Name: 郭清と尿の添付ファイルのIn Vitro解析マウス尿膜の培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶマウス尿膜の培養とα4β1インテグリンを用いたin vitro付着解析法。胎盤形成の初期段階をモデル化し、哺乳類胚発生の制御メカニズムを解明する実験技術を習得できます。

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この作品は、(社) にドイツ研究振興協会 SFB688 によって支えられました。

マウス繁殖は Regierung Unterfranken によって承認された、すべてのドイツ語、欧州連合の法律、実験動物の管理と使用に関する規制に従い、すべての解析を行った。
1. コーティングのマイクロタイター プレート α4β1 インテグリンとEx 子宮尿膜培養
<ol><li>200 μ g/mL 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で凍結乾燥させたマウス α4β1 インテグリンを再構成します。予め温めておいた (37 ° C) PBS で 10 μ G/ml の最終濃度に希釈します。ピペット希釈 α4β1 インテグリン溶液 20 μ L/ウェルのマイクロ プレート (1 尿膜/井戸) の井戸の必要な数に。 注: は、マイクロ プレートのウェルをコーティングする際、気泡の形成を避けるため。</li>
	<li>加湿の組織文化のインキュベーターでそれらを配置することによって 37 ° C で 60 分のマイクロタイター プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>ピペットで上澄みを慎重に吸引します。穏やかな吸引を使用し、ピペット チップをウェル底面に触れることを避けるためにプレートを傾斜します。予め温めておいた (37 ° C) 培養液などダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)、50 μ L を追加することで 2 回洗浄し、穏やかな吸引によって洗浄媒体を削除します。</li>
	<li>重要なステップ: 無料サイトを 50 μ L/ウェル 0.1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) を追加することでバインド ブロック/DMEM 加湿組織文化のインキュベーターでマイクロタイター プレートを配置することによって ≥ 37 ° C で 30 分間インキュベートし、。 注: 尿膜外植体血清の存在下での様々 な面にアタッチできます。非特異的結合部位をブロックする必要したがって、コーティング後、インテグリンとの切り裂かれた尿膜を追加する前に井戸は、血清を含む文化を外植体中 (手順 4.4 を参照)。</li>
	<li>4.4 の手順で必要になるまでの 37 ° C でブロッキング液でコーティングされた井戸を維持します。</li>
</ol>2. 子宮解剖 Dpc 8 で妊娠マウスから
注: は、重量ゲイン差別15によって偽陽性妊娠率を減らします。
<ol><li>頚部転位によってマウスを犠牲に。腹部のコートを 70% (v/v) エタノールを噴霧して消毒します。 注: は、マウスを処理するとき、手袋を着用します。麻酔なしの頚部転位による安楽死は、尿膜添付ファイルを妨げる可能性があります尿膜の化学汚染を防ぎます。</li>
	<li>ハサミで正中線で小切開を行うことで腹部の皮膚を開きます。上と下の切開、皮膚を保持するために手袋をはめた指を使って、胸やマウスの尻尾に向かって皮膚を引き離します。</li>
	<li>鉗子で腹膜を把握します。もう片方の手を前方から V 字切開は後方に向かって、はさみを使用して、離れて腹腔内を公開する組織を移動します。子宮へのアクセスを得るために 1 つの側面に腸をプッシュするのに鉗子を使用します。</li>
	<li>2 つの子宮角を探します。鉗子で子宮頸部 (尾側のセグメント) を押しながら高級ハサミで靭帯をカットします。その後、はさみで卵管を切断することによって両方の子宮角をデタッチします。</li>
	<li>部屋の温度 (RT) PBS 滅菌、滅菌 10 cm 皿含むに子宮を転送する鉗子を使用します。脂肪組織、血管、神経周囲の高級ピンセット、はさみ (図 1 a) と子宮角を削除します。</li>
</ol>3. 胚解離
注: 8:1 ズーム範囲を備えた顕微鏡の下で次の手順に従います。
<ol><li>はさみで、着床間に切断することによって胚を区切ります。鉗子で子宮芽の筋肉子宮内膜をつかんでそれを分解、脱落膜 (図 1 b) を公開します。</li>
	<li>RT PBS 滅菌、含んでいる新しい 10 cm 皿に子宮芽を転送鉗子を使用して、します。</li>
	<li>鉗子の先端で胚の周り脱落膜を固定します。</li>
	<li>微細鉗子 (図 1)、脱落膜の抗 mesometrial 側に切開をして、胚 (図 1) を公開するための鉗子で、脱落膜をはがします。 注: mesometrial ポール脱落膜の高い血管柄付きし、胚が含まれますされ、淡い反 mesometrial 部分より根元が広くできます。</li>
	<li>鉗子 (図 1E, F) で胎児を解剖します。</li>
	<li>マイクロ スプーンを使用して、滅菌 3.5 cm 皿に含まれている滅菌 PBS のドロップに胚を転送します。</li>
	<li>マイクロ スプーンを使用して同じ 3.5 cm 皿の PBS の新鮮なドロップに胚を転送そして鉗子 (図 1, H) による卵黄嚢から胎児を解剖します。</li>
	<li>必要に応じて、必要な場合 (例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による検出)、転送卵黄嚢生殖不能の管にそれを吸引によって ~ 大形オリフィス 200 μ L ピペット チップに 5 μ L の PBS。-20 ° C にてストア 注: 卵黄嚢準備を汚染する可能性が母体の組織 (すなわち、頭頂部の卵黄嚢ライヘルトの膜と胎盤のコーンなどを含む) は、誤ったジェノタイピングの結果につながります。これらの組織の除去は、卵黄嚢から胚解離の前に最も簡単です。</li>
</ol>4. 尿膜解離と固定化 α4β1 インテグリンのEx 子宮文化
<ol><li>微細鉗子 (図 1 H) による胚の後部の端にその基底挿入部位から尿をカットします。</li>
	<li>必要に応じて、発達のステージングが必要な場合は、段階の対照の光学と、5 ×、10 × 対物顕微鏡を用いた目視による胚の体節のペアをカウントします。 注: 胎児は体節を数えるための鉗子で拡張できます。漿の添付ファイルとの融合は ≥ 6 体節のペアを持つ胚で E 8.0 と 9.0 E の間発生します。6 8 体節のペアを持つ胚で回転を開始します。</li>
	<li>10% (v/v) ウシ胎児血清、L-グルタミン、プレコート マイクロタイター プレート井戸 (セクション 1 を参照) の必要な数の抗生物質と DMEM のピペット 40 μ L/ウェル。</li>
	<li>それを吸引によってフローティング尿を収集 〜 200 μ L ピペット チップの大形オリフィスに 5 μ L の PBS。1 尿膜/ウェルを転送します。</li>
	<li>例えば、加湿の組織文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO2) でマイクロタイター プレートを配置することによって、allantoides をインキュベート 6、12、24 h。尿膜の添付ファイルとの干渉を防ぐためにこれらの時間ポイントの間にマイクロタイター プレートを移動しないでください。</li>
	<li>各時点でスコア尿膜添付ファイル (例えば、ない添付ファイル/フローティング尿膜部分的または完全にアタッチされた尿膜; 完全に広がり尿膜) 位相コントラストや微分干渉コントラスト光学系を搭載した顕微鏡を使用して、5 ×、10 × 目的 (図 2)。 注: 新鮮単離と完全に接続されている allantoides の代表的な例は図 2のとおりです。子宮 ex、野生型 c57bl/6 j マウスから分離した allantoides の遠位先端アタッチ (尿の部分的な添付ファイルとして呼ばれます) 4-6 時間、以内、全体の尿膜壁完全添付ファイルが可能です 〜 文化の 12 h。18-24 h 外植体が平坦化、CD31 陽性血管叢9,16(完全に広がった尿膜に呼ばれる) 円形の形状を想定します。</li>
</ol>5 血管内皮細胞マーカー CD31 Explanted 尿膜壁験染色
<ol><li>完全に広がり外植片の培養培地を吸引し、4% (w/v) パラホルムアルデヒド/PBS の 40 μ L/ウェルを追加してセルを修正します。 注: パラホルムアルデヒドは有毒です。手袋、皮膚と眼との接触を避けるために安全ゴーグルを着用します。</li>
	<li>常温では、10 分間インキュベートし、上清を吸引します。PBS の 40 μ L/ウェルを追加して 3 回を洗浄し、穏やかな吸引によって洗浄媒体を削除します。</li>
	<li>セルを permeabilize し PBS の 40 μ L/ウェルを追加することによって二度 0.1% (v/v) した洗浄で 30 分の PBS でトリトン X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) ヤギ血清の 40 μ L/ウェルを追加することで非特異的結合部位をブロックし、穏やかな吸引によって洗浄媒体を削除します。 注: プロトコルを一時停止できる一晩この時点で。</li>
	<li>4 ° C で一晩に 20 μ L/ウェル主アンチ CD31 抗体の希釈 1:50 0.1% (w/v) BSA/PBS で追加することによって細胞を染色します。PBS の 40 μ L/ウェルを追加して 3 回を洗浄し、穏やかな吸引によって洗浄媒体を削除します。</li>
	<li>暗い室内で 0.1% (w/v) BSA/PBS アルミホイルで包装することによって配置の光から保護したマイクロタイター プレートで 1 時間で蛍光標識した二次ヤギ抗ラット抗体希釈 1: 200 の 20 μ L/ウェルを追加することでバインドされた一次抗体を検出します。PBS の 40 μ L/ウェルを追加して 3 回を洗浄し、穏やかな吸引によって洗浄媒体を削除します。</li>
	<li>メディアをマウントの 20 μ L/ウェルを追加することによって細胞を埋め込みます。インキュベート 〜 RT 取付培地が固化するまでで 1 時間。マイクロタイター プレート常温または 4 ° c、光から保護を格納します。</li>
	<li>5 ×、10 × 客観的かつ適切な蛍光フィルターを搭載した蛍光顕微鏡下で外植体画像尿膜壁血管叢 注: 完全普及尿膜の CD31 陽性血管叢の代表的なイメージは図 3のとおりです。Flk-1、Flt、に対して指示される抗体などの血管叢の他のマーカーとしてよく16ネクタイ 1 またはネクタイ 2 を使用できます。</li>
</ol>

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<li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allantois+and+chorion%2C+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion%2C+have+hematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li>
<li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17671451">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

プロの接着細胞外マトリックス分子フィブロネクチンなどの豊富な源である血清の存在下で尿膜外植体は容易に様々 なプラスチックやガラス、フィルター表面9,16にアタッチされます。したがって、実行される分析の目的は、遺伝子組み換えの効果を具体的に検討する場合、尿膜の添付ファイルに他の処理固定化 α4β1 は、非特異的結合部位 (例えば、ウシ血清をブロックする重要です。アルブミン) インテグリンとの血清含有培養前に表面をコーティングした後メディア。
固定化 α4β1 インテグリンに尿膜外植片の初期の添付ファイルは非常に動きに敏感、組織培養プレートしたがってに委ねられること邪魔されず尿膜を採点する前に (例えば、12 h) 一定時間添付ファイル。分析されたマウス緊張または固定化 α4β1 インテグリンの濃度によって基質形成安定した接触のために必要な時間の異なるが場合があります注意してください。
<p class="jove_conte...

胎盤が子宮環境の胚の成長と開発のために不可欠です。それは内分泌と免疫器官としての酸素代謝物、胎児と母体の循環とも機能間の栄養交換のためのインターフェイスを構成します。胎盤発育を損なう内因性または外因性の侮辱は、子宮内胎児発育遅延、胎児の損失、または妊娠合併症、マウスと人間1の両方につながることができます。対象となるマウスを異常な胎盤の生理を引き起こす突然変異の数が 219 遺伝子多型のマウスのゲノム情報学 (MGI) ウェブサイトに現在表示されている2を増やす続けます (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology/MP:0010038)、これらの表現型の多くはよく機械論的視点から理解されていません。に加えて遺伝子変異、小分子薬、モノクローナル抗体、毒素、病原体、余分な代謝物や様々 な環境要因や影響を与える胎盤開発関数3,4,5,6,7します。 まだ、簡単な生体外モデル胎盤の開発で重要な手順が不足している試金。
(臍帯発達前駆体) 尿膜が絨毛膜8に向かって育つ芽として胚の後部の端から現れるとき、初期の経産婦でマウス胎盤の発育が開始されます。尿の芽の外側の層の Chorioadhesive セルは、添付ファイルおよび絨毛膜 (漿「融合」) の表面に尿膜の広がりを仲介します。絨毛膜はその後に尿膜壁血管成長迷路、栄養素と酸素が密接に並置母体血と胎児血管9 間交換される胎盤内層を形成する絨毛に折る ,10。
絨毛膜へ尿の付着迷宮形成の初期および重要なステップであり、このプロセスの欠陥は midgestation1胚性致死性の最も一般的な原因のうち。マウス突然変異体の数が、漿添付ファイル10が発生するが失敗し、MGI データベース現在異常な漿融合 (http:// によって特徴付けられる 108 マウスの突然変異体の一覧を記載されてwww.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824)、血管細胞接着分子 1 (VCAM 1、尿中胚葉に発現) と (は絨毛の中皮に表される α4β1 インテグリンの細胞間相互作用初期胚胚体外胚葉由来) 漿添付ファイルと融合11,12,13のため不可欠であることが表示されます。(E) 7.5 日約 VCAM 1 が尿の茎の遠位 3 分の 2 以内単位があることを示している全体マウント野生型胚の免疫組織化学的染色13 (1-4 体節期)、およびその発現状態のまま高漿の添付ファイルと - 融合11,12。絨毛膜尿愛着の障害は、通常、子宮の芽の組織学的解析による検出します。ただし、尿膜サイズはの間と同じ発達段階14リットル内でも高い生理学的変数であり、尿は、物理的な接触をするのに十分な大きさに達したときに絨毛膜にのみ添付できます。この自然の変動を反映して、漿添付が行われる間のいつか 〜 E 8.0 と 9.0 E子宮内、および組織によって、このプロセスの統計的信頼性の高い評価は大きい数の解析に依存したがって淘汰適切な発達段階で十分な検体を採取します。
ここでは、尿の添付ファイル子宮 ex少ない尿膜のサイズに依存している評価方法について述べる。妊娠マウスの子宮からマウス胚とその allantoides の郭清を紹介 〜 8 日のポストの coitum 定め(dpc; dpc 0.5 が膣にプラグインの検出を示す)、固定化 α4β1 の外植体尿膜の後続の文化とインテグリンです。このメソッドは、添付ファイルおよび複数並列で、異なる連続した時点で尿膜外植体の挙動を広がりの急速な機能評価できます。プロトコルを使用することがあります尿膜添付ファイル前のヴィヴォに及ぼすターゲット変異、薬、または様々 な環境要因の画面に。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J 野生型マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>在庫番号:&nbsp;</td><td></td>000664</tr><tr><td>70% (v/v) エタノール</td><td>VWR インターナショナル</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11000-12</td><td>腹腔を開くために使用される鉗子。</td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11254-20</td>デュ<td>モン#5細くて鋭い先端を持つ医学生物学鉗子。</td></tr><tr><td>細いハサミ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14094-11</td><td>ストレートブレード。</td></tr><tr><td>春ばさみ&nbsp;</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15012-12</td>子宮<td>芽の解剖用の14mmブレード付きノイズスプリングハサミ。</td></tr><tr><td>マイクロスプーン</td><td>カールロス</td><td>AT18.1</td><td>5ミリメートルスプーン直径。</td></tr><tr><td>マイクロタイタープレート</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>コーティングされていない無菌の血管新生スライド(内容積50 &micro;L)非−#945を減らすために組織培養処理されていない疎水性表面を有する;4&#946;1-プラスチックへの結合を媒介とする。</td></tr><tr><td>10 cmディッシュ</td><td>Nunc</td><td>150350</td>無<td>菌組織培養ディッシュ。</td></tr><tr><td>3.5cmディッシュ</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>無菌組織培養ディッシュ。</td></tr><tr><td>大型オリフィスピペットチップ&nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>低結合ピペットチップ、200 μL。</td></tr><tr><td>&#945;4&#946;1インテグリン</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ6054-A4</td><td>マウス&#945;4&#946;1インテグリンを組換えで発現させ、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から精製しました。</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td>、<td>Ca2+およびMg2+なし。</td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグルミディアム(DMEM)</td><td>PAN</td><td>バイオテクノロジーP04-03600</td>製剤<td>には、4.5 g / Lグルコース、110 mg / Lピルビン酸ナトリウム、3.7 g / L NaHCO3が含まれていますが、L-グルタミンは含まれていません。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10,000 U/mL ペニシリンと 10,000 &micro;g/mL ストレプトマイシン)原液&nbsp;アリコートを-20°Cで準備して保管します。凍結/融解を避けるためのC。</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>PAN バイオテック</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) ストック溶液。アリコートを-20°Cで準備して保管します。凍結/融解を避けるためのC。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>熱不活化FBS(56°Cに加熱)を使用しています。Cを30分間、混合して補体を不活性化します)。</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>プロテアーゼフリー、脂肪酸フリーのアルブミンを使用しています。DMEMで0.1%(w / v)溶液を調製します。滅菌ろ過は、0.22&microの使い捨て細胞培養フィルターを介して溶液をろ過します。m孔径と低タンパク質結合膜、および-20°Cでアリコートを保存します。</td></tr><tr><td>para-ホルムアルデヒド</td><td>カール・ロス</td><td>0335.2</td><td>PBSでホルムアルデヒド溶液を作るには、換気されたフードでpara-ホルムアルデヒド粉末を計量し、約60°Cに予熱したPBSに加えます。攪拌板の上のビーカーのC。溶液が透明になるまで1 N NaOHを滴下します。溶液を室温まで冷まし、0.22 mmフィルターシリンジでろ過します。希釈したHClでpHを約6.9に調整し、PBSで最終容量に調整します。溶液を分注して凍結しますが、4°Cで保存することもできます。Cは約4週間です。&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Triton X-100の原液を扱うには、ワイドオリフィスのピペットチップを使用してください。</td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>免疫蛍光分析における抗体の非特異的結合を阻害します。</td></tr><tr><td>&#945;-CD31抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>精製ラット抗マウスモノクローナル抗体、クローンMEC 13.3。</td></tr><tr><td>二次ヤギ抗ラット抗体</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーA-11006</td><td>ヤギ抗ラットIgG(重鎖および軽鎖)、交差吸着、Alexa Fluor 488で蛍光標識。他の蛍光標識も可能です。</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>細胞化学用封入剤。MW ~31,000</td></tr><tr><td>Labovert&nbsp;</td><td>ライツ</td><td>・ラボバート&nbsp;</td><td>体節ペアカウント用の4倍および10倍対物レンズを備えた倒立位相差顕微鏡。他の位相差顕微鏡(組織培養で日常的に使用されているものなど)も適しています。&nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>M80</td><td>実体顕微鏡 8:1 ズーム範囲 (倍率 7.5 x から 60 x) で、胚および尿膜の解剖に適しています。</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>DM4000B</td><td>LED照明付き組織学用顕微鏡システム。HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 と HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 対物レンズを使用しています。位相差光学系と蛍光光学系を備えた他の顕微鏡を使用して、尿膜付着をスコアリングできます。</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>3-CCDデジタルキャプチャカメラをDM4000B LED顕微鏡に取り付けました。顕微鏡とカメラの両方の操作には、Diskusソフトウェア(Hilgers)を使用しています。</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>SP5</td><td>尿膜外植片の血管神経叢における内皮の高解像度イメージングのための共焦点顕微鏡。免疫蛍光画像は、40 x 対物レンズで撮影しました。</td></tr></tbody></table>

郭清と尿の添付ファイルのin vitro解析マウス尿膜の培養

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

胎盤は、成長と哺乳動物の胎児の開発のために不可欠です。このため、多数の遺伝子変異と胎盤の開発または機能を妨げる可能性が高いのも環境の侮辱が、マウスとヒトの妊娠初期の損失にあります。それにもかかわらず、画面の胎盤形成に対する潜在的な影響に簡単な生体外の試金が不足しています。ここでは、モデリングにおける胎盤絨毛膜に尿膜壁添付ファイルから成っている最初の重要なステップに焦点を当てます。Chorio 擬態の基板となる固定化 α4β1 インテグリンの尿外植片の添付ファイルを迅速に評価する方法について述べる。この体外アプローチにより、添付ファイルと異なる連続した時点で複数の尿膜外植体の挙動を拡散の定性的な評価です。プロトコルは、ターゲットを絞ったマウス突然変異、薬、または妊娠合併症や尿膜添付ファイル前のヴィヴォの胎児の損失にリンクされているさまざまな環境要因の効果を調べるために使えます。

このプロトコルを特定しマウス allantoides前のヴィヴォ、外植体について述べるし、体内漿融合中 α4β1 インテグリンに尿膜添付ファイル、重要なプロセスの定性的な評価の詳細。図 1 a-Hに示す代表的な結果は、妊娠子宮から始まって尿膜分離の連続した手順を示します。脂肪組織と血管 (図 1 a) などの子宮角を囲む母体組織が削除され、胚は段階的に子宮内膜から筋子宮層 (図 1 b- 開放後解剖 E)。その後、頭頂部の卵黄嚢や胎盤円錐など他の母体組織が削除されます (図 1E, F)。図 ...

モデル漿添付ファイル、胎盤形成の最初のステップの in vitroアッセイについて述べる。プロトコルは、固定化 α4β1 インテグリンのマウス allantoides の郭清と植の文化を示しています。尿膜の添付ファイルは、あらかじめ決められた時点で病理組織学的に評価されます。

郭清と尿の添付ファイルのIn Vitro解析マウス尿膜の培養

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

この手順の全体的な目標は、in vitro で尿膜付着を分析するためのマウス尿膜の解剖および外植片培養です。この方法は、胎盤形成のための尿膜付着の制御など、哺乳類の胚発生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、in vitroでの胎盤形成における最初の重要なステップをモデル化することです。この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるKerstin Hadamekです。プレートをセットアップするには、まず、作りたてのAlpha 4/Beta 1インテグリン溶液20マイクロリットルを各ウェルに加えます。井戸ごとに1つの尿膜を計画します。気泡のある溶液を堆積させないでください、これは適切なコーティングを妨げるからです。ウェルをロードした後、加湿インキュベーターでプレートを1時間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを傾斜させたままウェルから上清を吸引し、ピペットがウェル底に触れることなく溶液を穏やかに吸い出すことができるようにします。次に、50マイクロリットルの温かい培地を使用してウェルを2回洗浄します。洗浄剤を取り除くときは、穏やかに吸引してください。各ウェルに50マイクロリットルのブロック溶液を塗布します。次に、プレートが必要になるまで少なくとも30分間インキュベートします。アラントワ外植片は非常に粘着性があります。したがって、ブロックステップはプロトコルの成功にとって重要です。妊娠中のマウスを生贄にした後、腹部を70%エタノールで消毒します。次に、ハサミで正中線に小さな切開をして腹部の皮膚を開きます。手袋をはめた指を使用して、切開部の上下に皮膚を保持し、マウスの胸部と尾に向かって皮膚を引き離します。次に、鉗子で腹膜をつかみ、もう一方の手で、前部から後部に向かってV字型に切開します。組織を変位させて腹腔にアクセスし、次に腸を横に押して子宮にアクセスします。次に、2つの子宮角を見つけます。子宮角の尾側部分である鉗子で子宮頸部を押さえながら、細いハサミを使って靭帯を切断します。次に、ハサミで卵管を切断することにより、両方の子宮角を切り離します。取り外したら、鉗子を使用して子宮を室温PBSが入った10センチメートルの皿に移します。皿の中で、細い鉗子とスプリングハサミを使用して、子宮角の周りの脂肪組織、血管、神経を取り除きます。次に、胚の細かい解剖を進めます。胚の解剖は、8対1のズーム範囲を持つ実体顕微鏡で行います。はさみで着床部位の間を切り取ることにより、胚を分離することから始めます。鉗子で子宮芽の筋肉の子宮内膜をつかみ、引き離して脱落膜を露出させます。次に、鉗子を使用して、子宮の芽をPBS付きの新しい10センチメートルの皿に移します。次に、鉗子で胚の周りの落葉膜を固定します。脱落膜の中心層の引力は高度に血管新生されて

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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郭清と尿の添付ファイルのIn Vitro解析マウス尿膜の培養

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