スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

この手順の全体的な目標は、粒子衝撃によってレポーターコンストラクトをオオムギアリューロン細胞に導入した後、レポーターコンストラクトからの遺伝子発現を測定することです。この方法は、特定のシグナル伝達分子がどのように作用してアブシジン酸をオオムギ誘導遺伝子に調節するかなど、植物ホルモン調節遺伝子発現における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、従来の方法よりも高いスループットを提供し、多数の遺伝子コンストラクトとインキュベーション条件をテストできることです。

プロトコルのデモンストレーションは、私の研究室の学生であるGraceです。まず、20ミリリットルの吸収溶液と20マイクロリットルのクロラムフェニコールが入った90ミリメートルのプラスチックシャーレの蓋に、いくつかの胚のない粒子を入れます。滅菌鉗子を使用して、各穀物から透明な種皮をそっと取り除きます。

大麦の粒から種皮を剥がすことは重要なステップです。種皮が完全に除去されていない場合、金マイクロキャリアがアリューロン細胞に侵入するのを防ぎます。しかし、ピーリングが乱暴に行われると、アリューロン細胞が損傷する可能性があります。

すべての穀物から種皮を剥がした後、ペトリ皿からバーミキュライトプレートに移します。次に、皮をむいた胚のない穀物を摂氏24度のインキュベーターに16〜20時間置きます。次に、爆撃実験に含まれる各処理から1ポイント5ミリリットルのチューブにラベルを付けます。

各チューブに、2ポイント5マイクログラムのUBIルシフェラーゼ内部制御プラスミド、2ポイント5マイクログラムのGUSレポータープラスミド、および所望量のエフェクタープラスミドを追加します。各チューブに超純水を加えると、総容量は5マイクロリットルになります。各治療について、プラスミドDNAを含む各1ポイント5ミリリットルチューブに50%グリセロールに懸濁した50マイクロリットルのマイクロキャリアを追加します。

マイクロキャリアのコーディング手順の最終ステップで、8マイクロリットルの懸濁マイクロキャリアを5つのマクロキャリアのそれぞれにピペットで固定し、風乾させます。真空ポンプをオンにし、ヘリウムバルブを開いてから、粒子送達システムをオンにして、粒子衝撃装置をセットアップします。1550 psiのラプチャーディスクを保持キャップに入れ、粒子送達システムに取り付けます。

所望のプラスミドの組み合わせを含むマクロキャリアとストッピングスクリーンをマイクロキャリアローンチアセンブリに入れる。アセンブリを砲撃室の上部スロットに挿入します。次に、90ミリリットルのシャーレの蓋に平らにテープで留められた濾紙の円に、細い方の端が内側を向くように、8つの胚のない粒子をタイトな放射状に並べます。

穀物の入った皿を、停止スクリーンから6センチメートルの距離にある砲撃室に置きます。ドアを閉め、真空スイッチを押して、砲撃室を95キロパスカルまで避難させます。バキュームスイッチをすばやく保持位置に回します。

次に、発射スイッチを押したままにして、サンプルを砲撃します。真空を解除した後、衝撃を受けた穀物を、4ミリリットルの吸収溶液と1ミリリットルのクロラムフェニコール1ミリグラムを含むラベル付きの60ミリメートルペトリ皿に移します。すべての砲撃が完了するまで繰り返します。

次に、衝撃を受けた穀物を摂氏24度で100rpmの振動台で24時間インキュベートします。鉗子を使用して、60ミリメートルのペトリ皿から8つの衝撃を受けた穀物を取り出し、ペーパータオルでそれらを拭き取ります。粒子を2つのラベル付き2ミリリットルチューブに分割し、それぞれに800マイクロリットルの粉砕バッファーと5ミリメートルのステンレス鋼ビーズが含まれています。

衝撃を受けたすべての穀物について前の手順を繰り返した後、最大48本の2ミリリットルチューブをビーズホモジナイザーの2つのラックに配置します。次に、ラックをホモジナイザーに取り付け、サンプルを30ヘルツで3分間振とうします。終了したら、ホモジナイザーからラックを取り外し、氷の上に5分間置き、サンプルを再冷却します。

次に、ラックをホモジナイザーに反対方向に取り付けます。サンプルを再度30ヘルツで3分間振ってください。ホモジナイザーからラックを取り出した後、氷の上に5分間置き、サンプルを再冷却します。

これに続いて、穀物抽出物を摂氏4度で16, 000Gで10分間遠心分離します。遠心分離の直後に、透明な上清を2番目の微量遠心チューブのセットにデカントします。各チューブを短時間ボルテックスし、氷上に保存します。

上清を移した後、ペレットからステンレス鋼ビーズを回収し、洗浄して再利用できるようにします。次に、200マイクロリットルのGUSアッセイバッファーを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。各穀物抽出物50マイクロリットルをウェルの1つに入れ、ピペットチップと混合します。

次に、プレートの上部をシーリングフィルムでシールします。96ウェルプレートを37°Cの暗闇のインキュベーターに20時間置きます。インキュベーション後、96ウェルプレートを4, 000 Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。

終了したら、プレートを氷の上に置きます。次に、250マイクロリットルのゼロポイント2モルの炭酸ナトリウムを、黒い96ウェルプレートの各ウェルに追加します。遠心分離した各GUSアッセイ混合物の6点25マイクロリットルをブラックプレートの各ウェルに加え、ピペットチップと混合します。

100マイクロモルで10-40の6ポイント25マイクロリットル、標準として4つのmethylumbelliferoneの井戸を含んで下さい。黒いプレートをプレート蛍光光度計に入れます。40マイクロモル、4つのmethylumbelliferoneおよびゼロポイント2モルの炭酸ナトリウムの250マイクロリットルの6点255マイクロリットルを含んでいる井戸が100の蛍光単位の読み取りを与えるように、器械の利益を設定するmethylumbelliferoneの蛍光を読んで下さい。

この実験では、HVA1 GUS レポーターコンストラクトを UBI TaABF1 エフェクターコンストラクトと共にアリューロン細胞に導入しました。TaABF1 HVA1比がゼロ点ゼロであるだけで、エクソジェニス・アブシス・アブシス酸またはABAが存在しない状態でHVA1レポーター遺伝子の3倍の誘導を引き起こすのに十分でした。TaABF1コンストラクトのレベルが高いほど、投与依存的にHVA1の発現が徐々に増加しました。

エキソジェニスABAとTaABF1はどちらも、HVA1 GUSレポーターコンストラクトの発現を強く誘導する可能性があります。いずれの場合も、1つのブタノールの存在はHVA1誘導を強く阻害し、ホスホリパーゼDがTaABF1を介したABAによるHVA1遺伝子発現の活性化に重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています。ABAは、Amy32b GUSレポーターコンストラクトのジベレリン誘導発現を強力に阻害することが示されました。

過酸化水素もニトロプルシドナトリウムも大幅な減少を引き起こしませんでした。したがって、これらの結果は、アリューロン細胞のABA応答における一酸化窒素と過酸化水素の役割を支持していません。この手法を習得すると、比較的短時間で多くの異なるサンプルの遺伝子発現を測定できるようになります。

例えば、200種類の穀物サンプルの爆撃は、2人の研究者が数時間で行うことができます。その後、翌日には、1人の研究者が2時間ですべてのタンパク質抽出物を調製できます。また、96ウェルプレートで実施される改変GUSアッセイは、将来のチューブアッセイで使用される他のプロトコルよりもはるかに少ない労力で済みます。