のhESC-RPE細胞が移植のために再注入され、2番目のブレブが作成されて解消されました。軽度から中等度のハイパーBAF領域では、損傷領域の境界線に局所的に増加したハイパーBAFが存在し、ネイティブRPEの慢性ストレスを示しています。

MC画像に色素沈着細胞のパッチが見られ、SD-OCTスキャンでよく保存された網膜構造を示す、前処理されていない眼へのhESC-RPEの注射に対応するブレブが比較のために示されています。網膜下注射のためのこのかなり臨床的な方法を習得することは、加齢性黄斑変性症などの状態のための細胞ベースの治療の臨床移植を容易にするでしょう。このビデオを見れば、生活型モデルで網膜下注射を設定する方法、網膜下注射用のヒト胚性幹細胞由来細胞を準備する方法、光干渉断層撮影法を使用してドナー細胞の統合を視覚化する方法について十分に理解できるはずです。