Name: コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶ産業環境における真菌DNA抽出法。NIOSHエアロゾルサンプラーを用いた大気サンプリングとITS領域シーケンスにより、従来法では検出困難な真菌種を同定し、作業者の健康リスク評価に貢献します。

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この作品は、NIOSH と NIEHS (AES12007001-1-0-6) 間の省庁間の契約によって部分で支えられました。

1. 準備、NIOSH サンプラー
注: NIOSH サンプラーはバイオエアロゾルの 2 つのサンプリング チューブ、ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) フィルターを使用して収集する 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーです。
<ol><li>アセンブリの前に慎重にサンプラーを検査します。それを確保するためのサンプラーは破損していない、すべてのネジは、場所と、ぴったりと 2 つによって形成される縫い目の周りシーリング テープ チェックの半分はそのまま。サンプラーの o リングに傷、亀裂や涙やシリコン グリスの非常に軽いコーティングしているされていないことを確認を確認します。 注: サンプラーは、ポリスチレンやポリプロピレン スリーピース フィルター カセットで 37 mm 3 μ m PTFE フィルターを含みます。<ol>
<li>ベースの部分の格子の表面に、セルロースまたはプラスチック フィルター サポート パッド (フィルターに付属) を配置することによってフィルター カセットを組み立てる (図 1参照)。上向きコレクションの側でフィルター サポート パッドの上にフィルターを配置するのにフィルター鉗子を使用します。</li>
		<li>手動または空気圧プレスを使用してフィルター カセットをシールします。手閉鎖空気フィルター周りリークし、コレクションの効率が低下できるようになります。リング状部分 (拡張子カウル) を挿入し、しっかりと均等にそれをプッシュ ダウンするプレスを使用します。フィルターの周りに空気が漏れていないことを確認して、しっかりをフィルターに拡張カウル押し下げます。 メモ: カセットの上部の部分は中にサンプリングされていないがサンプリングが完了したら、フィルターをカバーする保存する必要があります。</li>
		<li>サンプラーの上に組み立てられたカセットに合わせて、可能な限りそれを押し込みます。フィルター カセットと場所でフィルター カセットを保持してリークを防ぐためにバックアップ シールとして機能するサンプラーの外側に 19 mm (3/4 インチ) テープの一部をラップします。</li>
		<li>リークに対して二次シールとして機能するサンプラー ボトムアウトするまでとシーリング テープ各チューブの周りラップにしっかりと完全に各チューブをネジします。 注: 最初のチューブ 15 mL ポリプロピレン チューブを収集非吸入粒子の空気力学的直径と > 4 μ m。2 番目のチューブ 1.5 mL ポリプロピレン製遠心管は、1、4 μ m 間吸入粒子を収集します。残りの小さい粒子、< 1 μ m、PTFE に収集されます (図 2参照) にフィルターを適用。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フィルターの違いとして各使用前に校正瓶 NIOSH サンプラーを介して空気の流れを調整し、サンプラーの気流を変化させる原因となります。<ol>
<li>校正の jar を使用するには、フィルター カセットの上部に jar のルアーロック継ぎ手を挿入、瓶でサンプラーを配置、瓶を密封します。</li>
		<li>校正 jar を校正流量計・ サンプリング ポンプに接続します。流量計をオンにして、数分のためのウォーム アップすること。流量計にはフィルターの流量計、サンプラーが汚れないようにその入口に接続する必要がありますに注意してください。</li>
		<li>サンプリング ポンプをオンにしてウォーム アップし、安定させるために数分の実行を許可します。</li>
		<li>3.5 L/分で正しい流量を設定するポンプを調整します。 注: NIOSH サンプラーの流量は通常 3.5 L/分に設定します。この流量でサンプラーは吸入粒子サンプリング16ACGIH/ISO 基準に準拠します。他の流量は、異なるカットオフ サイズが必要なまたは騒音レベルを減らすためにも注意しては異なる流量を使用すると場合、は、サンプラー、吸入サンプリング条件に適合は不要になった場合に使用できます。</li>
		<li>校正が完了したとき、電源を切り、ポンプに流量計。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 静的および個人的なエアロゾル サンプリング
<ol><li>いずれかの個人または静的エリア サンプリングの NIOSH エアロゾルのサンプラーを設定します。 注: 静的サンプリングは、三脚または他の固定装置に接続して、サンプラーを使用して、 (図 3参照)、サンプリング時個人対サンプラーとポンプは (図 4参照) を検討されている人にマウント。<ol>
<li>静的な領域のサンプリングで保つ特定の領域にできるだけ近いサンプラーを検討中します。吸気口、部屋の入り口や気流のパスがあるかもしれない場所からサンプラーを維持します。 注: エアロゾル濃度かなり異なります、短い距離でも元のエアロゾルが部屋17に場合は特に。</li>
		<li>個人的なサンプリングは、人の呼吸ゾーン内のサンプラーを設定します。襟、肩や胸にサンプラーを接続し、バックパック、腰にサンプリング ポンプを配置します。 注: 呼吸ゾーンですと周りの人の鼻吸入17時に空気の大部分を描画する 30 cm の半球をする一般的。</li>
	</ol>
</li>
	<li>管サンプラー サンプラー入り江も明確であり、何もが入り江を妨害したり、サンプラーに空気の流れを妨げることがであることを確認します。管サンプラのピンチまたはねじれていないする必要があります。任意の閉塞は、ポンプを停止する原因となります。</li>
	<li>ポンプをオンにします。2 分後、ポンプが実行されているかどうかはチェックしてください。 注: 行為の空気から 10 分ほどで環境10,18,19によっての完全 8 h 勤務に至るまでの期間のためのサンプリングします。図 6に示された結果は、屋内環境で 60 分サンプリング周期の代表です。</li>
	<li>空気サンプリングが完了した後は、サンプル チューブとフィルターを収集します。シーリング テープを削除、チューブを外し、それらをキャップします。フィルター カセットの 3 番目の部分は、フィルター上に置きます。処理の準備ができるまで 4 ° c のサンプルを格納します。</li>
</ol>3. 大気試料からゲノム DNA の抽出
<ol><li>NIOSH BC251 サンプラーの各段階からゲノム DNA (gDNA) を抽出します。コレクション チューブをサンプリング空気を処理し、個別にサンプルで吸入と吸入以外の微生物エアロゾルの測定を許可するフィルターします。 注: 代わりに、3 つのステージと結合できるサンプル接種が小さすぎる場合を抽出します。<ol>
<li>クラス II 生物学的安全キャビネットまたは層流クリーン ベンチ、無菌フィルターを削除します。70% のエタノールおよびテコで動かす道具サンプリング カセット カセット開口部ツールを使用してを開くを使用してサンプリング カセットを拭いてください。フィルター リフターを使用して、フィルターとサポート パッドを上向きにプッシュします。フィルター鉗子を使用してフィルターをつかみ、滅菌シャーレに配置。フィルターを 6 等分にカットし、300 mg ガラスビーズ (0.2 - 0.5 mm) を有する補強 2 mL チューブに配置します。</li>
		<li>30 液体窒素でフィルターを含むチューブ s、すぐに 30 の 4.5 m/s に設定ビーズ工場ホモジナイザの場所 s。</li>
		<li>フィルターは千切りまで手順 3.1.2 を何回か繰り返します。そのままフィルターの小さな断片が残ることがあります。0.5 mL の溶解バッファー (4 M 尿素、200 mM トリス、20 mM の NaCl、200 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、pH 7.4) を追加します。</li>
		<li>15 mL と 1.5 mL の空気サンプラー管に 0.3 mL の溶解バッファーを追加します。渦管 10 - 15 秒で直立と倒立し、別の 10-15 s。300 mg ガラス ビーズを含む強化 2 mL チューブに各チューブの内容を転送します。 注: 各サンプラー管で収集した材料のほとんどは、管の上部に蓄積されます。</li>
		<li>4.5 m/s 30 s と遠心分離機でビーズ工場ホモジナイザのすべてのチューブを処理 22 ° C で 1 分 20,000 × g で滅菌 1.5 mL 遠心チューブに上清を転送および 22 ° C で 1 分再び 20,000 x g でチューブを遠心分離この手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>溶解試薬の 30 μ L を追加 (材料表を参照) をそれぞれチューブし、37 ° C 15 分でチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>0.2 mL の結合バッファー (10 M 尿素, 6 M グアニジン塩酸、10 mM トリス-HCl、20% トリトン X-100, pH 4.4) を追加、プロテイナーゼ K (100 μ g/mL) 各チューブ、10 分追加 100 μ L 各管にイソプロパノールの 70 ° C でチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>ガラス繊維フィルター チューブ (700 μ L 容量) 2 mL 採血管の配置に抽出ソリューションを転送し、20,000 x g 30 で採血管を遠心分離機 22 ° C で sコレクション チューブを破棄し、新しい 2 mL 採血管にフィルター チューブを配置します。</li>
	<li>各管に 0.5 mL の阻害剤の除去バッファー (5 M グアニジン HCl、20 mM トリス-HCl、pH 6.6, 38% のエタノール) を追加し、コレクション チューブ 30 20,000 × g で遠心分離機 22 ° C で sコレクション チューブを破棄し、新しい 2 mL 採血管にフィルター チューブを配置します。</li>
	<li>各管に 0.5 mL の洗浄バッファー (20 mM NaCl、2 mM トリス-HCl、pH 7.5、80% エタノール) を追加し、コレクション チューブ 30 20,000 × g で遠心分離機 22 ° C で sコレクション チューブを破棄し、新しい 2 mL 採血管にフィルター チューブを配置します。このプロセスを繰り返します。</li>
	<li>任意の残留洗浄バッファーを削除する 22 ° C でさらに 1 分間 20,000 × g で採血管を遠心分離します。コレクション チューブを破棄し、新しい管にフィルター チューブを配置します。</li>
	<li>追加 100 μ L (70 ° C) 溶出バッファー (トリス-HCl、pH 8.5 10 mM) 各チューブを暖かいし、室温で 1-2 分間遠心分離機 30 20,000 × g で採血管を孵化させなさい 22 ° C で s空のフィルター チューブを滅菌 1.5 mL 遠心チューブに転送し、再ステップ 3.8 から波を適用します。1-2 分間遠心分離機 30 20,000 × g、室温でインキュベート 22 ° C で s 注: 波を使用することができますステップ 4 またはを使用する準備ができるまでの-20 ° C で保存されているためにすぐに。ゲノム DNA を保存ことができます年に-20 ° C まで長期的なストレージが必要な場合は、-80 ° C で DNA を格納することをお勧めします。</li>
</ol>4. 菌のリボソーム DNA の増幅
<ol><li>その地域 1 および 2 抽出された gDNA からを増幅するのに普遍的な真菌のプライマーを使用します。 注: このプロトコルのプライマー対 Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3')/ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') ITS 領域4、5の最高のカバレッジを提供するために使用されます。Its 1 領または ITS2 領域だけを増幅するものなどの他のプライマー セットを使用できます。<ol>
<li>ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 滅菌 0.5 mL PCR チューブや 96 ウェル PCR プレート帳票 50 μ L 反応の各サンプルを次のように設定: 5 μ L (ステップ 3) から抽出されたテンプレート DNA の PCR グレード水の 33.3 μ L、5 μ L の 10 x PCR バッファー、50 mm MgCl21.5 μ L、10 mM - デオキシヌクレオシド 2' 5'-三リン酸塩の 1 μ L、20 μ M Fun18Sf 前方プライマーの 0.5 μ L、20 μ M ITS4R 逆プライマー、0.5 μ、 Taq DNA ポリメラーゼの 0.2 μ L。</li>
		<li>サーマルサイクラーに反応を実行: 3 分; 95 ° C で変性変性の 6 サイクル (96 ° C、30 s) アニール (50 ° C、45 s) とプライマー拡張 (72 ° C、3 分);変性の 20 サイクル (96 ° C、30 s)、焼鈍 (50 ° C、45 s)、およびプライマー拡張 (72 ° C、1 分);72 ° C で 10 分間でプライマー拡張は、次のステップまで 4 ° C で反応混合物を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>帳票の PCR の反作用は浄化シリカ膜精製キットを使用して結合します。 注: この手順により、PCR コンポーネント (プライマー、dNTPs、酵素、塩、等) および増幅された DNA の準備から他の汚染物質を除去するため。<ol>
<li>滅菌 1.5 mL 容マイクロ チューブ内の各サンプル (合計 150 μ L) の 3 つの反作用を結合します。5 倍ボリューム (750 μ L) で結合バッファー (5 M グアニジン HCl、30% イソプロパノール) を追加し、上下に 10 回ピペッティングして混合します。</li>
		<li>列コレクション チューブの配置をスピンし、濾液 30 s. 破棄の 17,900 x g でチューブを遠心分離機の混合物の 450 μ L を追加します。列に残り 450 μ L を追加し、30 の 17,900 × g で遠心分離機 22 ° C で s 注: スピンの列には、列に DNA の吸着は、シリカ膜が含まれます。</li>
		<li>濾液を破棄し、750 μ L 洗浄バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 7.5、80% エタノール) をスピンの列に追加します。遠心分離機の 30 の 17,900 x g で列 22 ° C で s 注: このプロセスは、上記 PCR の反作用からの汚染物質を削除します。</li>
		<li>濾液を破棄し、遠心分離機の 22 ° C で 1 分 17,900 x g で空の列 注: この手順は、ダウン ストリーム アプリケーションを妨げるバッファーを洗浄、残留を取り除くことです。</li>
		<li>滅菌 1.5 mL 遠心チューブにスピン列を転送します。溶出バッファー (10 mM Tris Cl、pH 8.5) の 45 μ L を追加し、室温で 5 分間遠心分離機管 22 ° C で 1 分 17,900 x g でスピン列を孵化させなさい</li>
		<li>手順 4 および 5 のためすぐに溶離された DNA を使用してまたは使用の準備が整うまで-20 ° C で保存します。 注意: amplicons の格納することができます年に-20 ° C まで長期的なストレージが必要な場合は、-80 ° C で DNA を格納することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 真菌その増幅器は agarose のゲルの電気泳動の検証
<ol><li>キャスト 1% の agarose のゲル含む 1 μ G/ml エチジウム ブロマイド。トリス-酢酸-EDTA (TAE) バッファー x 1 を沸騰のアガロースを溶解します。ソリューションは、約 50 ° C に冷却は、エチジウム ブロマイドを追加し、キャスト ゲルに注ぐ。</li>
	<li>Agarose のゲルは固化後 1 のゲルを浸す x TAE とゲルにロードする産物を準備します。増幅された DNA の 8 μ L は、バッファーを読み込んで x 5 の 2 μ L を追加します。 注: これらのボリュームは、必要な読み込みバッファーの濃度に応じて調整できます。</li>
	<li>サイズの参考のため DNA の梯子とジェルの上にすべての 10 μ L のサンプルをロードします。75 V でゲルを実行 (6 V/cm) 約 90 分通常 750 間見られるバンドを視覚化して紫外線を使用して、1,000 塩基対光 (図 5参照)。</li>
</ol>6. シーケンスと真菌の ITS 領域の解析
<ol><li>抽出された gDNA または増幅真菌 ITS 領域をシーケンス処理し、最新かつ適切なメソッドを使用してシーケンスを分析します。</li>
</ol>

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<li>Vesper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Environmental+Relative+Moldiness+index+for+US+homes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Occup+Environ+Med%22%5BJournal%5D)">Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes.</a> J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).</li>
</ol>

調査結果とこのレポートの結論のこれらの者は、必ずしも疾病対策と予防のための労働安全と健康センターの国立研究所の公式の位置ではないです。

シーケンス ベースのアプローチを使用して労働環境の中で真菌多様性を決定する真菌ハザードの同定と露出の評価が上がった。このアプローチを使用して頻繁にしない文化または評価の顕微鏡ベースのメソッドを使用して検出される多くの種の追加真菌の検出のため許可しています。職業などの室内環境とその増幅とシーケンスの空気サンプルからゲノム DNA の抽出からバイオエアロゾルをサンプリング法を次に示します。これらのメソッドを使用して菌の多様性の決定は非常に依存して: 空気ゲノム DNA の抽出 (1) 成功し、完全なサンプル、プライマーのシーケンスがバンクに増幅の比較を可能にすると gDNA の増幅 (2)データベースおよび制限増幅バイアスと (3) の正しい分類同定データベース内のシーケンスのシーケンス。
成功したゲノム DNA の抽出は、抽出の方法論と研究で用いられる試薬に依存しています。プロトコルに記載されているように、バイオエアロゾル、NIOSH 2 段サイクロン サンプラーの管の段階で収集されたその他の生物・非生物粒子の多くはチューブの上部に収集します。任意の粒子を失わないためには換散バッファ...

屋内と労働環境における真菌エクスポー ジャーは、アレルギー感作喘息1などの呼吸器合併症につながります。真菌危険の識別は、リスクの評価と労働者の暴露を防止するため重要です。これらの真菌危険室内汚染、外気の侵入、または労働者が現在2区域に真菌物質の輸送が行われ環境の妨害の可能性があります。真菌の暴露を評価する方法は、実行可能な文化サンプリングだけでなく、真菌胞子の顕微鏡検査に含まれています。これらのアプローチは、いくつかの制限があるし、全体的な真菌負担3に貢献できる多くの菌種を見落とすこと。文化ベースのアプローチだけの栄養媒体で栽培することができますこれらの可能な真菌の生物を区別できます。顕微鏡を介して種レベルに真菌の胞子を識別するは、胞子のような形態の共有によって混同することができます。どちらの方法、分析し多く残り正体不明で、菌種を特定する mycologists に大きく依存します。
職業上の危険識別および暴露評価で使用される既存の方法論を改良するには、多くの研究者は分子ベースの技術になっています。屋内と労働環境の中で微生物の多様性を評価するためのシーケンス ベースのアプローチは、顕微鏡や実行可能な文化3,4 などの方法と比較して検出された菌種の広範なスペクトルを明らかにしています。 ,5。ここで紹介した方法では、労働環境の空気サンプリングと真菌の潜在的な危険を識別するためのゲノム DNA の抽出をについて説明します。有害性の特定には核リボソーム内部転写スペーサー、または、その菌の中で非常に可変、真菌種6,7を区別するために一般的に使用されている地域を配列することによって、します。 8,9。多くの種門、担子菌類に属するいくつかの種はない実行可能な文化に個人を特定できるよう、職場で見と病理組織学的に区別することは困難。これらの菌は、屋内と労働環境シーケンス真菌 ITS 領域3,4,10評価内で高い相対的な豊富に観察されています。その配列は、屋内と労働環境の内で発生した菌類の多様性に一層の知識を提供しています。
プロトコルは方法を使用して収集、抽出、およびシーケンス解析のためのバイオエアロゾルから真菌の ITS 領域を増幅する詳細を紹介します。このアプローチは、空気中の微粒子を収集するために 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーの労働安全と健康 (NIOSH) の国立研究所を利用しています。このサンプラーはバイオエアロゾルと別の吸入 (≤4 μ m 空気力学的直径) を収集するために開発された、非吸入 (> 4 μ m の空気力学的直径) 粒子は、ほとんどが屋内環境内で真菌の生物の同定は、ワーカー11によって吸入する可能性が高い。サイクロン サンプラーを含む他の空気サンプラーは吸入範囲内で粒子を収集する能力を持っている市場で利用できる (< 4 μ m)12,13をフィルターを使用しています。対照的に、NIOSH 2 段サイクロン エアロゾル サンプラーは、下流のアプリケーション14すぐに処理できる使い捨て、ポリプロピレン チューブにその空気力学的直径に基づく種の真菌を分離します。
ゲノム DNA を抽出し、真菌の ITS 領域の増幅のプロセスは、このプロトコルに記載されています。抽出の方法論の提示は、多くの市販キットのターゲット哺乳類細胞、細菌、または特に酵母15菌類および細菌からの DNA の抽出のために特別開発されています。本研究で使用されるプライマーは、真菌の 1 とその 2 地域4、5の両方の全体的な取材に基づいて選択されます。これらの領域のシーケンスことができます含め、バンクの多くの ITS 配列の比較のシーケンスその 1 地域、その 2 地域、または地域の 1 とその 2 の両方。大気試料の菌類の多様性より少なく支配的な真菌門に属する他のシーケンスと同様に、シーケンスの門は、子嚢菌門と担子菌類のかなりの数を明らかに、これらのメソッドが表示されますを使用して屋内設定で収集接合菌。このアプローチを使用して識別される真菌のシーケンスの広範な多様性は栽培や顕微鏡のような伝統的なハザード識別方法を使用するキャプチャと思います。真菌の ITS 領域の塩基配列決定は、真菌の危険を識別し、屋内と職業の真菌エクスポー ジャーのよりよい理解を可能にする拡張メソッドを提供します。

<table><tbody><tr><td>NIOSH BC251 バイオエアロゾルサイクロンサンプラー</td><td>NIOSH</td><td>BC251</td><td>NIOSHサンプラーはまだ市販されていません。NIOSHサンプラーの入手については、William Lindsley, PhD(wlindsley@cdc.gov)にお問い合わせください</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps Fisher</td><td>Scientific</td><td>02-681-373</td><td>1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; スクリュートップのねじ切りは、NIOSHサンプラーのねじ切りと一致する必要があります</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>15 mL ポリプロピレン</td>チューブ</tr><tr><td>クリーンルームビニールテープ、簡単に取り外す、1/4 "幅</td><td>McMaster-Carr</td><td>76505A1</td><td>シーリングテープ</td></tr><tr><td>フィルターカセット、クリアスチレン、37 mm</td><td>SKC Inc.</td><td>225-3LF</td><td>3ピース・サンプリング・カセット(フィルターなし)。内容物:カセットベース、延長カウル、カセットキャップ、インレット/アウトレットプラグ</td></tr><tr><td>PTFE疎水性フルオロポアメンブレンフィルター、3.0&マイクロ;m、37 mm</td><td>EMDミリポア</td><td>FSLW03700</td><td>内容:37 mm、3.0 & マイクロ;メートルPTFEフィルターとサポートパッド</td></tr><tr><td>フィッシャーブランドフィルター鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-753-50</td><td>フィルター鉗子</td></tr><tr><td>モデル502 精密パナプレス</td><td>パナバイス</td><td>502</td><td>空気圧カセットプレスは、この精密アーバープレススコ</td></tr><tr><td>ッチスーパー33 +ビニール電気テープ</td><td>マクマスターカー76455A21</td><td></td><td>19ミリメートルテープ</td></tr><tr><td>多目的キャリブレーションジャー、大型</td><td>SKCから構築されています株式 会社。</td><td>225-112</td><td>キャリブレーションジャー</td></tr><tr><td>ユニバーサル PCXR4 サンプルポンプ</td><td>SKC Inc.</td><td>224-PCXR4</td><td>サンプリングポンプ</td></tr><tr><td>質量流量計 4140</td><td>TSI Inc.</td><td>4140</td><td>流量計</td></tr><tr><td>ロシュ・ハイピュアPCRテンプレートキット</td><td>ロシュ・ダイアグノスティック</td>ス<td>11796828001</td><td>ゲノムDNA抽出に使用するキットです。内容物:溶解緩衝液、結合緩衝液、プロテイナーゼK、阻害剤除去緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、ガラス繊維フィルターチューブ、2mlコレクションチューブ</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド2mL強化ポリプロピレンスクリューキャップチューブ(キャップ付き)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15340162</td><td>ビーズ均質化用2mL強化チューブ</td></tr><tr><td>ガラスビーズ、酸洗浄、212-300 & マイクロ;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td>ガラスビーズ</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Bead Mill 24 ホモジナイザー</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td>ビーズホモジナイザー</td></tr><tr><td>CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8740</td><td>Lysis Reagent</td></tr><tr><td>Platinum Taq polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10966-018</td><td>含まれるもの: Platinum Taq ポリメラーゼ、10X PCR バッファー (MgCl2 なし)、50 mM MgCl2、KB エクステンダー</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427-088</td><td>10 mM dNTP mix</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>真菌アンプリコンの精製に使用されるキットです。含まれるもの:バッファーPB(結合バッファー)、バッファーPE(洗浄バッファー)、バッファーEB(溶出バッファー)、pHインジケーター色素(オプション)、およびGelPilotローディング色素</td></tr><tr><td>Owl EasyCast Mini Gel電気泳動システム</td><td>Thermo Fisher</td><td>B1またはB2</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>10488-085</td><td>DNAラダー</td></tr></tbody></table>

コレクションと真菌 dna の分析のための産業大気サンプルの抽出

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

従来の文化や顕微鏡ベースのアプローチなどの労働環境における真菌エクスポー ジャーを識別する多くの種の排除で起因したいくつかの制限があります。最後の 20 年間の進歩は、真菌の危険を識別するための分子ベースのアプローチに衛生研究を主導しています。これらのメソッドは、従来の方法を使用して検出されていない持っている屋内と労働環境の内で多くの種の検出にしました。空気内真菌の多様性を決定するためのアプローチのゲノム DNA の抽出、増幅、シーケンシング、および内部の真菌の分類同定を通してサンプルこのプロトコルの詳細は転写スペーサー (ITS) 領域です。そのシーケンスの結果、検出できないか、または文化または顕微鏡を使用して種レベルに特定は難しい多くの菌種の検出。これらのメソッドは、真菌の負担の定量的な対策を提供しない、彼らはハザード同定への新しいアプローチを提供し、全体の種多様性および労働環境の中で多様性を決定するため使用することができます。

環境内での種の分布は、大気試料で識別される各乙のクローンの数を決定することによって相対的な豊かさを使用して評価できます。図 6は、次の空気サンプリングの 60 分屋内環境内で分類学的に種を表すアイスランドクローナ グラフです。それは、環境にさまざまな門接合菌 (クモノスカビ microsporus) に属する種と同様、2 つの主要な菌門、子嚢菌門、担子菌類、内の種が含まれていることに観察できます。評価の伝統的な方法では子嚢菌門種偏っている多くの菌類、人為的または顕微鏡ベースのメソッドを使用して区別することはできません。真菌の ITS 領域の塩基配列決定は、具体的にいくつか菌類、しばしば突き止め、多数の菌種の検出が可能です。この環境の分析は、Polyporales の順序で置かれたそれらのほとんどと、担子菌類に属していた識別される真菌のシーケンスの 68% を示しています。
シ...

環境内で菌類の多様性を決定する、衛生学健康への危険を識別するために利用されている方法です。このプロトコルでは、真菌の ITS 領域の拡大そして配列の産業空気サンプルからの DNA 抽出について説明します。このアプローチは、伝統的な評価方法によって見落とされることができる多くの菌類の種組成を検出します。

コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

このエアサンプリングおよびDNA抽出方法の全体的な目標は、職業環境内の潜在的な真菌の危険性を特定するために、増幅、配列決定、および分類学的に配置できる真菌ゲノムDNAを取得することです。この方法は、労働者が健康に悪影響を与える可能性のある真菌の危険性など、職業暴露評価分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、培養法や顕微鏡法を使用して検出されないままの真菌種を、シーケンシングベースのアプローチを使用して解明できることです。エアを組み立てるにはampフィルターカセットは、ベースピースの格子面にセルロースフィルターサポートパッドを置き、次にフィルター鉗子の助けを借りて、収集側を上に向けてフィルターサポートパッドの上にフィルターを置きます。組み立て後、延長カウルを挿入し、手動プレスまたは空気圧プレスでしっかりと均等に押し下げてフィルターカセットをシールします。次に、組み立てたカセットをNIOSHエアロゾルサンプラーの上に取り付け、できるだけ押し下げます。19mmテープを使用してフィルターカセットの外側を包み込み、サンプラーはフィルターカセットを所定の位置に保持し、漏れを防ぐためのバックアップシールとして機能します。収集チューブをサンプラーにしっかりと完全にねじ込み、底を打ち、シーリングテープをチューブに巻き付けて、漏れに対する二次シールとして機能します。個人的なエアロゾルサンプリングを行うには、サンプラーを人の呼吸ゾーン内に配置します。を取り付けますampラーを襟、肩、または胸に取り付けてから、sampリングポンプを腰の高さまたはバックパックに入れます。ポンプの電源を入れ、1分後にポンプが機能しているかどうかを確認します。エアサンプリングが完了したら、対象物からエアサンプラーを収集します。シーリングテープをはがし、チューブを緩めてから、キャップをかぶせます。フィルターカセットの3枚目をフィルターの上に置きます。まず、サンプリングカセットを70%エタノールで拭き、次にカセット開口部ツールを使用して、クラスIIの生物学的安全キャビネットで作業しながらサンプリングカセットを開きます。次に、フィルターリフターを使用してサポートパッドを持ち上げ、フィルターを上向きにします。次に、フィルター鉗子を使用してフィルターを取り外し、滅菌済みのペトリ皿に入れます。滅菌メスでフィルターを6等分し、300ミリグラムの200〜500マイクロメートルのガラスビーズが入った2ミリリットルの強化チューブに入れます。フィルター含有チューブを液体窒素に30秒間浸した後、ビーズミルホモジナイザーに毎秒4.5メートルの速度で30秒間すばやく入れます。残りの無傷フィルターの小片が入ったチューブに0.5ミリリットルの溶解バッファーを追加し、次に15ミリリットルと1.5ミリリットルのエアサンプラーコレクションチューブに0.3ミリリットルの溶解バッファーを追加し、チューブを直立させて倒立位置にそれぞれ10〜15秒間ボルテックスします。各収集チューブから溶解バッファーを、300ミリグラムのガラスビーズを含む2ミリリットルの強化チューブに移します。ビーズミルホモジナイザーでチューブを30秒間処理し、次にサンプルを20、000倍の重力で1分間摂氏22度で遠心分離します。遠心分離後、上清を滅菌済みの1.5ミリリットル微量遠心チューブに移し、再び上清を重力20,000倍で摂氏22度で1分間遠心分離します。30マイクロリットルの溶解試薬を加えた後、チューブを摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、0.2ミリリットルの結合バッファーと1ミリリットルあたり100マイクログラムのプロテイナーゼKをチューブに加え、チューブを摂氏70度のブロックヒーターで10分間インキュベートします。最後に、各チューブに100マイクロリットルのイソプロパノールを追加します。次に、700マイクロリットルの容量を持つガラス繊維フィルターチューブを2ミリリットルのコレクションチューブに入れ、抽出溶液をその中に移します。移し替えた後、収集チューブを重力の20,000倍で摂氏22度で30秒間遠心分離します。遠心分離後、ガラスフィルターファイバーを新しい収集チューブに挿入し、収集チューブを廃棄します。各チューブに0.5ミリリットルの阻害剤除去バッファーを加え、22°Cで30秒間、重力20,000倍で遠心分離を行います。遠心分離後、収集チューブを廃棄し、フィルターチューブを新しい収集チューブに入れます。次に、各チューブに0.5ミリリットルの洗浄緩衝液を加え、再び22°Cで30秒間、重力20,000倍で遠心分離します。収集チューブを廃棄し、遠心分離後に新しいものと交換します。再度、各管に洗浄緩衝液の0.5ミリリットルを加え、摂氏22度で30秒間、重力の20,000倍で遠心分離します。残りの洗浄緩衝液を除去するには、最後に収集チューブを重力20,000倍で摂氏22度で1分間遠心分離し、収集チューブを廃棄して新しいものと交換します。100マイクロリットルの温かい溶出緩衝液を加えた後、実験室のベンチでチューブを室温で1〜2分間インキュベートし、収集チューブを重力20,000倍で摂氏22度で30秒間遠心分離します。フィルターチューブを滅菌済みの1.5ミリリットル微量遠心チューブに入れ、溶出液を再度塗布して別の円形遠心分離を行います。0.5ミリリットルのPCRチューブを使用して、50マイクロリットルの反応を5マイクロリットルのすでに抽出されたDNAと三重にセットアップし、サーモサイクラーをプログラムしてサイクルを開始します。3つのPCR反応すべてを滅菌済みの1.5ミリリットル微量遠心チューブで混合します。750マイクロリットルの結合バッファーを加え、ピペッティングで10回上下して完全に混合します。収集チューブに挿入されたスピンカラムに全混合物の450マイクロリットルを追加し、17、900倍の重力で30秒間遠心分離を開始し、次に濾液を廃棄し、残りの450マイクロリットルの混合物を2回目の遠心分離ラウンドに追加します。再度、濾液を廃棄し、750マイクロリットルの洗浄バッファーをスピンカラムに加え、17、900倍の重力で摂氏22度で30秒間遠心分離します。最後に、濾液を廃棄し、空のカラムを重力の17、900倍で摂氏22度で1分間再回転させます。スピンカラムを1.5ミリリットルの滅菌微量遠心チューブに移した後、45マイクロリットルの溶出バッファーをピペットでピペットし、ラボベンチで室温で5分間インキュベートします。次に、カラムを重力の17,900倍で摂氏22度で1分間遠心分離します。1%アガロースゲルを電気泳動チャンバー内の1倍TAEバッファーに浸し、次に2マイクロリットルの5倍ローディングバッファーと8マイクロリットルの増幅DNAを混合します。最後に、サンプルの10マイクロリットル全体をDNAラダーとともにゲルにロードします。ゲルを75ボルトで約90分間泳がせます。代表的なアガロースゲルは、職業上の空気サンプルに由来する真菌ゲノムDNAの内部転写スペーサー領域の増幅を示します。左端のレーンは DNA マーカー レーンを表します。右側のバンドは、750 から 1, 000 塩基対の範囲のサイズの異なる職業空気サンプルから増幅された内部転写されたスペーサー領域を表しています。代表的なクローナチャートは、屋内環境における多様な分類学的真菌種の存在を示しています。NIOSHバイオエアロゾルサイクロンサンプラーは、存在する真菌種を決定するために、家庭でバイオエアロゾルを1時間収集するために使用されました。表形式のデータは、屋内環境における真菌種の多様性と豊富さの指標を表しています。データは、空調された環境と蒸発冷却環境において、Chao-1リッチネス指数、シャノン多様性指数、およびブレイ・カーティス非類似係数が高いことを示しています。このビデオを見れば、屋内および業務用の空気サンプルを収集し、微生物集団の分析のためにゲノムDNAを抽出する方法について十分に理解できるはずです。この手順を試行する際には、サンプルの微生物学的汚染を防ぐために、最適な無菌方法を利用することを忘れないでください。

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