CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

この実験の全体的な目標は、CRISPR/Cas9遺伝子編集を利用して、サイトカイン依存性造血細胞のカルレティキュリン変異をモデル化し、その発がん活性を研究することです。この方法は、ドライバー変異が生理学的レベルで発現した場合の生物学的機能など、血液悪性腫瘍領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、CRISPR/Cas9遺伝子編集システムを利用して、がんに関与する遺伝子の生物学的機能をモデル化し、研究できることです。

オリゴをアニールしてリン酸化するには、氷上に保持したPCRチューブで試薬を合計10マイクロリットルに加えます。サーモサイクラーにプログラムを設定します。サイクル終了後、水を使用して反応を希釈します。

lentiGuide-Puroベクターを消化するには、50マイクロリットルの消化反応を調製します。その後、55°Cのヒートブロックで消化反応を開始します。1時間後、BsmB1制限酵素のマイクロリットルを追加し、さらに1時間反応を続けます。

切り取られた背骨を脱リン酸化するには、7マイクロリットルのホスファターゼ反応バッファーと2マイクロリットルのホスファターゼ酵素を消化ベクターに加えます。次に、混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。すでに切断され、脱リン酸化された背骨を市販のキットを使用して精製します。

ライゲーション混合物を調製するには、氷上に保持したPCRチューブに15ナノグラムの消化した背骨およびその他の試薬を加え、水で容量を10マイクロリットルに調整します。反応を室温で1時間インキュベートします。次に、STBL3適合細胞を2マイクロリットルのライゲーション混合物で形質転換します。

次に、1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを含むリソジェニーブロス寒天プレートにプレートを付けます。この後、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。3つのコロニーを選び、接種します。

各培養物のミニプレップを行い、U6プロモーター領域プライマーでオリゴ挿入部位をシーケンシングします。10cmの皿にhek293t細胞を播種します。そして、一晩のインキュベーションのためにそれを残します。

トランスフェクション用のDNA混合物を調製するには、トランスフェクション試薬45マイクロリットルをDNAにピペットで注入します。ピペットを使用してDNAとトランスフェクション試薬を慎重に混合し、20分間放置します。この後、DNAトランスフェクション混合物を播種した細胞に滴下します。

プレートを静かに回します。そして、5%の二酸化炭素と摂氏37度で1日インキュベートします。上清を含むウイルスを24時間後と48時間後に0.22マイクロマイターフィルターに通して収穫します。

そして、各クライオバイアルに1.6ミリリットルの上清を分注します。次に、上清を吸引し、Ba/F3細胞を数回ピペッティングして培地に再懸濁します。再懸濁した細胞500マイクロリットル、ウイルス上清1.5ミリリットル、ポリブレン4マイクロリットル、およびマウスインターロイキン31ミリリットルあたり10ナノグラムを6ウェル組織培養プレートに加える。

プレートを440Gで37°Cで120分間遠心分離します。遠心分離後、プレートをインキュベーターに移し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。この後、細胞を440Gで3分間スピンダウンします。

そして、6ウェルプレートに5ミリリットルの新鮮な温かい培地を再懸濁します。Cas9に感染した細胞を選択するには、まず細胞をスピンダウンします。次に、48時間の感染後、ブラストシジンのミリリットルあたり5マイクログラムを補充した新鮮な温かい培地に再懸濁します。

感染していないすべての細胞が死ぬまで、ブラスティックシジンで9日間細胞を選択し続けます。次に、耐性細胞をブラストシジン1ミリリットルあたり1マイクログラムの培地に移します。親細胞およびCas9を安定的に発現する細胞をpXPR-011レポーターコンストラクトでレンチウイルス感染により形質導入します。

ピューロマイシン1ミリリットルあたり2マイクログラムの細胞を、感染後48時間後の3日間、選択し続けます。レンチウイルスを用いて、Cas9発現細胞にシングルガイドリボ核酸を感染させます。次に、ピューロマイシン1ミリリットルあたり2マイクログラムを使用して、感染後48時間、3日間細胞を選択します。

異所性Cas9を発現する指数関数的に増殖するBa/F3細胞と、目的のシングルガイドリボ核酸をビンに入れます。上清を吸引し、5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。細胞をスピンダウンし、リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄します。

次に、細胞生存率アナライザーを使用して細胞の数をカウントします。この後、6つのウェル培養プレートでインターロイキン3を含まない2ミリリットルの新鮮培地で細胞を三重に播種します。細胞のモニタリングとカウントを2日ごとに8日間開始します。

親のBa/F3細胞におけるCas9活性とCas9細胞を過剰発現するBa/F3の代表的なフロー心理測定データを以下に示します。Ba/F3ではCas9細胞を過剰発現すると緑色蛍光タンパク質シグナルが76%減少し、強力なCas9活性が示されていますが、親のBa/F3細胞では、緑色蛍光タンパク質シグナルは100%に留まるカルレティキュリンの発がん活性を示す細胞の代表的な成長曲線がここに示されている。CRISPR/Cas9を介した1塩基対のフレームシフト変異は、m1およびm2シングルガイドRNaseを使用して、カルレティキュリンのエクソン9遺伝子座に導入されました。

Ba/F3トロンボポエチン受容体Cas9細胞を標的とするカルレティキュリンの成長曲線は、マウスインターロイキン3非依存性の成長を示しています。しかし、他の細胞タイプの成長曲線は、サイトカインに依存しない増殖を示していません。シーケンシングの結果は、m1およびm2シングルガイドRNaseを使用して、カルレチクリン標的Ba/F3トロンボポエチン受容体Cas9細胞における内婦人性カルレティキュリンエクソン9のオンターゲット編集を確認しています。

プラス 1 塩基ペアのフレーム シフト変異は黒で示されます。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば2週間で完了します。この手順を試みる際には、目的の遺伝子のどのような種類の突然変異が、目的の表現型に関与している可能性があるかを理解することが重要です。

この手順に続いて、細胞シグナル伝達またはタンパク質タンパク質相互作用におけるその役割など、突然変異をさらに特徴付ける他の方法を実行して、病気を引き起こすメカニズムをさらに理解することができます。その開発後、この技術は、血液学の分野の研究者が、Ba/F3造血細胞の細胞形質転換に対する生理学的レベルでの機能獲得変異の影響を調査する道を開きました。このビデオを見れば、CRISPR/Cas9遺伝子編集法を利用して、サイトカイン依存性造血細胞における機能獲得型変異の発がん活性を調査する方法について十分に理解できるはずです。

レンチウイルスの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、BL2 plus施設での作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。