マイクロ コント ローラーは従来のタバコの煙、電子たばこエアロゾル液体抽出物の世代のデバイスを運営

この手順の全体的な目標は、毒物学的アッセイで使用するための電子タバコエアロゾルから液体抽出物を生成することです。この方法は、電子タバコのエアロゾルが人間の血管細胞にどのように影響するかなど、電子タバコに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、エアフローとパフタイミングのプロトコルを個々のラボがカスタマイズして、特定の研究ニーズを満たすことができることです。

この手法は、自分の研究室で電子タバコのエアロゾル抽出物を生成できるカスタマイズ可能なプラットフォームを提供するため、電子タバコ使用の潜在的なリスクの理解を深めることにまで及びます。この方法は、電子タバコのリスクについての洞察を提供することができます。また、従来のタバコ製品や大麻製品など、他の製品にも適用できます。

まず、100ミリリットルのブフナーフラスコをスチール製のリングスタンドに固定し、50グラムの塩化カルシウムを充填して乾燥剤として機能する真空トラップを作成します。次に、フラスコをゴム製のスルーホールストッパーで密封します。ストッパー接合部をパラフィンフィルムで包み、穴にピペットを通します。

ビニールチューブを使用して、トッパーから伸びるピペットをT字型交差ホースコネクタに接続します。次に、それを使用して 2 つのインピンジャーを相互に接続し、2 番目のインピンジャーの出力を T 交差ホース コネクタに接続します。次に、ビニールチューブを使用して、吸入ポートとして機能する最初のインピンジャーの入力ポートを接続します。

また、Buchnerフラスコのサイドアームをエアフローレギュレーターの入力ポートに接続します。そして、エアフローレギュレーターの出口ポートを真空ポンプに接続します。次に、510ネジベースをリングスタンドクランプに入れ、ビニールチューブを使用してソレノイドバルブをT字型交差ホースコネクタの自由端に接続します。

終了したら、すべてのジョイントが気密であることを確認し、必要に応じてホースクランプとバキュームグリースを塗布します。まず、各電子タバコのカートマイザーまたはタンクを使用する前に、分析天びんに載せて質量を決定します。使用前と使用後の重量差によって、適切な投与量が決まります。

市販の3R4F研究用たばこの場合、ニコチン含有量は7ミリグラムになります。他のすべての市販の紙巻きたばこの場合、ニコチン含有量は従来の分析方法で測定する必要があります。中性赤色取り込み細胞生存率アッセイをダウンストリーム解析に使用する場合は、一次インピンジャーのリザーバーに4.3ミリリットルの内皮細胞培養培地を充填します。

次に、電子タバコまたは従来のタバコを抽出用に準備します。従来のタバコを抽出用に準備するには、フィルターの周りに透明なテープを貼り、タバコの紙がフィルターに結合する場所に見やすいマークを付けます。電子タバコを準備するには、バッテリーが十分に充電されていること、およびカートマイザーがバッテリーにしっかりとねじ込まれていることを確認してください。

電子タバコタンクを使用する場合は、適切な量の電子タバコ液がタンクに装填されていることを確認し、タンクを510ネジベースにねじ込みます。従来のタバコは吸入口にセットし、ホースクランプで固定します。次に、真空ポンプをオンにします。

流量計を毎分1.65リットルに調整して、2秒間で55ミリリットルのパフを確保します。次に、マイクロコントローラーの電源を入れ、それを使用して最初のパフでタバコに火をつけます。予測された所望濃度が達成されるまでポンプを運転します。

電子タバコの場合は、まず吸入口に装填し、ホースクランプで固定します。従来のタバコと同様に、真空ポンプをオンにし、流量計を毎分1.65リットル引き込むように調整して、2秒間で55ミリリットルのパフを確保します。予測された希望容量が使用されるまでポンプを運転します。

次に、真空を停止し、分析天びんを使用して各電子タバコのカートマイザーまたはタンクの使用後質量を決定します。これを使用前の質量と比較して、消費された総質量を決定します。十分な質量が消費されなかった場合は、電子タバコをデバイスに戻し、抽出をさらに時間実行します。

各抽出後、サンプル間のキャリーオーバーを防ぐために、デバイスのチューブとリザーバーを70%エタノールと脱イオン水ですすいでください。次に、空のデバイスを短時間実行して、ラインの乾燥を支援するための空気の流れを確保します。抽出物を細胞培養に使用する場合は、0.22ミクロンのポリエーテルスルホンシリンジフィルターで抽出物を含む培地をろ過します。

アッセイを実行する1日前に、100マイクロリットルの内皮細胞増殖培地中のウェルあたり10, 000個の細胞でヒト臍帯静脈内皮細胞を96ウェルプレートに播種します。細胞を摂氏37度、CO2濃度5%で24時間インキュベートします。翌日、古い培地を、コントロールとして機能する100マイクロリットルの新鮮な内皮細胞培養培地、または500マイクロモルの消費されたニコチンを含む100マイクロリットルの内皮細胞増殖培地と交換して治療グループとして使用します。

プレートをホイルシールでシールしてウェルを気密に保ち、プレートをインキュベーターに18〜24時間戻します。たばこの煙や電子たばこのエアロゾルの成分の多くは揮発性であるため、ウェルが気密になるように、ウェルをホイルシールで覆うことが重要です。使用の直前に、100倍中性赤色ストック溶液を細胞培養培地で1〜100倍希釈し、1倍中性赤色染色溶液を作製します。

中性赤色染色液を37°Cで少なくとも30分間インキュベートしてから使用してください。インキュベーション中に一部の結晶が沈殿するのは正常です。これらの結晶を細胞培養ウェルに塗布しないようにするには、溶液を22ミクロンのフィルターに通します。

実験用培地を取り出し、各ウェルに100マイクロリットルの中性赤色染色溶液を加えます。過剰な染色物を使用して、適切な定量のために少なくとも3つのブランクウェルを作成します。プレートを2〜4時間インキュベートした後、中性の赤色染色溶液を除去し、PBSに浸して細胞を3回洗浄します。

次に、中性の赤色の防汚液を塗布し、プレートを室温で少なくとも10分間振とうしながらインキュベートします。終了したら、540ナノメートルの吸光度でプレートを読み取ります。ヒト臍帯静脈内皮細胞を従来のタバコ煙抽出物または電子タバコエアロゾル抽出物のいずれかに曝露してから24時間以内に、細胞生存率が大幅に低下します。

細胞生存率の研究に加えて、抽出物自体をアセトンに抽出した場合、ガスクロマトグラフィー質量分析を使用して分析できます。この方法を使用すると、抽出物の多くの成分を決定できます。エアロゾルや煙を扱う作業は危険な場合があり、すべての抽出は化学安全フードで行う必要があることを忘れないでください。