Name: CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9遺伝子編集を用いてサイトカイン依存性造血細胞におけるカルレティキュリン変異の発癌活性を調査する方法。生理的発現レベルでのドライバー変異の生物学的機能を解明し、血液悪性腫瘍研究に貢献します。

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この作品は、NIH (R01HL131835)、デイモン ・ ラニアン臨床賞、スターがんコンソーシアムによって支えられました。

1. sgRNA オンライン ツールを使用してデザイン13
<ol><li>
自由に利用できるオンライン ツールを使用して興味の遺伝子をターゲット sgRNAs をデザインします。
	<ol>
<li>ブロード研究所 sgRNA デザイナー web ツールに興味の遺伝子の NCBI 参照シーケンスのコピーとペースト: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)。 注: このツールを識別エクソン内の胸の谷間のサイトと sgRNA シーケンスし、エクソン内クリーブそれでもエキソン/イントロン境界にまたがるもの。</li>
		<li>ダウンロードし、excel のテキスト出力ファイルに開きます。</li>
		<li>SgRNA シーケンスと sgRNA コンテキスト シーケンスに表示される列に焦点を当てます。Protospacer 隣接するモチーフ (PAM) sgRNA シーケンスが含まれていないが、コンテキストのシーケンスに注意してください。</li>
		<li>ターゲットの有効性スコアが 1 のスコアが高い開裂の効率を表す 0 から 1 の規模で予測された胸の谷間効率スコアを示しているに注意してください。</li>
		<li>'種' 関数 excel 有効性スコアまたは 'ターゲット カット %' の列をターゲットの遺伝子内の場所もターゲットを並べ替えるを使用します。 注: は、特定のドメインまたは関心のエクソンを対象とする sgRNAs を識別するのに役立ちます遺伝子内の位置によって並べ替えです。</li>
		<li>高い関心のある分野を対象とする 3-6 sgRNAs を選択 (> 0.6) ターゲットの有効性スコア。どのような種類の突然変異は目的 (ください参照図 1カルレティキュリンに使用されるターゲット戦略を説明する) 表現型行うことができます知っていることができます。 注: 他の良い候補者が不足がある場合は、推奨の 0.6 の有効性スコアしきい値以下 sgRNAs を考慮必要があります。</li>
		<li>潜在的なオフターゲット効果 (http://crispr.mit.edu/) の画面に MIT gRNA 分析 web ツールを使用します。各 sgRNA を選択、ターゲット シーケンス (PAM を含む) を実行します。 メモ: ブロード研究所 sgRNA デザイナー web ツールを使っても的外れの効果 (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) の画面に。<ol>
<li>100 のスコアが高い特異性を示すことを MIT sgRNA 解析ツールが 1 〜 100 のスケールでに各 sgRNA にスコアに注意してください。70 より大きいスコアと最小のオフターゲット効果の sgRNA を表します。このウェブサイトはまたリストを生成する候補ガイドがそれぞれのゲノムとどのように多くの不一致の別の場所にターゲットをヒット。 注: ターゲットをヒット以上 4 つの不一致は、安全14と見なされます。以下の 4 つの不一致でターゲットをヒットはエクソン14内にある場合に問題となる可能性があります。</li>
		</ol>
</li>
		<li>2-3 sgRNAs ターゲット ターゲット遺伝子のための関心領域内の異なる場所である最高のペアになっている胸の谷間効率とオフのターゲット スコアを選択 (sgRNA シーケンスCalrのエクソン 9 をターゲットのテーブル 1を参照)。 注: 実験の目的に応じてより大きい重点は上記のツールから得られる別の値に置かれるかもしれない。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. クローニング sgRNA Oligos13
<ol><li>
前方のオリゴを生成します。
	<ol>
<li>PAM サイトなし sgRNA シーケンスの一覧を作成します。</li>
		<li>SgRNA シーケンスの 5' 端が G ではない場合、シーケンスの 5' 端に G を追加します。 注: この G は、U6 駆動 sgRNA 転写レベルを最大化するため必要です。G の添加は、m1 sgRNA (表 1) に必要です。</li>
		<li>G 最適化ガイド シーケンス (ない PAM) の 5' 端にシーケンス"CACC"を追加 (テーブル 2) BsmBI に焼なまし oligos のライゲーションに必要なオーバー ハングを生成するためにlentiGuide ベクトルを消化 (手順 3 を参照してください).
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
逆のオリゴを生成します。
	<ol>
<li>逆の補数 G 最適化ガイド シーケンス (PAM なし)。</li>
		<li>逆補完 G 最適化ガイド シーケンス (表 2) の 5' 末端に"AAAC"シーケンスを追加します。</li>
		<li>プライマー合成会社から設計されていた oligos を注文します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アニールし、oligos をリン酸化
	<ol>
<li>前方オリゴ (100 μ M)、逆オリゴ (100 μ M) の 1 μ L の 1 μ L を追加、1 μ L T4 結紮 x 10 のバッファー、T4 ポリヌクレオチド キナーゼ (pnk 式) の 0.5 μ L と H2O PCR チューブに 6.5 μ L (合計 = 10 μ L)。</li>
		<li>たちで次のプログラムを実行: 30 分、95 ° C 5 分、0.1 で 25 95 からランプ 37 ° C ° C/s。</li>
		<li>H2o. に反応生成物を希釈します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. lentiGuide Puro ベクトル13の消化
<ol><li>
ダイジェスト lentiGuide Puro ベクトル
	<ol>
<li>次のコンポーネントと 50 μ L 消化反応を組み立てる: 円形プラスミド、2 μ L (30 台) BsmBI 制限の酵素、制限酵素バッファーと H2o. の 50 μ L まで 5 μ L の 5 μ g</li>
		<li>55 ° C で 2 時間反応を実行します。最初の 1 時間後、1 μ L 以上の制限の酵素の BsmBI を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dephosphorylate カットのバックボーン
	<ol>
<li>脱燐酸化酵素反応バッファーの 7 μ L とホスファターゼ酵素の 2 μ L を消化のベクトルに追加します。</li>
		<li>37 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR は、カットと商業キットを使用して脱燐酸化されたバックボーンを浄化します。 注: 代替 miniprep キットで提供されているピンク色のついた列青の色のついた列これらより大型プラスミドのサイズに対応することができますので。(2 番目の時間を通って最初の溶出から溶離された DNA を実行) に二倍列から DNA を溶出して溶出バッファーで溶出する前に 90 ° C の熱ブロックを加熱することによって、収量を増やすことができます。</li>
</ol>4. 結紮 ofAnnealed Oligos 消化バックボーン13に
<ol><li>追加 50 消化バックボーン、1 μ L の ng 焼鈍オリゴ希釈、1 μ L T4 結紮 x 10 のバッファー、T4 リガーゼと H2O PCR チューブに 10 μ L まで 1 μ L。室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>Ligation の反作用の 2 μ L で Stbl3 セルを変換します。100 μ g/mL アンピシリンとホストゲノム スープ (LB) 寒天プレート上にプレートし、37 ° C で一晩インキュベート</li>
	<li>3 コロニーをピックアップし、小型準備文化に接種します。</li>
	<li>
正しいオリゴ挿入を検証します。
	<ol>
<li>それぞれの文化や商業キットを使用して U6 プロモーターのプライマーから始まってオリゴ挿入部位により、一連の miniprep を実行します。</li>
		<li>Midi 準備またはシーケンス確認文化のマキシ prep を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 世代携帯 lLines 安定を表現する SpCas9 の
注: このプロトコルには、レンチ ウイルス感染によって pLX_TRC311 Cas9 プラスミドの配信が含まれます。このプロトコルはマウス インターロイキン 3 (mIL-3) 依存 pro-B (Ba/F3) 細胞、懸濁液のセルラインの詳細に記載されて、セル タイプごとに最寄りの培養条件を使用して他のセル型に合わせることができます。Ba/f3 細胞の培養液から成っている 10% 牛胎児血清 1% ペニシリン/ストレプトマイシン添加 RPMI/L-グルタミンとマウス インターロイキン 3 10 ng/mL。
<ol><li>
HEK 293 t 細胞を transfect します。
	<ol>
<li>10 cm 培養皿あたり 3 × 106 HEK 293 t 細胞を播きます。トランスフェクション前に一晩シード細胞を保ちます。 注: HEK 293 t 細胞付着性のセル行、ウイルス産生に日常的に使用されます。セルは、10% 牛胎児血清 1% ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミンを DMEM に保持されます。セルは、トランスフェクションの時点で 80% の合流をする必要があります。</li>
		<li>前の暖かい減少血清メディア (Opti MEM) と成長媒体。</li>
		<li>チューブに低下した血清中メディアの 500 μ L、pLX_TRC311 Cas9 構築、pCMV VSV G レンチ ウイルス包装プラスミドの 4 μ g と psPAX2 レンチ ウイルス包装プラスミドの 4 μ g の 7 μ g を追加します。 注: 293 t 細胞の 10 cm 皿あたりの全 DNA は 15 μ g です。</li>
		<li>DNA をよく混ぜ、トランスフェクション試薬の 45 μ L を追加します。軽く混ぜて、20 分間放置します。 注: 血清は、トランスフェクション試薬とプラスミド DNA との複合体形成を阻害するため低下した血清中のメディアを使用することが重要です。</li>
		<li>293 t 板の古い培地を吸引し、新しい成長培地 5 mL を追加します。</li>
		<li>293 t プレートにドロップ賢明な方法で DNA、トランスフェクション試薬のミックスを追加します。ゆっくり旋回し、24 h の CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。</li>
		<li>24、48 h ポスト トランスフェクションでウイルス上清を収穫します。クリオバイアル管 (1.6 mL/チューブと 1.5 mL は感染症に使用する) に 0.22 μ m のフィルターそして因数を通過します。</li>
		<li>-80 ° C のウイルス上清を保存します。 注: レンチ ウイルス上清は、6 ヶ月以内に使用できます。可能であれば、spinfection 伝達対象となる新鮮なウイルス)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ba/f3 細胞のレンチ ウイルス感染
	<ol>
<li>凍結されている場合は、氷の上のウイルス上清を解凍します。</li>
		<li>4 分の 300 x g で細胞を遠心します。</li>
		<li>上清を吸引し、3 x 106セル/mL の濃度で細胞を再懸濁します。</li>
		<li>再懸濁細胞、ウイルス上清の 1.5 mL、polybrene の 4 μ L を 500 μ l 添加 (在庫: 2 mg/mL) と 6 も組織培養プレートに m IL3 10 ng/mL。含めるコントロールとしてウイルス上清ではなくメディアの 1.5 mL でも、感染していないことを確認します。 注: ウイルス上清を追加量は感染 (MOI) の多様性に対応する必要があります < 1。</li>
		<li>37 ° C で 120 分の 440 x g でプレートを遠心分離します。</li>
		<li>遠心分離機からプレートを取ると 37 ° C および 5% の CO2インキュベーターに配置し、一晩成長することができます。</li>
		<li>24 h 後スピンダウンするとセルと 6 ウェル プレートで新鮮な暖かいメディアの 5 mL で再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cas9 感染細胞の選択
	<ol>
<li>セルを回し、ブラストサイジン、48 h のポスト spinfection の 5 μ G/ml を添加した新鮮な暖かいメディアで再懸濁します。</li>
		<li>ブラストサイジンまたは感染していない (否定的な) 制御の細胞が死んでいるまで 9 日のセルを選択します。</li>
		<li>選択が完了したら、一度耐性細胞をブラストサイジンの濃度の低い媒体に転送します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Cas9 のレポーターアッセイ活動15
<ol><li>親細胞とレンチ ウイルス感染によって pXPR-011 と Cas9 を安定に発現する細胞を変換 (手順 5.1 5.2 を参照)。 注: このベクトルには GFP と GFP をターゲット ガイドの両方が含まれます。アクティブな Cas9 を含むセルは、GFP (図 2) の削減になります。</li>
	<li>セルを選択後、48 h の投稿 spinfection 2 μ G/ml が 3 日間。</li>
	<li>フローサイトメトリーによる GFP 発現のためのサンプルを分析します。 注: 50% 以上の GFP の削減は、最適な Cas9 活動を表します。50% 低下よりも小さい場合に Cas9 の活性を高めることブラストサイジン選択の高い濃度をされる可能性があります。すべての細胞は、ブラストサイジン選択を耐えることができます。この場合、他の選択のカセット Cas9 ベクトルの使用必要があります。さらに、いないすべての細胞は Cas9 の安定した表現を許容できます。この場合、Cas9 のトランスフェクションを使用可能性があります。</li>
</ol>7. Cas9 発現細胞に sgRNAs の Spinfection
<ol><li>5.1 5.2 の手順 sgRNAs のレンチ ウイルス感染興味のセルにします。 メモ: ステップ 5.1.3、セクション 4 から検証 lentiGuide Puro 構造 pLX_TRC311 Cas9 構築を取り付けます。</li>
	<li>48 h は spinfection の記事、ピューロマイシン 2 μ g/mL で 3 日間のセルを選択します。</li>
	<li>抗生物質の濃度の低い媒体に耐性細胞を転送し、十分な編集を許可する 4 日間別の選択を続行します。</li>
</ol>8. ba/f3 細胞変換と m IL3 撤退を使用して肯定的な選択
注: この試金ミル 3 依存 ba/f3 細胞について、サイトカイン依存セル行に適用することができます。
<ol><li>指数関数的に成長している ba/f3 細胞異所萌出へ Cas9 と関心の sgRNA を表現するスピンダウンします。</li>
	<li>上清を吸引し、5 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞を洗ってください。</li>
	<li>スピン ・ ダウン セルと 8.2 の洗浄手順を繰り返します 4 回 (この手順により、メディアが IL 3 の自由)。</li>
	<li>PBS を吸引し、IL 3 せず新鮮なメディアの 5 mL の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>診断または細胞生存率アナライザーを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>シード IL 3 せず新鮮なメディアの 2 mL の容量で 1 x 10 の5セル/ml の濃度で 6 も組織培養プレートで 3 通のセル。</li>
	<li>監視し、8 日間の合計は 2 日おきのセルをカウントします。 注: 通常 IL 3 に欠けている ba/f3 細胞が死ぬ IL 3 飢餓の 2 日後。アッセイのネガティブ コントロールを含めることが重要です (通常非ターゲットのガイドはコントロールとして使用されます)。</li>
</ol>9. CRISPR ターゲットの編集のスクリーニング
<ol><li>SgRNA 胸の谷間サイトの下流・上流のプライマーのスクリーニング CRISPR をデザインします。 注: は、巨大挿入・ sgRNA ・ ターゲット ・ サイトの削除 (塩基) によって検出を受けないだろうように予測された胸の谷間サイトからプライマー、少なくとも 100 bp を使用します。</li>
	<li>(成長曲線の終わり) 変換された細胞および細胞前サイトカイン撤退からゲノム DNA (gDNA) を分離します。 注: は常に遺伝子の編集用のコントロールとして非ターゲット ガイドを過剰発現細胞を含みます。前に、と後、変換に対して積極的に選択されたクローンが識別され、増殖性の利点を持っている細胞から gDNA を分離します。</li>
	<li>次のコンポーネントで 50 μ L の PCR を組み立てる: 2 x PCR ミックス、前方プライマー (10 μ M)、逆プライマー (10 μ M) の 1 μ L、gDNA と H2O 50 μ L までの 50-100 ng の 1 μ L を 25 μ l 添加します。 注: 多数の高品質なポリメラーゼは 9.3 の手順で使えます。</li>
	<li>たちの次のパラメーターを使用して、サンプルを実行: 1 分の 95 ° C、30 のサイクル (94 ° C 1 分、52 ° C、30 s、30 のための 72 ° C s) と 10 分のための 72 ° C。この PCR は、表 3に掲げるCalrプライマーに最適です。9.1 gDNA をテストに基づいた手順で設計されたプライマーのため PCR 条件を最適化します。</li>
	<li>1 x トリス-酢酸-EDTA (TAE) バッファーを使用して 10 V/cm 2% アガロースゲルで 5 μ L のサンプルを実行します。存在のためのサンプルを調べる/増幅バンドがない場合は興味の遺伝子のサイズに対応します。</li>
	<li>PCR の反作用 (45 μ L) の残りの部分を使用して、PCR の浄化を実行します。</li>
	<li>キット プラスミッドのベクトルへのクローニングは PCR で、amplicons のクローンを作成します。たとえば、T 簡単 pGEM ベクトルは通常使用されます。</li>
	<li>Stbl3 細胞または他の互換性のあるセルおよび関連抗生物質と LB 寒天培地プレート上にプレートにプラスミッドを変換します。10-20 のコロニー、小型の準備、各 1 つを選択、サンガーの各クローンを対象とオクターリピート CRISPR/Cas9 編集から作成を特徴付けるためのシーケンス。 注: 必要な場合、並べ替え (FACS) を一括で実行でした単一蛍光活性化セル編集特定塩基を持つクローンを分離する人口です。さらより確実にターゲットに sgRNA ターゲット地域にまたがる PCR 産物のディープ シーケンスを使用して、編集を定量化する次世代シークエンシング (NGS) のメソッドを使用できます。たとえば、分解または潮によってオクターリピートの追跡を subcloning 代わりに使用して、スペクトルと細胞 (https://tide.nki.nl/#about)16のプールで生成標的突然変異の頻度を正確に決定できます。</li>
</ol>

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<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22NatBiotechnol%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).</li>
</ol>

我々 は本レポートに関する利害の対立があります。

ここで我々 は造血細胞のCALR突然変異の生物学的機能を研究する CRISPR/Cas9 遺伝子編集の使用を示します。このプロトコルの成功は複数の要因に依存します。まず、どのような種類の突然変異は、望まれる表現型の責任を知ることが重要です。このプロトコルでは読み出しはミル 3 独立 ba/f3 細胞のトランスフォーメーションと突然変異の種類です。 CALRのエクソン 9 オクターリピート。しかし、望ましい突然変異が単一塩基置換の場合、HDR を介した修復は好ましい方法正確な点突然変異や一本鎖か二本鎖 DNA ドナー テンプレート2,から挿入が生じますので3。 ノックアウト遺伝子は、その後、大規模なゲノム削除早いコーディング エクソンをターゲットの作成ですが20を優先する必要がある場合。
第二に、セルの行は正の選択圧のポスト サイトカイン撤退を可能にするためにサイトカイン依存をする必要...

CRISPR/Cas9 技術最近生きている細胞および生物における標的ゲノム編集をもたらしました。それは生物医学研究のための非常に強力なツールとなっている、現在遺伝病1の治療のための潜在的な道として利用されています。すべてのゲノムの編集ツールのための基礎は変更する genomic 位置で、ヌクレアーゼによる DNA 二重鎖切断 (DSB) の作成に依存します。非相同末端結合 (NHEJ) または相同監督修理 (HDR)2,3によって、Dsb を修復できます。他のゲノムの核酸、亜鉛指核酸 (ZFNs) などを工学上 Cas9 ヌクレアーゼと転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) の利点は、比較目的の DNA シーケンスにヌクレアーゼのターゲット RNA 依存性ZFNs と TALENs2,3の蛋白質 DNA 相互作用。
原核細胞4,5適応免疫系として CRISPR/Cas9 ヌクレアーゼ経路の発見は後、多くの努力は哺乳類セルライン、モデル生物2,用経路の適応になっています。3。 遺伝子編集用ツールとして CRISPR/Cas9 経路は 2 つの主要なコンポーネントを利用して: Cas9 ヌクレアーゼと sgRNAs 金利2,3の遺伝子をターゲットに化膿連鎖球菌(Sp) が派生しました。SgRNA は、20 ヌクレオチド RNA DNA 塩基の相補性2,3ゲノムの特定のサイトに、直接 Cas9 で構成されます。SgRNA のターゲット サイトは 5' SpCas9 ヌクレアーゼによって認識され、NGG の形で protospacer の隣接するモチーフ (PAM) のサイトに隣接してある必要があります。これらのツールは、sgRNAs を対象とする関心領域を設計することによって任意の DNA シーケンスに Cas9 を送信できます。さらに Sp Cas9 を得、特定のアプリケーションによって異なる機能を持つ Cas9 の追加バリエーションがあります。たとえば、対象の編集に高い特異性と6、7の刻み目をつける人 DNA の単鎖切断能力 Cas9 バリエーションがあります。さらに、触媒非アクティブ Cas9 は最近転写調節8に開発され。科学者は、遺伝子のノックやノックアウト遺伝子9、機能喪失、利得関数のライブラリ画面10と遺伝子の生物学的機能を研究するなど、アプリケーションのさまざまな CRISPR/Cas9 システムを使用している今モデル生物11工学。
このプロトコルではCALRの突然変異の生物学的機能を理解する、ba/f3 細胞形質転換試験 CRISPR/Cas9 の方法論と組み合わせています。Ba/f3 細胞は IL 3 に表示できるマウス IL 3 依存造血細胞ライン BCR-ABL12など特定の遺伝子の発現に依存します。変異カルレティキュリン ba/f3 細胞サイトカイン依存性の成長を変換できるかどうかを理解するためには、CRISPR/Cas9 を使用して塩基変異を導入する内因性のCalr座のエクソン 9 を対象とし、適用するセルから IL 3 を撤回した、正の選択圧、MPN 患者は、利得関数のCALR突然変異をさたことを目標にします。デザイン、クローニング、sgRNAs、Cas9 の安定発現細胞の開発の配信プロトコルが含まれ、CRISPR 検診対象の遺伝子編集します。このプロトコルは異なる遺伝子または様々 なサイトカイン依存性細胞線に適用できるし、モデリングと癌関連遺伝子の生物学的機能を勉強で特に有用。

<table><tbody><tr><td>BsmBI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>ブラストサイジン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>15025</td><td></td></tr><tr><td>プロマイシン</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 細胞</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ<td></td><td></td>51985034</tr><tr><td>RPMI</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>オメガサイエンティフィ</td>ック <td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>mIL-3</td><td>ペプロテック</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pLX_TRC311-Cas9</td><td>Addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>pXPR-011</td><td>Addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Genessee Scientific</td><td>25-507</td><td></td></tr><tr><td>TAE buffer</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FERB49</td><td></td></tr><tr><td>LentiGuide-Puro</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #52963</td><td></td></tr><tr><td>PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

クラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) は CRISPR 関連 (Cas) 9 サイト固有の真核生物ゲノムのなどの RNA 誘導の核酸を生成する科学者によって用途が変更されている原核生物の適応免疫システム編集します。Cas9 によるゲノム工学を使用して、効率的に、簡単に、確実が多く biomedically に関連する哺乳類細胞および生物における内在性の遺伝子を変更します。ここで特定の遺伝の突然変異の生物学的機能を理解する CRISPR/Cas9 方法論を利用する方法の例を紹介します。シングル ガイド Rna (sgRNAs) 特定の地域における内因性Calr座をターゲットの配信によってカルレティキュリン (CALR) 変異によるインターロイキン 3 (mIL-3) 依存プロ B (Ba/F3) 細胞内モデル、挿入・削除 (塩基) 骨髄増殖性腫瘍 (MPN)、血液の癌の種類と患者のCALRの突然変異が発生します。SgRNAs は、非相同末端結合 (NHEJ) 様々 なサイズの indels の扱いを与えることで修復されている対象地域の二重鎖切断 (Dsb) を作成します。我々 は、造血細胞変換のCalr突然変異の生理的レベル式の効果を理解する、標準 ba/f3 細胞形質転換試験を採用しています。このアプローチは、様々 な哺乳類細胞の生物学的機能を研究する他の遺伝子に適用できます。

ここで説明した方法を使用して、この実験の目的は、内因性造血細胞形質転換Calr遺伝子座に塩基変異導入機能の効果です。CRISPR/Cas9 システムは、ba/f3 細胞の内因性のCalr突然変異を作成するツールとして使用されます。2 sgRNAs は、 CALRで通常発生の挿入または削除 (塩基) 変異領域でエクソン 9 のCalr (図 1) をターゲットに選ばれた-変異 MPN 患者17,18。(M1) の最初の sgRNA は、その高い開裂の効率と良好なオフのターゲット スコアに基づいて選ばれました (表 1)。2 番目の sgRNA (m2) エクソン 9 内での位置のために主に選ばれた、高開裂の効率と良好なターゲットを編集領域に追加の sgRNAs の欠乏のためのスコア (<stro...

CRISPR/Cas9 を使用して、編集対象となる遺伝子は、遺伝子の生物機能の理解を促進しています。ここでは、その発癌性の活動を研究するためにサイトカイン依存性造血細胞のモデル カルレティキュリン変異に CRISPR/Cas9 方法論を活用します。

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

この実験の全体的な目標は、CRISPR/Cas9遺伝子編集を利用して、サイトカイン依存性造血細胞のカルレティキュリン変異をモデル化し、その発がん活性を研究することです。この方法は、ドライバー変異が生理学的レベルで発現した場合の生物学的機能など、血液悪性腫瘍領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、CRISPR/Cas9遺伝子編集システムを利用して、がんに関与する遺伝子の生物学的機能をモデル化し、研究できることです。オリゴをアニールしてリン酸化するには、氷上に保持したPCRチューブで試薬を合計10マイクロリットルに加えます。サーモサイクラーにプログラムを設定します。サイクル終了後、水を使用して反応を希釈します。lentiGuide-Puroベクターを消化するには、50マイクロリットルの消化反応を調製します。その後、55°Cのヒートブロックで消化反応を開始します。1時間後、BsmB1制限酵素のマイクロリットルを追加し、さらに1時間反応を続けます。切り取られた背骨を脱リン酸化するには、7マイクロリットルのホスファターゼ反応バッファーと2マイクロリットルのホスファターゼ酵素を消化ベクターに加えます。次に、混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。すでに切断され、脱リン酸化された背骨を市販のキットを使用して精製します。ライゲーション混合物を調製するには、氷上に保持したPCRチューブに15ナノグラムの消化した背骨およびその他の試薬を加え、水で容量を10マイクロリットルに調整します。反応を室温で1時間インキュベートします。次に、STBL3適合細胞を2マイクロリットルのライゲーション混合物で形質転換します。次に、1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを含むリソジェニーブロス寒天プレートにプレートを付けます。この後、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。3つのコロニーを選び、接種します。各培養物のミニプレップを行い、U6プロモーター領域プライマーでオリゴ挿入部位をシーケンシングします。10cmの皿にhek293t細胞を播種します。そして、一晩のインキュベーションのためにそれを残します。トランスフェクション用のDNA混合物を調製するには、トランスフェクション試薬45マイクロリットルをDNAにピペットで注入します。ピペットを使用してDNAとトランスフェクション試薬を慎重に混合し、20分間放置します。この後、DNAトランスフェクション混合物を播種した細胞に滴下します。プレートを静かに回します。そして、5%の二酸化炭素と摂氏37度で1日インキュベートします。上清を含むウイルスを24時間後と48時間後に0.22マイクロマイターフィルターに通して収穫します。そして、各クライオバイアルに1.6ミリリットルの上清を分注します。次に、上清を吸引し、Ba/F3細胞を数回ピペッティングして培地に再懸濁します。再懸濁した細胞500マイクロリットル、ウイルス上清1.5ミリリットル、ポリブレン4マイクロリットル、およびマウスインターロイキン31ミリリットルあたり10ナノグラムを6ウェル組織培養プレートに加える。プレートを440Gで37°Cで120分間遠心分離します。遠心分離後、プレートをインキュベーターに移し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。この後、細胞を440Gで3分間スピンダウンします。そして、6ウェルプレートに5ミリリットルの新鮮な温かい培地を再懸濁します。Cas9に感染した細胞を選択するには、まず細胞をスピンダウンします。次に、48時間の感染後、ブラストシジンのミリリットルあたり5マイクログラムを補充した新鮮な温かい培地に再懸濁します。感染していないすべての細胞が死ぬまで、ブラスティックシジンで9日間細胞を選択し続けます。次に、耐性細胞をブラストシジン1ミリリットルあたり1マイクログラムの培地に移します。親細胞およびCas9を安定的に発現する細胞をpXPR-011レポーターコンストラクトでレンチウイルス感染により形質導入します。ピューロマイシン1ミリリットルあたり2マイクログラムの細胞を、感染後48時間後の3日間、選択し続けます。レンチウイルスを用いて、Cas9発現細胞にシングルガイドリボ核酸を感染させます。次に、ピューロマイシン1ミリリットルあたり2マイクログラムを使用して、感染後48時間、3日間細胞を選択します。異所性Cas9を発現する指数関数的に増殖するBa/F3細胞と、目的のシングルガイドリボ核酸をビンに入れます。上清を吸引し、5ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。細胞をスピンダウンし、リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄します。次に、細胞生存率アナライザーを使用して細胞の数をカウントします。この後、6つのウェル培養プレートでインターロイキン3を含まない2ミリリットルの新鮮培地で細胞を三重に播種します。細胞のモニタリングとカウントを2日ごとに8日間開始します。親のBa/F3細胞におけるCas9活性とCas9細胞を過剰発現するBa/F3の代表的なフロー心理測定データを以下に示します。Ba/F3ではCas9細胞を過剰発現すると緑色蛍光タンパク質シグナルが76%減少し、強力なCas9活性が示されていますが、親のBa/F3細胞では、緑色蛍光タンパク質シグナルは100%に留まるカルレティキュリンの発がん活性を示す細胞の代表的な成長曲線がここに示されている。CRISPR/Cas9を介した1塩基対のフレームシフト変異は、m1およびm2シングルガイドRNaseを使用して、カルレティキュリンのエクソン9遺伝子座に導入されました。Ba/F3トロンボポエチン受容体Cas9細胞を標的とするカルレティキュリンの成長曲線は、マウスインターロイキン3非依存性の成長を示しています。しかし、他の細胞タイプの成長曲線は、サイトカインに依存しない増殖を示していません。シーケンシングの結果は、m1およびm2シングルガイドRNaseを使用して、カルレチクリン標的Ba/F3トロンボポエチン受容体Cas9細胞における内婦人性カルレティキュリンエクソン9のオンターゲット編集を確認しています。プラス 1 塩基ペアのフレーム シフト変異は黒で示されます。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば2週間で完了します。この手順を試みる際には、目的の遺伝子のどのような種類の突然変異が、目的の表現型に関与している可能性があるかを理解することが重要です。この手順に続いて、細胞シグナル伝達またはタンパク質タンパク質相互作用におけるその役割など、突然変異をさらに特徴付ける他の方法を実行して、病気を引き起こすメカニズムをさらに理解することができます。その開発後、この技術は、血液学の分野の研究者が、Ba/F3造血細胞の細胞形質転換に対する生理学的レベルでの機能獲得変異の影響を調査する道を開きました。このビデオを見れば、CRISPR/Cas9遺伝子編集法を利用して、サイトカイン依存性造血細胞における機能獲得型変異の発がん活性を調査する方法について十分に理解できるはずです。レンチウイルスの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、BL2 plus施設での作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Cancer Research

がん研究

高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9...

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

組立 Cas9 を利用した複雑なリボ核タンパク質 (RNP)...

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

CRISPR/Cas9システムによるマウス造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の高効率ゲノム編集のためのプロトコルは、造血系特異的遺伝子改変を用いたマウスモデルシステムを迅速に開発する。...

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

組み立て済みのCas9/ガイドRNAリボヌクレオタンパク質複合体の直接送達は、血行細胞におけるゲノム編集のための迅速かつ効率的な手段である。ここでは、このアプローチを用いてRUNX1イントロニックサイレンサーを削除し、OCI-AML3白血病細胞における転写応答を調べる。...

急性骨髄性白血病細胞におけるCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質によるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割の調査

頭頸部癌患者で変異した特定の遺伝子を有するマウスモデルの開発は、新生物の理解のために必要とされる。ここでは、アデノ関連ウイルス-Cas9系を用いた原発マウス舌細胞の体外変換に関するプロトコルを提示し、特定のゲノム改変を有するマウスHNC細胞株を生成する。...

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

造血幹細胞生物学および造血悪性腫瘍をよりよく研究するためには、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の体細胞変異を忠実にモデル化するための新しい戦略が必要です。ここでは、CRISPR/Cas9とデュアルrAAVドナー形質導入の使用を組み合わせることにより、HSPCにおけるヘテロ接合機能獲得変異をモデル化するためのプロトコルについて説明します。...

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

Cas9トランスジェニックマウスの初代T細胞へのガイドRNAのレトロウイルス形質導入のプロトコールを提示し、Th17分化の研究における遺伝子編集の効率的な代替手段を提供します。...

in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング

THP-1細胞株は、さまざまな生物学関連研究領域において、ヒト単球/マクロファージの機能を調べるためのモデルとして広く使用されています。この記事では、効率的なCRISPR-Cas9ベースのエンジニアリングとシングルセルクローン単離のためのプロトコルについて説明し、堅牢で再現性のある表現型データの生成を可能にします。...

エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

ここでは、CRISPR/Cas9技術とCell Counting...

CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

学ぶCRISPR/Cas9遺伝子編集を用いてサイトカイン依存性造血細胞におけるカルレティキュリン変異の発癌活性を調査する方法。生理的発現レベルでのドライバー変異の生物学的機能を解明し、血液悪性腫瘍研究に貢献します。

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