コレクションと真菌 DNA の分析のための産業大気サンプルの抽出

このエアサンプリングおよびDNA抽出方法の全体的な目標は、職業環境内の潜在的な真菌の危険性を特定するために、増幅、配列決定、および分類学的に配置できる真菌ゲノムDNAを取得することです。この方法は、労働者が健康に悪影響を与える可能性のある真菌の危険性など、職業暴露評価分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、培養法や顕微鏡法を使用して検出されないままの真菌種を、シーケンシングベースのアプローチを使用して解明できることです。

エアを組み立てるにはampフィルターカセットは、ベースピースの格子面にセルロースフィルターサポートパッドを置き、次にフィルター鉗子の助けを借りて、収集側を上に向けてフィルターサポートパッドの上にフィルターを置きます。組み立て後、延長カウルを挿入し、手動プレスまたは空気圧プレスでしっかりと均等に押し下げてフィルターカセットをシールします。次に、組み立てたカセットをNIOSHエアロゾルサンプラーの上に取り付け、できるだけ押し下げます。

19mmテープを使用してフィルターカセットの外側を包み込み、サンプラーはフィルターカセットを所定の位置に保持し、漏れを防ぐためのバックアップシールとして機能します。収集チューブをサンプラーにしっかりと完全にねじ込み、底を打ち、シーリングテープをチューブに巻き付けて、漏れに対する二次シールとして機能します。個人的なエアロゾルサンプリングを行うには、サンプラーを人の呼吸ゾーン内に配置します。

を取り付けますampラーを襟、肩、または胸に取り付けてから、sampリングポンプを腰の高さまたはバックパックに入れます。ポンプの電源を入れ、1分後にポンプが機能しているかどうかを確認します。エアサンプリングが完了したら、対象物からエアサンプラーを収集します。

シーリングテープをはがし、チューブを緩めてから、キャップをかぶせます。フィルターカセットの3枚目をフィルターの上に置きます。まず、サンプリングカセットを70%エタノールで拭き、次にカセット開口部ツールを使用して、クラスIIの生物学的安全キャビネットで作業しながらサンプリングカセットを開きます。

次に、フィルターリフターを使用してサポートパッドを持ち上げ、フィルターを上向きにします。次に、フィルター鉗子を使用してフィルターを取り外し、滅菌済みのペトリ皿に入れます。滅菌メスでフィルターを6等分し、300ミリグラムの200〜500マイクロメートルのガラスビーズが入った2ミリリットルの強化チューブに入れます。

フィルター含有チューブを液体窒素に30秒間浸した後、ビーズミルホモジナイザーに毎秒4.5メートルの速度で30秒間すばやく入れます。残りの無傷フィルターの小片が入ったチューブに0.5ミリリットルの溶解バッファーを追加し、次に15ミリリットルと1.5ミリリットルのエアサンプラーコレクションチューブに0.3ミリリットルの溶解バッファーを追加し、チューブを直立させて倒立位置にそれぞれ10〜15秒間ボルテックスします。各収集チューブから溶解バッファーを、300ミリグラムのガラスビーズを含む2ミリリットルの強化チューブに移します。

ビーズミルホモジナイザーでチューブを30秒間処理し、次にサンプルを20、000倍の重力で1分間摂氏22度で遠心分離します。遠心分離後、上清を滅菌済みの1.5ミリリットル微量遠心チューブに移し、再び上清を重力20,000倍で摂氏22度で1分間遠心分離します。30マイクロリットルの溶解試薬を加えた後、チューブを摂氏37度で15分間インキュベートします。

次に、0.2ミリリットルの結合バッファーと1ミリリットルあたり100マイクログラムのプロテイナーゼKをチューブに加え、チューブを摂氏70度のブロックヒーターで10分間インキュベートします。最後に、各チューブに100マイクロリットルのイソプロパノールを追加します。次に、700マイクロリットルの容量を持つガラス繊維フィルターチューブを2ミリリットルのコレクションチューブに入れ、抽出溶液をその中に移します。

移し替えた後、収集チューブを重力の20,000倍で摂氏22度で30秒間遠心分離します。遠心分離後、ガラスフィルターファイバーを新しい収集チューブに挿入し、収集チューブを廃棄します。各チューブに0.5ミリリットルの阻害剤除去バッファーを加え、22°Cで30秒間、重力20,000倍で遠心分離を行います。

遠心分離後、収集チューブを廃棄し、フィルターチューブを新しい収集チューブに入れます。次に、各チューブに0.5ミリリットルの洗浄緩衝液を加え、再び22°Cで30秒間、重力20,000倍で遠心分離します。収集チューブを廃棄し、遠心分離後に新しいものと交換します。

再度、各管に洗浄緩衝液の0.5ミリリットルを加え、摂氏22度で30秒間、重力の20,000倍で遠心分離します。残りの洗浄緩衝液を除去するには、最後に収集チューブを重力20,000倍で摂氏22度で1分間遠心分離し、収集チューブを廃棄して新しいものと交換します。100マイクロリットルの温かい溶出緩衝液を加えた後、実験室のベンチでチューブを室温で1〜2分間インキュベートし、収集チューブを重力20,000倍で摂氏22度で30秒間遠心分離します。

フィルターチューブを滅菌済みの1.5ミリリットル微量遠心チューブに入れ、溶出液を再度塗布して別の円形遠心分離を行います。0.5ミリリットルのPCRチューブを使用して、50マイクロリットルの反応を5マイクロリットルのすでに抽出されたDNAと三重にセットアップし、サーモサイクラーをプログラムしてサイクルを開始します。3つのPCR反応すべてを滅菌済みの1.5ミリリットル微量遠心チューブで混合します。

750マイクロリットルの結合バッファーを加え、ピペッティングで10回上下して完全に混合します。収集チューブに挿入されたスピンカラムに全混合物の450マイクロリットルを追加し、17、900倍の重力で30秒間遠心分離を開始し、次に濾液を廃棄し、残りの450マイクロリットルの混合物を2回目の遠心分離ラウンドに追加します。再度、濾液を廃棄し、750マイクロリットルの洗浄バッファーをスピンカラムに加え、17、900倍の重力で摂氏22度で30秒間遠心分離します。

最後に、濾液を廃棄し、空のカラムを重力の17、900倍で摂氏22度で1分間再回転させます。スピンカラムを1.5ミリリットルの滅菌微量遠心チューブに移した後、45マイクロリットルの溶出バッファーをピペットでピペットし、ラボベンチで室温で5分間インキュベートします。次に、カラムを重力の17,900倍で摂氏22度で1分間遠心分離します。

1%アガロースゲルを電気泳動チャンバー内の1倍TAEバッファーに浸し、次に2マイクロリットルの5倍ローディングバッファーと8マイクロリットルの増幅DNAを混合します。最後に、サンプルの10マイクロリットル全体をDNAラダーとともにゲルにロードします。ゲルを75ボルトで約90分間泳がせます。

代表的なアガロースゲルは、職業上の空気サンプルに由来する真菌ゲノムDNAの内部転写スペーサー領域の増幅を示します。左端のレーンは DNA マーカー レーンを表します。右側のバンドは、750 から 1, 000 塩基対の範囲のサイズの異なる職業空気サンプルから増幅された内部転写されたスペーサー領域を表しています。

代表的なクローナチャートは、屋内環境における多様な分類学的真菌種の存在を示しています。NIOSHバイオエアロゾルサイクロンサンプラーは、存在する真菌種を決定するために、家庭でバイオエアロゾルを1時間収集するために使用されました。表形式のデータは、屋内環境における真菌種の多様性と豊富さの指標を表しています。

データは、空調された環境と蒸発冷却環境において、Chao-1リッチネス指数、シャノン多様性指数、およびブレイ・カーティス非類似係数が高いことを示しています。このビデオを見れば、屋内および業務用の空気サンプルを収集し、微生物集団の分析のためにゲノムDNAを抽出する方法について十分に理解できるはずです。この手順を試行する際には、サンプルの微生物学的汚染を防ぐために、最適な無菌方法を利用することを忘れないでください。