Name: スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学ぶ パーティクルボンバードメントによるオオムギ糊粉層での遺伝子発現測定法。自動粉砕と96ウェルプレート酵素アッセイによりスループットを向上させ、植物ホルモン応答の研究を効率化します。

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著者は、グレイソン バトラーとマーガレット ・ バレットを実験、ジュディ石粒の均質化についてのアドバイスを蛍光についてのアドバイスをリン ・ ハナムの遂行に助けに感謝します。この作品は全米科学財団 (IOB 0443676) 支えられた制度開発賞 (アイデア) から国立科学研究所の一般医療 [許可番号 P20GM0103423、健康の国民の協会からの補助金コルビー大学自然科学部

1. エフェクターとレポーターの遺伝子の準備を構築します。
<ol><li>目的の開いたリーディング ・ フレームからドライブ式に構成プロモーター (例えばトウモロコシ ユビキチン、 UBI) を採用しているエフェクターの構造を構築します。たとえば、TaABF1 の5ドライブ強い恒常発現するUBI::TaABF1を含んでいるプラスミッドを構築します。</li>
	<li>ガスなどの開いたリーディング ・ フレームの上流側に配置その活動は測定されるプロモーターを含む記者構造を構築します。たとえば、 HVA1プロモーター2、5からの表現を測定するHVA1::GUSを含んでいるプラスミッドを構築します。</li>
	<li>内部統制構築を構築 (例えばUBI::ルシフェラーゼ)。</li>
	<li>シリカ結合列を使用して (材料の表を参照) をプロトコル、ごとに必要な遺伝子構造の高品質のプラスミッドの準備します。紫外分光法を用いた (参照材料表)、慎重にそれぞれのプラスミッドの準備の濃度を測定します。</li>
</ol>2. 大麦の爆撃の準備
<ol><li>スプレッドシートの設定 (例については図 1を参照) は、殺到するプラスミド、適切なホルモン治療と実験の一部となる各処置のための他の関連情報を示します。</li>
	<li>ヒマラヤ大麦 (実験に含まれている各治療のため 40) の穀物から胚を切ったまな板と滅菌のかみそりの刃を使用します。変色または平均より大幅に小さい粒を除外します。</li>
	<li>すべての無胚穀物を 50 mL チューブに配置します。10 分の水と岩石の 40 ミリリットルを追加します。</li>
	<li>慎重に (穀物を失うことを避けるため) に水を注ぐし、10% の漂白剤の 40 mL を加えます。20 分の岩。</li>
	<li>漂白剤を注ぐ、40 mL の滅菌水を追加します。5 分間ロック。この滅菌水洗浄を 4 回繰り返します。</li>
	<li>ラガータイプ ソリューション (コハク酸ナトリウム 20 ミリメートル、20 ミリメートル塩化カルシウム、pH 5.0) の 40 mL を加えて、クロラムフェニ コール原液 (10 mg/mL) の 40 μ L。</li>
	<li>(クロラムフェニ コール) ラガータイプの溶液のほとんどをチューブからバーミキュ ライト プレートに転送 (材料の表を参照してください)。バーミキュ ライト プレートでろ紙の表面に粒を転送します。粒を均等に します。(しかし完全に) 部分的に穀物を維持する十分な imbibing ソリューションに注ぐが冠水しました。バーミキュ ライト板の上にふたを配置します。</li>
	<li>蛍光灯で約 48 時間の 24 の ° C で無胚穀物を孵化させなさい。必要に応じて追加のラガータイプのソリューションを追加します。</li>
	<li>90 mm プラスチック シャーレを開くし、逆の蓋に自体と 20 mL の皿にラガータイプ溶液 20 mL を注ぐ。クロラムフェニ コール (10 mg/mL) の 20 μ L をそれぞれに追加します。アルコールでそれらを浸すことによって細かい点鉗子の 2 つのペアを滅菌します。</li>
	<li>シャーレの蓋に無胚穀物のいくつかを配置します。鉗子を使用して、優しく各結晶粒から種皮 (透明) を削除します。穀物の滑らかな側面から種皮を除去しながら基礎となる (アリューロン) 細胞に損傷を与えない。皮をむかれた穀物を含むラガータイプ液シャーレに転送します。</li>
	<li>すべての穀物から種皮を剥離後バーミキュ ライト プレートに戻します。24 ° C で皮をむいた無胚粒は、16-20 時間インキュベートします。</li>
	<li>砲撃の粒を使用して、直前にシャーレに濾紙の間それらの動揺によって表面の水分を削除します。</li>
</ol>3. 砲撃のプラスミッド DNA の準備
<ol><li>1.5 mL チューブの衝突実験に含まれるそれぞれの治療のためにラベルを付けます。各管にUBIの 2.5 μ g を追加::ルシフェラーゼ内部統制プラスミド、 GUSレポーター プラスミドとエフェクター プラスミドの必要な量 (2.5 μ g に通常 0.025 μ g) の 2.5 μ g。5 μ L の総ボリュームをさせる水を追加します。</li>
	<li>1.6 μ m の金 microcarriers (材料の表を参照) を準備次プロトコル6を公開しました。</li>
	<li>各治療のプラスミド DNA を含む 1.5 mL チューブに中断された microcarriers の 50 μ L を追加します。製造元のプロトコル6によるとプラスミド DNA と microcarriers をコートします。</li>
	<li>最後のステップでプラスミド コーティング microcarriers 48 μ L 100% エタノール, 5 macrocarriers のそれぞれに中断された microcarriers のピペット 8 μ L で中断され、空気にそれらを許可するときは乾燥します。</li>
</ol>4. パーティクルガン無胚オオムギ子実の
<ol><li>粒子衝突装置 (材料の表を参照) を設定6。</li>
	<li>1550 psi 破裂ディスクにキャップを保持し、楽器でそれをマウントします。</li>
	<li>(一緒に停止画面) 目的プラスミドの組み合わせを含む macrocarrier をマイクロ ・ キャリアの進水アセンブリに配置します。アセンブリを照射室の一番上のスロットに挿入します。キャップと標準距離 (6 mm)、macrocarrier カバーの蓋を保持するラプチャー ディスクの間の距離を設定し、11 mm (図 2 a) の macrocarrier 走行距離を許可する (標準) の中間位置に停止画面サポートを配置します。</li>
	<li>90 mm のシャーレの蓋にフラット ダウン テープろ紙円に (内側を指して薄く終了) とタイトな放射状パターンで 8 無胚穀物の手配 (図 2B参照)。</li>
	<li>停止画面から 6 cm の距離で照射室に穀物が付いている皿を配置します。</li>
	<li>95 kpa 照射室を避難し、サンプルを砲撃します。</li>
	<li>真空を解放した後 1 mg/ml クロラムフェニ コールを含むラガータイプ溶液 4 mL を含むラベル 60 mm のペトリ皿に衝撃された穀物を転送します。</li>
	<li>衝突のすべてが完了するまでを繰り返します。24 時間、24 の ° c の (100 rpm で動揺のプラットホーム) の孵化させなさい。</li>
</ol>5 衝撃された穀物からの可溶性タンパク質抽出
<ol><li>鉗子を使用すると、60 mm のペトリ皿から 8 衝撃された穀物を削除し、それらをペーパー タオルの上に乾燥しみ。それぞれ 800 μ L を含む 2 つのラベル付きの 2.0 mL チューブ (管あたり 4 粒) に穀物を分ける研削バッファー (100 mM Na リン酸塩 pH 7.2, 5 mM DTT、10 μ G/ml leupeptin、20% グリセロール) と 5 mm ステンレス鋼ビード。衝撃された穀物のすべてに対してこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>(最大 48) 2.0 mL チューブをビード ホモジナイザーの 2 つのラックに配置 (材料の表を参照してください)。ホモジナイザーでラックをマウントします。</li>
	<li>サンプルを 30 Hz で 3 分間振る。</li>
	<li>ホモジナイザー ラックをホモジナイザーから外し、再度サンプルを冷却するアイス (5 分) の上に置きます。</li>
	<li>反対の方向で - ホモジナイザー戻ってラックをマウントします。3 分間、30 Hz で再度サンプルを振る。</li>
	<li>5.5 手順 5.3 を繰り返します氷の上のラックにクールします。これは揺れの 12 分の合計追加されます。</li>
	<li>10 分の 4 ° C で 16,000 x g で穀物抽出物を遠心分離します。</li>
	<li>
すぐに、遠心分離後マイクロ遠心チューブ用の 2 番目のセットにクリアの培養上清をデカントします。各管の迅速な渦を与えます。氷の上には、チューブを格納します。</li>
	<li>上清を転送した後洗浄および再利用できるように、スチール ビーズをペレットから回復します。</li>
</ol>6. 穀物抽出物からルシフェラーゼ活性の測定
<ol><li>各管に試金する穀物エキス、ルシフェラーゼ アッセイ混合物の 200 μ L を含む 12 × 75 mm ガラスの試験管を準備 (45 mM Tris 硫酸 pH 7.7、15 mM MgCl2、20 mM DTT、1.5 ミリメートルの EDTA、1 mM ルシフェリン 1 mM ATP)。</li>
	<li>最初の試験管に最初の穀物抽出液 100 μ L を追加します。渦に迅速によく混ぜます。すぐにルミノのチューブ ホルダーに管を配置し、ドアを閉じます。測定が終了したら、ルミノ-次の管の配置のためのドアを開けっ放しからチューブを削除します。</li>
	<li>このプロセスを繰り返して、すべてのサンプルが測定されています。</li>
</ol>7. 穀物抽出物から GUS 活性の測定
<ol><li>96 well プレートの各ウェルに GUS アッセイバッファー (50 mM Na リン酸塩 pH 7.2、2.5 mM-メチルウンベリフェリルグリコシド - D-グルクロニド、10 mM DTT、2 ミリメートルの EDTA、10 μ G/ml leupeptin、メタノール 20%、0.02% アジ化ナトリウム) の 200 μ L を追加します。</li>
	<li>各穀物の場所の 50 μ L をよく対応するのに抽出します。ミックス チップを追加した後。フィルム シールの上部をシールします。</li>
	<li>暗闇の中で 37 ° C で 96 well プレート間 20 時間インキュベートします。</li>
	<li>10 分の 4 ° C で 4,000 x g で 96 ウェル プレートを遠心し、氷の上に置きます。</li>
	<li>黒 96 well プレートの各ウェルに 0.2 M Na2CO3の 250 μ L を追加します。</li>
	<li>対応する各遠心ガス分析の混合物の 6.25 μ L を追加まあ (含む 0.2 M Na2CO3) ブラック 96 ウェル プレートします。ミックス チップを追加した後。基準として 6.25 μ 10 μ M、40 μ M、100 μ M 4-メチルウンベリフェロンと井戸があります。</li>
	<li>プレート蛍光光度計に黒いプレートを置き、メチルウンベリフェロンの蛍光を読み取る。360 の励起波長での測定値を取る nm、発光波長 460 nm。40 μ M 4-メチルウンベリフェロンのも含む 6.25 μ L と 0.2 M Na2CO3の 250 μ L 1000 蛍光ユニットの読書を与えるような楽器のゲインを設定します。</li>
</ol>8. データ分析
<ol><li>スプレッドシートにルシフェラーゼと GUS の試金のための値を入力します。これは遺伝子構造がアリューロン細胞に正常に配信されないことを示します、20,000 の相対発光ユニットの-1より低いのルシフェラーゼ読んですべてのサンプルを対象から除外します。</li>
	<li>各正常に衝撃された穀物の (4 つの無胚穀物のグループを表す) を抽出し、ガスとルシフェラーゼの生データから正規化されたガス式を次のように計算: GUS を正規化 = [(空白ガス - ガス式) (2,000,000) x]/(ルシフェラーゼ式-ルシフェラーゼ空白)。 注: これは何は 2,000,000 のルシフェラーゼ読書与えた砲撃で観察されて GUS 活性量を正規化します。</li>
	<li>エフェクターの構造やエフェクターやホルモンの欠如で式のレベルを比較することによってテストされているホルモン治療の存在下で特定の報道記者構造の表現の相対的なレベルを報告します。</li>
</ol>

<ol><li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Integ.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li>
<li>Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gibberellin+response+complex+in+cereal+alpha-amylase+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters.</a> Plant Cell. 4, 203-211 (1992).</li>
<li>Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+nature+of+abscisic+acid+%28ABA%29+response+complexes%3B+composite+promoter+units+that+are+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression.</a> Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).</li>
<li>Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibberellin%2Fabscisic+acid+antagonism+in+barley+aleurone+cells%3A+site+of+action+of+the+protein+kinase+PKABA1+in+relation+to+gibberellin+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules.</a> Plant Cell. 13, 667-679 (2001).</li>
<li>Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wheat+PKABA1-interacting+factor+TaABF1+mediates+both+abscisic+acid-suppressed+and+abscisic+acid-induced+gene+expression+in+bombarded+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells.</a> Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).</li>
<li>Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+TaABF1+during+abscisic+acid+and+gibberellin+signaling+in+aleurone+cells+of+cereal+grains%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Science+Res%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains.</a> Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).</li>
<li>Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+definition+of+ABA-response+complexes%3A+the+promoter+units+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression+in+barley+%28Hordeum+vulgare%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare).</a> Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).</li>
<li>Ritchie, S., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+signal+transduction+in+the+barley+aleurone+is+mediated+by+phospholipase+D+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).</li>
<li>Takemiya, A., Shimazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+inhibits+blue+light-induced+stomatal+opening+via+inhibition+of+protein+phosphatase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1.</a> Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).</li>
<li>Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+WRKY+gene+from+creosote+bush+encodes+an+activator+of+the+abscisic+acid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).</li>
<li>Ishibashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+are+involved+in+gibberellin%2Fabscisic+acid+signaling+in+barley+aleurone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells.</a> Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).</li>
<li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li>
<li>Hong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-mediated+regulation+of+a+rice+ABA+responsive+element+binding+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor.</a> Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).</li>
<li>Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABI5+acts+downstream+of+ABI3+to+execute+an+ABA-dependent+growth+arrest+during+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination.</a> Plant J. 32, 317-328 (2002).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS2-LIKE+PROTEIN+KINASE5%2C+an+SNF1-RELATED+PROTEIN+KINASE3-Type+protein+kinase%2C+is+important+for+abscisic+acid+responses+in+Arabidopsis+through+phosphorylation+of+ABSCISIC+ACID-INSESENSITIVE5%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5.</a> Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

パーティクルガンによるエフェクター遺伝子の導入構築、記者構造の過渡式続いて GA/ABA シグナル伝達経路と結果ホルモン調節遺伝子で特定の俳優の役割を解剖するための重要な戦略式です。 ただし、大麦アリューロン細胞2,3,4,5,6でこのような実験を行うための既存のプロトコルは非常に労働集約的であります。各グループはほとんどさらされている穀物は、乳鉢と乳棒、均質化の手をする必要があります、結果の抽出物は、ガスとルシフェラーゼ活性のため個別に試金されます。現在のプロトコルは、したがって同じ実験に含めることができる、各治療に含めることができる合理的に生物の複製の数を制限する別の治療数を制限します。これらの制限は複数の治療法を比較する包括的かつ同時遂行がより難しくそれ。このような比較は、治療の間の遺伝子発現の違いはさ...

オオムギ糊粉層、植物1におけるホルモン調節遺伝子発現の研究の確立されたモデル システムです。特に、発芽や苗の早期開発のために必要な遺伝子の数はアブシジン酸 (ABA) によるストレス反応に関連する遺伝子が活性化しながらジベレリン (GA) によってアクティブ化されます。GA と ABA シグナル伝達経路が絡み合っている ABA および逆1にいくつか GA 活性化遺伝子の発現が阻害されると。
ジョージア州/ABA シグナル伝達経路で特定俳優の役割の結果を許可する記者の構成要素の過渡式に続いて、粒子の爆撃によってエフェクター遺伝子構造の導入をされている理解のための重要な戦略下流遺伝子発現が決定されます。ガス(β-グルクロニダーゼ) などルシフェラーゼレポーター遺伝子の使用エフェクター コンストラクトを受けた細胞内遺伝子発現の高感度で定量的に計測が可能します。たとえば、転写因子 TaABF15,6エフェクター コンストラクトの導入確立、ABA で誘導される遺伝子HVA1などによる TaABF1、 Amy32bなどの遺伝子の ga 処理で誘導しながら追加されなくなります。粒子衝突実験的戦略としては、ジョージア州/ABA シグナル伝達経路の多様な側面を調査する複数の研究所で使用されています。このような作業は、ga 処理で誘導2の ABA 誘導遺伝子3、活性化のため重要なプロモーター同定し、蛋白質キナーゼ4の発見につながっているし、転写因子を調節する5これらの遺伝子の表現。
既存プロトコル2,3,4,5,6パーティクルガンと一時的な遺伝子発現のそれに続く測定は、各一連の砲撃労働集約的、します。ほとんどの穀物は乳鉢と乳棒で手作業で均質化し、酵素試金は個別に実施します。この原稿は部分的に自動化および均質化手順を合理化する改善されたプロトコルを報告し、GUS のかなり多くのスループットを許可する試金の同じ実験でテストされる処置の多数を許可および/または、統計的に信頼性の高い結果を得るため、それぞれの治療のためより複製の包含。転写因子 TaABF1 および GA, ABA、およびその他の規制の分子によって規制されているHVA1やAmy32bの記者構成要素の式の代表的な結果が表示されます。

<table><tbody><tr><td>GeneElute HPプラスミドMaxiprepキット</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis分光光度計</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>ヒマラヤ大麦粒/</td><td></td><td>/</td><td>さまざまなハルレスオオムギ(4°Cで暗闇に保管;C)</td></tr><tr><td>コハク酸ナトリウム</td><td></td><td>ΣS2378</td> 吸収<td>液用試薬</td></tr><tr><td>塩化カルシウム(二水和物)</td>フィ<td>ッシャー</td><td>C79-500</td> 吸収<td>液用試薬</td></tr><tr><td>吸収液</td><td>自家製</td><td>/</td><td>20 mM コハク酸ナトリウム、20 mM 塩化カルシウム、pH 5.0。使用前にオートクレーブ滅菌してください。</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>シグマ</td><td>C0378</td><td>70%エタノールで10 mg / mLのストック溶液を調製します。</td></tr><tr><td>バーミキュライト</td><td>フィッシャー</td><td>NC0430369</td><td>バーミキュライトプレートに使用されます。</td></tr><tr><td>濾紙サークル(90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>バーミキュライトと爆撃前の穀物調製に使用されます</td></tr><tr><td>バーミキュライトプレート</td><td>自家製</td><td>/</td><td>ガラスシャーレにバーミキュライト50mLを加えます。バーミキュライトの上に90mmの紙の円を置きます。オートクレーブ。</td></tr><tr><td>鉗子(細い先のとがったもの)</td><td>フィ</td><td>ッシャー13-812-42</td>大<td>麦粒の種皮を除去するために使用されます。</td></tr><tr><td>鉗子(超極細点)</td><td>フィッシャー</td><td>12-000-122</td><td>大麦粒の種皮除去に使用します。</td></tr><tr><td>金マイクロキャリア(1.6 &mu;m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>macrocarriers</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム(二水和物)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>2.5 Mのストック溶液を調製し、1 mLのアリコートを-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>100 mMのストック溶液を調製し、500 &mu;-20°CのLアリコート。C(2ヶ月以内に使用)。</td></tr><tr><td>破裂ディスク(1550 psi)</td><td>BioRad</td><td>1652331</td><td></td></tr><tr><td>停止スクリーン</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>マクロキャリアホルダー</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic粒子送達システム</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>1Mリン酸ナトリウムpH 7.2</td></tr><tr>用試薬<td>リン酸二塩基性</td>ナトリウム <td>シグマ</td><td>S9763</td><td>1Mリン酸ナトリウムpH 7.2</td></tr><tr><td>1Mリン酸ナトリウムpH 7.2</td>用試薬 <td>自家製</td><td>/</td><td>6.9gのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物と7.1gのリン酸二塩基性ナトリウムを組み合わせます。100mLに水を加えます。NaOHを添加してpH7.2を得ます。</td></tr><tr><td>ジチオスリエトール(DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td> 水<td>に溶解し、1 mL アリコートで -20°C で保存します。</td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>シグマ</td><td>L2884</td>を<td>水に10mg / mLに溶解します。.-20°Cで保管します。C.</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td>G5516</td>水<td>に50%溶液を調製します。</td></tr><tr><td>粉砕バッファー</td><td>自家製</td><td>/</td><td>10 mLの1 Mリン酸ナトリウムpH 7.2、500 &mu;1 M DTTのL、100 &mu;10 mg / mLロイペプチンのL、および50%グリセロールの40 mL。100mLに水を加えます。</td></tr><tr><td>ステンレス製スチールビーズ (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>この特定のモデルのチューブは、ホモジナイザーでの使用をお勧めします。</td></tr><tr><td>ビーズホモジナイザー (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12mm x 75 mm ガラス試験管</td><td>フィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>・ルシフェリン</td><td>・ゴールドバイオ</td><td>LUCK-100</td><td>25 mM のストック溶液を準備し、1 mL のアリコートを -20°C で保存します。</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>100 mM ストック溶液を準備し、250 &mu;-20°CのLアリコート。&nbsp;C.</td></tr><tr><td>1Mトリス硫酸塩pH 7.7用の</td><td>トリスベース</td><td>Sigma</td><td>T1503</td>試薬。</tr><tr><td>硫酸</td><td>シグマ</td><td>258105</td><td>1Mトリス硫酸塩pH 7.7用の試薬。</td></tr><tr><td>1M Tris sulfate pH 7.7</td><td>自家製</td><td>/</td><td>12.1 g Tris base を 100 mL の水に溶解します。硫酸でpHを7.7に調整します。</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>水に2 Mまで溶解します。</td></tr><tr><td>ルシフェラーゼアッセイバッファー(LAB)</td><td>自家製</td><td>/</td><td>1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 &mu;2 M 塩化マグネシウムの L、1 mL の 1 M DTT、および 200 &mu;0.5 M EDTAのL。50&nbsp; に水を追加します。ミリリットル。</td></tr><tr><td>ルシフェラーゼアッセイ混合物</td><td>自家製</td><td>/</td><td>15 mLのLABを組み合わせる、800 &mu;25 mMルシフェリンのL、200 &mu;100 mM ATPのL、および4 mLの水。これにより、十分なアッセイ混合物(20&nbsp;mL)を100ルシフェラーゼアッセイ用。</td></tr><tr><td>ルミノメーター (Sirius)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl-&beta;-D-glucuronide (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>DMSOに溶解して100 mMにします。</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>水に2%のストック溶液を調製し、1mLのアリコートを-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>96ウェルプレート(標準)</td><td>Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>GUSアッセイバッファー</td><td>自家製</td><td>/</td><td>2.5 mLのMUG、5 mLの1 Mリン酸ナトリウムpH 7.2、400 &muを組み合わせます。0.5 M EDTAのL、1 M DTTの1 mL、100 &mu;10 mg / mlロイペプチンのL、20 mLのメタノール、および1 mLの2%アジ化ナトリウム。.100mLに水を加えます。</td></tr><tr><td>TempPlateシーリングフィルム</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート(黒)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr>炭酸<tr><td>ナトリウム</td>シ<td>グマS7795</td><td></td>水<td>に200mM溶液を準備します。</td></tr><tr><td>4-メチルウンベリフェロン</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>100 &mu;水中のM溶液。1mLのアリコートを-20°Cで凍結します。&nbsp;C.</td></tr><tr><td>マイクロプレート用尿素検知リーダー</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

大麦糊粉層は、植物におけるホルモン調節遺伝子発現の重要なモデル システムです。アリューロン細胞における遺伝子は発芽に必要なまたはアブシジン酸 (ABA) によるストレス反応に関連する遺伝子が活性化しながら初期苗開発はジベレリン (GA) によってアクティブ化されます。GA と ABA シグナル伝達のメカニズムは、酵素試金を使用して測定結果の一時的な式で粒子衝突によるアリューロン細胞にレポーター遺伝子コンストラクトを導入することで尋問することができます。改良されたプロトコルは部分的に自動化および穀物の均質化ステップと酵素試金が合理化される既存の方法よりもはるかに多くのスループットを許可します。穀物のサンプルの均質化が、自動組織ホモジナイザーを使用して行われ、GUS (β-グルクロニダーゼ) の試金は 96 ウェル プレート システムを使用して実行されます。代表的なプロトコルを使用して示唆されたホスホリパーゼ D の活性が転写因子 TaABF1 を ABA によるHVA1遺伝子発現の活性化に重要な役割を果たす可能性があります。

ここで説明する手法は、大麦アリューロン細胞に任意のテスト遺伝子コンストラクトを導入する使用ことができます。実験遺伝子の表現のレベルがあります便利な測定 (図 2)。ここで大きく説明より高いスループット プロトコルは、研削のシードと酵素試金のステップの効率を高めます。このメソッドは、ABA で誘導される遺伝子HVA17をアクティブにする転写因子 TaABF15,6の能力を評価に使用されています。ここで示した代表的な結果にHVA1::GUS記者コンス トラクターはUBI::TaABF1エフェクター構成 (図 3 a) と共にアリューロン細胞に導入されました。TaABF1をしながらちょうど 0.01 のHVA1</em...

粒子衝突の後大麦アリューロン細胞の構造において、記者から一時的な遺伝子発現の測定のため改良されたプロトコルが表示されます。96 ウェル プレート酵素試金研削自動穀物の組み合わせは、プロシージャの高スループットを提供します。

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

この手順の全体的な目標は、粒子衝撃によってレポーターコンストラクトをオオムギアリューロン細胞に導入した後、レポーターコンストラクトからの遺伝子発現を測定することです。この方法は、特定のシグナル伝達分子がどのように作用してアブシジン酸をオオムギ誘導遺伝子に調節するかなど、植物ホルモン調節遺伝子発現における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、従来の方法よりも高いスループットを提供し、多数の遺伝子コンストラクトとインキュベーション条件をテストできることです。プロトコルのデモンストレーションは、私の研究室の学生であるGraceです。まず、20ミリリットルの吸収溶液と20マイクロリットルのクロラムフェニコールが入った90ミリメートルのプラスチックシャーレの蓋に、いくつかの胚のない粒子を入れます。滅菌鉗子を使用して、各穀物から透明な種皮をそっと取り除きます。大麦の粒から種皮を剥がすことは重要なステップです。種皮が完全に除去されていない場合、金マイクロキャリアがアリューロン細胞に侵入するのを防ぎます。しかし、ピーリングが乱暴に行われると、アリューロン細胞が損傷する可能性があります。すべての穀物から種皮を剥がした後、ペトリ皿からバーミキュライトプレートに移します。次に、皮をむいた胚のない穀物を摂氏24度のインキュベーターに16〜20時間置きます。次に、爆撃実験に含まれる各処理から1ポイント5ミリリットルのチューブにラベルを付けます。各チューブに、2ポイント5マイクログラムのUBIルシフェラーゼ内部制御プラスミド、2ポイント5マイクログラムのGUSレポータープラスミド、および所望量のエフェクタープラスミドを追加します。各チューブに超純水を加えると、総容量は5マイクロリットルになります。各治療について、プラスミドDNAを含む各1ポイント5ミリリットルチューブに50%グリセロールに懸濁した50マイクロリットルのマイクロキャリアを追加します。マイクロキャリアのコーディング手順の最終ステップで、8マイクロリットルの懸濁マイクロキャリアを5つのマクロキャリアのそれぞれにピペットで固定し、風乾させます。真空ポンプをオンにし、ヘリウムバルブを開いてから、粒子送達システムをオンにして、粒子衝撃装置をセットアップします。1550 psiのラプチャーディスクを保持キャップに入れ、粒子送達システムに取り付けます。所望のプラスミドの組み合わせを含むマクロキャリアとストッピングスクリーンをマイクロキャリアローンチアセンブリに入れる。アセンブリを砲撃室の上部スロットに挿入します。次に、90ミリリットルのシャーレの蓋に平らにテープで留められた濾紙の円に、細い方の端が内側を向くように、8つの胚のない粒子をタイトな放射状に並べます。穀物の入った皿を、停止スクリーンから6センチメートルの距離にある砲撃室に置きます。ドアを閉め、真空スイッチを押して、砲撃室を95キロパスカルまで避難させます。バキュームスイッチをすばやく保持位置に回します。次に、発射スイッチを押したままにして、サンプルを砲撃します。真空を解除した後、衝撃を受けた穀物を、4ミリリットルの吸収溶液と1ミリリットルのクロラムフェニコール1ミリグラムを含むラベル付きの60ミリメートルペトリ皿に移します。すべての砲撃が完了するまで繰り返します。次に、衝撃を受けた穀物を摂氏24度で100rpmの振動台で24時間インキュベートします。鉗子を使用して、60ミリメートルのペトリ皿から8つの衝撃を受けた穀物を取り出し、ペーパータオルでそれらを拭き取ります。粒子を2つのラベル付き2ミリリットルチューブに分割し、それぞれに800マイクロリットルの粉砕バッファーと5ミリメートルのステンレス鋼ビーズが含まれています。衝撃を受けたすべての穀物について前の手順を繰り返した後、最大48本の2ミリリットルチューブをビーズホモジナイザーの2つのラックに配置します。次に、ラックをホモジナイザーに取り付け、サンプルを30ヘルツで3分間振とうします。終了したら、ホモジナイザーからラックを取り外し、氷の上に5分間置き、サンプルを再冷却します。次に、ラックをホモジナイザーに反対方向に取り付けます。サンプルを再度30ヘルツで3分間振ってください。ホモジナイザーからラックを取り出した後、氷の上に5分間置き、サンプルを再冷却します。これに続いて、穀物抽出物を摂氏4度で16, 000Gで10分間遠心分離します。遠心分離の直後に、透明な上清を2番目の微量遠心チューブのセットにデカントします。各チューブを短時間ボルテックスし、氷上に保存します。上清を移した後、ペレットからステンレス鋼ビーズを回収し、洗浄して再利用できるようにします。次に、200マイクロリットルのGUSアッセイバッファーを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。各穀物抽出物50マイクロリットルをウェルの1つに入れ、ピペットチップと混合します。次に、プレートの上部をシーリングフィルムでシールします。96ウェルプレートを37°Cの暗闇のインキュベーターに20時間置きます。インキュベーション後、96ウェルプレートを4, 000 Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。終了したら、プレートを氷の上に置きます。次に、250マイクロリットルのゼロポイント2モルの炭酸ナトリウムを、黒い96ウェルプレートの各ウェルに追加します。遠心分離した各GUSアッセイ混合物の6点25マイクロリットルをブラックプレートの各ウェルに加え、ピペットチップと混合します。100マイクロモルで10-40の6ポイント25マイクロリットル、標準として4つのmethylumbelliferoneの井戸を含んで下さい。黒いプレートをプレート蛍光光度計に入れます。40マイクロモル、4つのmethylumbelliferoneおよびゼロポイント2モルの炭酸ナトリウムの250マイクロリットルの6点255マイクロリットルを含んでいる井戸が100の蛍光単位の読み取りを与えるように、器械の利益を設定するmethylumbelliferoneの蛍光を読んで下さい。この実験では、HVA1 GUS レポーターコンストラクトを UBI TaABF1 エフェクターコンストラクトと共にアリューロン細胞に導入しました。TaABF1 HVA1比がゼロ点ゼロであるだけで、エクソジェニス・アブシス・アブシス酸またはABAが存在しない状態でHVA1レポーター遺伝子の3倍の誘導を引き起こすのに十分でした。TaABF1コンストラクトのレベルが高いほど、投与依存的にHVA1の発現が徐々に増加しました。エキソジェニスABAとTaABF1はどちらも、HVA1 GUSレポーターコンストラクトの発現を強く誘導する可能性があります。いずれの場合も、1つのブタノールの存在はHVA1誘導を強く阻害し、ホスホリパーゼDがTaABF1を介したABAによるHVA1遺伝子発現の活性化に重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています。ABAは、Amy32b GUSレポーターコンストラクトのジベレリン誘導発現を強力に阻害することが示されました。過酸化水素もニトロプルシドナトリウムも大幅な減少を引き起こしませんでした。したがって、これらの結果は、アリューロン細胞のABA応答における一酸化窒素と過酸化水素の役割を支持していません。この手法を習得すると、比較的短時間で多くの異なるサンプルの遺伝子発現を測定できるようになります。例えば、200種類の穀物サンプルの爆撃は、2人の研究者が数時間で行うことができます。その後、翌日には、1人の研究者が2時間ですべてのタンパク質抽出物を調製できます。また、96ウェルプレートで実施される改変GUSアッセイは、将来のチューブアッセイで使用される他のプロトコルよりもはるかに少ない労力で済みます。

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Research

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Genetics

遺伝学

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スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

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