Name: クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶマウス卵母細胞のクロマチン広がり調製法。減数分裂期の染色体タンパク質動態と形態を可視化し、不妊や染色体異常の原因解明に貢献する技術を習得できます。

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この作品は日の出 (R01GM11755) に P.W.J、g. h. と j. h. 訓練助成フェローシップ国立がん研究所 (NIH) (CA009110) からサポートされていた

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョンズ ・ ホプキンス大学のによって承認されています。野生型 c57bl/6 j マウスの実験を行った。
1. 収穫前期クロマチンの作製と胎児または新生児の卵巣に広がる
<ol><li>14.5-19.5 日のポストの coitum (dpc) で胚を抽出するには、頚部転位または CO2窒息 IACUC ガイドラインによると妊娠中の女性を犠牲に。 注: 生後 1-5 卵巣 1.3 のステップに進みます。図 1は、胎生期および出生後隔世で濃縮減数分裂前期段階をまとめたものです。</li>
	<li>V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。母体の子宮角を分析、胎盤から胚を分離・ リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) 37 ° C で x に予め温めておいた 1 の 3 mL を含む 35 mm のペトリ皿に胚を転送 注: 37 ° C で設定 fliptop インキュベーターは、温度を維持するために使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵巣の操作中に温度を維持するためにも使用できます。</li>
	<li>3.5 インチ手術ハサミ胚または IACUC ガイドラインに従って斬首を通して子犬を犠牲に。さらに郭清する前に予め温めておいた PBS に首のない胚または子犬を配置します。</li>
	<li>37 ° C で予め温めておいた PBS の 3 mL を含む別の 35 ミリメートルのシャーレで一度に 1 つの胚または子犬を解剖します。前肢の下と後脚と尾図 2A-Bに記載されている上直接前方半分に沿って、胚の後部の半分の腹側正中線に沿って切断することによって進みます。</li>
	<li>3.5 インチ手術用はさみを使って腹部を開きます。転置または肝臓や腸、37 ° C で予め温めておいた PBS の 3 mL を含む新しい 35 mm のペトリ皿に卵巣を公開のループを削除する細い鉗子を使用して (図 2 bにガイドを参照してください)。卵巣はすぐ下および腹腔内 (図 2 b-C) の後部壁に向かって腎臓の後ろにあります。男性と女性の生殖腺の差異化のためのガイドは、図 2 Dで提供しています。 注: 最適な条件の急速に解剖卵巣を妊娠中の女性が犠牲になる後。</li>
	<li>郭清範囲と時計メガネの場所の下の細いピンセットのペアを使用して各女性胎児から両方の卵巣を削除または複数の井戸の別の井戸に予め温めておいた PBS の含む 0.5 〜 1.0 mL をプレートし 37 ° C で維持</li>
	<li>きれいな時計ガラスまたは卵巣 comp を浸すようにして 9 ウェル プレートの小さな井戸に、0.5 mL ハイポ抽出バッファー (17 mM クエン酸ナトリウム二水和物、ショ糖 50 ミリメートル、5 ミリメートルの EDTA、0.5 mM DTT、30 mM トリス-HCl、プロテアーゼ阻害剤、pH 8.2) に卵巣の各ペアを配置します。letely。しかし、少なくとも 15 分間、30 分以上を孵化させなさい。 注意: は、新鮮なハイポ抽出バッファーを作成し、DTT 添加の 2 時間以内の使用します。</li>
	<li>疎水性障壁の PAP のペンを使って、インキュベーション中に図 3Aに示すように、きれいなガラス 25 x 75 mm2、1 mm 厚の顕微鏡スライド上 2 22 x 22 mm2の正方形を描画します。 注: スライドは、早めに準備することができます。</li>
	<li>きれいなスライドに 100 mM ショ糖の 45-50 μ L をピペットし、ドロップする卵巣の 1 つのペアを転送します。</li>
	<li>2 つの 27 G 針の鋭い端を使用して、ショ糖液に細胞を放出する卵巣を離れてをいじめます。鉗子、卵巣の大きい部分を取り外し、慎重に細胞を分散させるためにショ糖溶液をピペットします。</li>
	<li>固定液の場所 40 μ L (1% パラホルムアルデヒド (PFA)、0.2% 洗剤 (材料の表を参照)、pH 9.2) 準備されたスライドのそれぞれの正方形。200 μ l ピペット チップのスライド表面に固定液を均等に します。</li>
	<li>定着剤を含むスライドのそれぞれの正方形の上にショ糖ミックスの 20 μ L をピペットします。 注: これは卵巣スライドごとの 1 つのペアを使用してに相当します。</li>
	<li>一晩室温で湿気の多い密室でスライドを孵化させなさい。 注: 一晩インキュベートを範囲で指定できます (12-15 時間) 室温で。</li>
	<li>室ふたを開き、完全に風乾するスライドを許可します。</li>
	<li>0.4% 湿潤剤 PBS 溶液 50 mL を含む Coplin jar 内のスライドを洗う 2 min のため空気が乾燥、(材料の表を参照)、immunolabelling プロトコル (手順 6) に進んでください。 メモ: 後で使用するため-80 ° C でスライドを保存することがありますがこれは興味の蛋白質によって異なります。最適な結果を得るのためには、immunolabelling プロトコル (手順 6) にすぐを進みます。</li>
</ol>2. 中期私採卵
<ol><li>それぞれのマウスから分離したから胞状卵胞の数を最大にするには、5 IU 妊馬血清性腺刺激ホルモン (PMSG、として知られている馬絨毛性ゴナドトロピン (eCG)) の性的成熟の処女雌マウス腹腔内注入します。 注: 最適な卵の収量、マウス必要があります時代の 1 ~ 3 カ月収穫卵母細胞の数が年齢とともに減少します。PMSG を準備するには、溶解 5,000 IU の-20 ° C で 600 μ L の単回使用の因数で滅菌 PBS (5 U/0.1 mL) ストアの 100 mL ボトル</li>
	<li>44-48 時間後準備コレクション中、最小必須培地アルファ (MEMα) 培 5% ウシ胎児血清 (FBS) と 3 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA;MEMΑ/BSA/FBS)。0.2 μ m 孔フィルターを通してメディアを滅菌します。MEMα/BSA/FBS マウスごとの 1 つのガラス皿に中小 5% CO2インキュベーターで 37 ° C に暖かいの 2.5 mL をデカントします。 注: 他のコレクションや、市販 (M2 と M16) 文化メディアもよく使用されますように。 注意: 操作手順中に周囲の空気露出を最小限に抑えるために限られた期間のための時間で 1 つ 5% CO2インキュベーターから培養皿を削除することをお勧めします。</li>
	<li>頚部転位または IACUC ガイドラインによると CO2窒息を介してマウスを犠牲に。</li>
	<li>大規模な V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。マウスの頭に向かって腸鉗子を使用して、転置します。それぞれの子宮角; を検索します。卵巣は胸郭に近位現在します。微細鉗子で卵管を押し、解剖はさみ (図 4) を使用して卵巣に脂肪のスーペリアーをカットします。卵管を押しながら微細鉗子の別のセットの MEMα、BSA、FBS 媒体を含んでいるコレクションの皿に滑液包と場所から卵巣をリリースし続けます。 注: 手順 1、37 ° C で卵巣を維持し、5% CO2で維持することが不可欠です。温度と CO2のレベルの最適なメンテナンスを可能にするのには、5% CO2ミックスにフック fliptop インキュベーターを使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵母細胞の操作中に温度を維持するためにも使用ください。</li>
	<li>27 ゲージ針 (または同じようなサイズ) 1 mL 注射器を使用して手動で大きいから胞状卵胞を穿刺によって卵丘卵子複合体をリリースします。</li>
	<li>解剖顕微鏡で観察しながら手動式マイクロメータ-シリンジ (図 5) または毛管、口運営ガラス ピペットを使用して GV 段卵母細胞を収集します。のみから胞状卵胞からリリースされている卵を収集します。GV 卵子は約 90 の直径を持つ μ m GV 卵母細胞顆粒膜細胞の 2-3 層に囲まれています可能性があり、合計約 200 μ m の直径を持ちます。</li>
	<li>きれいな時計ガラスまたは中期に到達する 6 時間 MEMα/BSA/FBS 媒体を含んでいる 9 ウェル プレートの卵母細胞を培養 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で私。</li>
	<li>手順 4 に進みます。</li>
</ol>3. 中期 II (MII) 採卵
<ol><li>それぞれのマウスから分離した卵母細胞を最大にするには、5 IU PMSG の性的に成熟した処女雌マウス腹腔内注入します。44-48 時間後 5 IU ひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) の腹腔内注入します。 注: 最適な卵の収量、マウス必要があります時代の 1 ~ 3 カ月収穫卵母細胞の数が年齢とともに減少します。HCG を準備する溶解ボトル 200 mL の PBS に 10,000 U (5 U/0.1 mL)。-20 ° C で 600 μ L の単回使用の因数で保存します。</li>
	<li>12-14 時間後 2.2 の手順で上記のよう MEMα、BSA、FBS コレクション媒体を準備します。</li>
	<li>頚部転位または IACUC ガイドラインによると CO2窒息を介してマウスを犠牲に。</li>
	<li>大規模な V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。マウスの頭に向かって腸鉗子を使用して、転置します。それぞれの子宮角を見つけて、卵巣は現在の胸郭に近位。微細鉗子で卵管を押し、解剖はさみ (図 4) を使用して卵巣に脂肪のスーペリアーをカットします。卵巣と卵管を削除し、MEMα、BSA、FBS 媒体を含んでいるコレクションの皿に置きます。 注: 手順 1 と 2、37 ° C で卵巣を維持し、5% CO2で維持することが不可欠です。温度と CO2のレベルの最適なメンテナンスを可能にするのには、5% CO2ミックスにフック fliptop インキュベーターを使用できます。さらに、温度調節されたガラス ステージは卵母細胞の操作中に温度を維持するためにも使用ください。</li>
	<li>27 G で 1 mL 注射器 (または同じようなサイズ) を使用してまたは鉗子をシャープ、MII 卵子を解放する卵管膨大部の穴を引き裂きます。 注: 膨大部で卵子を傷つけないように気をつけてください。卵子が表示されます (図 4)、乳頭が腫れて、半透明表示されます。</li>
	<li>手動式マイクロメータ-シリンジ (図 5) または毛管、口運営ガラス ピペットを使用してコレクションの中新しい皿に MII 卵子卵管の膨大部を収穫します。</li>
	<li>手順 4 に進みます。</li>
</ol>4. 卵を denuding 基礎と透明帯除去
<ol><li>MEMα 中 3 mg/ml BSA の裸に周囲の卵丘細胞 (2.5 mL/マウス) 37 ° c、5% CO2時計ガラスの卵母細胞に補われるヒアルロニダーゼの 300 IU/mL を準備します。 注: ヒアルロニダーゼ効果は準備の 1 時間後に大幅減少します。MII 卵子, ヒアルロニダーゼ治療は必要ではありません。</li>
	<li>裸にする周囲の卵丘細胞卵母細胞に 3 分間 MEMα/BSA のヒアルロニダーゼ 300 IU/mL に卵子積雲細胞複合体を公開します。 注意: それは卵母細胞に損傷を与える、ヒアルロニダーゼへの 3 分露出を超えないようにします。</li>
	<li>卵母細胞を洗って、卵母細胞を新鮮な温め MEMα/BSA の中皿に転送します。小さな口運営ガラス ピペットまたは毛細血管 (約 90 μ m は、卵母細胞の直径よりもわずかに大きい) を使用して、ピペットの複合体を上下の卵丘細胞を完全に分離します。次のステップを準備している間、インキュベーターで回復する卵を許可します。</li>
	<li>酸性タイロード液、MEMα/BSA、37 ° c (500 μ L/マウス) Waymouth のメディアを温めます。小さな 9 よくガラス プレートの各ウェルに場所 300 μ L。</li>
	<li>透明帯 (ZP) を削除するには、タイロード液に 5-10 卵を転送します。ソリューションにのみ 30-45 秒の卵母細胞を公開します。 注: ソリューションにはあまりにもほとんど露出は削除されません、ZP 完全に破裂と広がってから染色体の卵子を回避します。あまりにも多くの露出は損傷し、卵母細胞を殺します。解剖顕微鏡の下で ZP ディゾルブを見て露出時間の最適化に役立ちます。 注意: は新鮮なタイロード液を使用してその機能が年齢とともに低下として重要です。ZP の制服消化できるように卵母細胞のグループごとにタイロード液の新鮮な井戸を使用します。</li>
	<li>ZP 除去後すぐに温めた MEMα/BSA/FBS 媒体に転送することによって卵子を洗います。このステップを繰り返します。 注: は、転送、卵子が一緒に固執する簡単に、ガラス ピペットまたは ZP の毛細血管除去に注意してください。前ぬれガラス ピペットまたは Waymouth の中の毛細血管と、一緒に付着卵が最小限になります。</li>
	<li>転送でき、Waymouth の中 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 30 分の回復する卵。</li>
	<li>手順 5 に進みます。</li>
</ol>5. MI と MII 卵母細胞クロマチン スプレッド
<ol><li>PAP のペンを使用すると、図 6 aに示すように、スライド ガラスに 11 x 44 mm2矩形を描きます。</li>
	<li>定着剤の薄層を使用してスライドをコート (0.2% 1% パラホルムアルデヒド H2O、pH 9.2 トリトン X 100) のスライドに固定液 100 μ L を分注して、前後のスライドを揺動します。過剰な定着剤を取り除くためにスライドをタップします。</li>
	<li>できるだけ小さなメディアとして付いている小さな口ピペット針と 5-10 卵のピックアップ、固定液にスライド上 1 cm から卵子を堆積しながら定着剤コーティング スライド間でラインに針をドラッグします。卵母細胞が寄託されていること、彼らが破裂するため解剖顕微鏡を使用してこの手順を実行します。 注: 卵母細胞は、スライドにすぐにバーストする必要があります。卵子が、高さは、クロマチンの広がりの程度の影響を堆積させた。詳細についてはさらに図 6に代表的な結果を参照してください。</li>
	<li>スライド閉じた加湿チャンバー内で一晩に従うクロマチンを許可する室温で孵化させなさい。</li>
	<li>完全に風乾し、リンスし、0.4% 湿潤剤 H2O、pH 8.0 の 50 mL を含む Coplin jar でスライドするスライドを許可します。</li>
	<li>手順 6 に進みます。</li>
</ol>6. Immunolabelling
<ol><li>表 1に示す抗体希釈バッファー (ADB) を準備します。</li>
	<li>洗浄バッファー (WB) 溶液 (10 %pbs で希釈した ADB)、50 mL を格納した 2 つの Coplin jar と 50 mL WB と 0.05% 中性洗剤溶液を含む 1 つの Coplin jar の準備 (例えば、50 mL WB に 10% 洗剤の 250 μ L を追加)。</li>
	<li>WB の 50 mL を含む 1 つの Coplin jar のセクション 1 と 10 分のこのプロトコルの 5 で準備されたスライドを洗います。 注意: 任意の時点で immunolabelling の中にドライ スライドを聞かせてはいけません。</li>
	<li>Coplin jar 含む 50 mL WB と 0.05% 中性洗剤溶液に 10 分間スライドを洗います。10 分間 WB 溶液 50 mL を含む残り Coplin jar 内のスライドを洗います。</li>
	<li>ADB で希釈した選択された一次抗体の 100 μ L で余分な液体とカバーのスライドをタップします。4 ° c 密閉湿気の多い室内で一晩インキュベートします。 注: インキュベーションは、3 に 2 を短縮できる時間 37 ° C でCoverslip やパラフィルムでスライドを覆うことによって抗体 (例えば、50 μ L) のより小さいボリュームを使用します。</li>
	<li>0.2% 湿潤剤 PBS 溶液、pH 8.0 50 mL を含む Coplin jar にスライドをすすぐ。</li>
	<li>6.5 6.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>ADB で希釈した選択した二次抗体の 100 μ L で余分な液体とカバーのスライドをタップします。スライド 2 に 1 を孵化させなさい 37 ° c 湿度の高い密室での時間。</li>
	<li>2 回の Coplin jar 0.2% 湿潤剤 PBS 溶液、pH 8.0 50 mL を含む 10 分スライドを洗います。</li>
	<li>2 回 0.2% 湿潤剤 H2O 溶液、pH 8.0 50 mL を含む Coplin jar ファイルで 5 分用のスライドを洗います。</li>
</ol>7. マウント スライド
<ol><li>手順 2 で準備、前期クロマチンのスプレッド 4', 6-diamidino-2-phenylindole を含むメディアをマウントの 100 μ L を追加 (DAPI、1.5µg/mL)。MI と MII のクロマチンのスプレッドの準備手順 5 は、DAPI を含むメディアをマウントの 50 μ L を追加 (1.5µg/mL)。そっと離れて余分な液体をしみ。</li>
	<li>上 22 mm × 60 mm coverslip を置き、クリアのマニキュアをシールします。蛍光顕微鏡による評価まで 4 ° C または-20 ° C のスライド ボックスに格納します。 注: カバー スリップに軽くマニキュアでシーリングする前に余分なマウント中の解消をするをタップします。</li>
</ol>

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クロマチン普及準備は、年代順に女性哺乳類減数分裂とタンパク質の動的局在の研究に研究を許可します。胎児・新生児のクロマチン スプレッド行事が減数分裂前期の綿密な分析を可能にします。中期私と中期 II クロマチン スプレッドを使用と単一の妹を区別できますから染色分け体一対姉妹と一対の相同染色体倍数性の評価と同様。比較では、ここで説明したプロトコルできる有利な頻繁クロマチン結合タンパク質の分解能を減少させるバック グラウンド信号の高レベルを生成する全体卵母細胞 immunolabelling と比較しています。さらに、クロマチン拡散技術は、時間と専門的な機器の大規模な投資を必要とする生細胞イメージングに魅力的な代替手段を表しています。
胎児・新生児の卵巣を検索し、抽出することは困難にすることができます。他のすべての臓器と卵巣を検索し、(図 2 b) 胚/子犬の PBS の新鮮な料理を使用する前に PBS を含む別の皿に腎臓以外にも材料を慎重に抽出をお勧めします。胚/子犬が男性の精巣は細管形成と生殖腺 (<strong class...

精子、中に思春期と成人1発症時精巣生殖細胞の減数分裂の大波は準同期を急速に継続的に補充されます。男性とは対照的女性で減数分裂が胎児の発育中にのみ開始されます。誕生、次卵母細胞のまま前期の長期 dictyate 段階で逮捕された私は、そのまま卵核胞 (GV; 核膜) 思春期まで。思春期の発症時は、卵母細胞のサブセット周期的成長と成熟、減数分裂再開の開始をマークを受けることが選択されます。完全育てられた卵母細胞の減数分裂再開は胚胞崩壊 (GVBD) として知られているプロセスの GV の消失によって明示されます。卵母細胞は、染色体凝縮と極体押出続く分離を経る。卵母細胞は MII への進行時に逮捕になるし、が受精後にのみ 2 番目と最終的な減数分裂を完了する刺激されます。
雌の受胎は減数分裂前期の成功に大きく依存私進行。このための鍵は、物理的なリンケージを介したクロス オーバー組換え2を介して誘導の DNA 二重鎖切断 (Dsb) の修理 chiasmata として知られている相同染色体間の形成です。このプロセスは、そのシナプス3を容易にする相同染色体の間を形成する減数分裂 (SC) として知られている動的タンパク質豊富な足場のコンテキスト内で発生します。SC はジッパーのような三者構造中部の蛋白質によって接続されている 2 つの平行横要素から成る継続的な DNA 修理を通して一緒に同族体を保持しています。シナプス前、軸の要素と呼ばれる外側の要素の前駆体姉妹染色分け体を形成します。SYCP2 など SYCP3 減数分裂タンパク質は、初期前期中には姉妹染色分け体結束軸 colocalize 軸の要素を形成します。これらの後結合横フィラメント蛋白質、SYCP1 は、容易にアセンブリ中心的な要素と一直線に並べられた同族体4の間のシナプス部位として機能します。マウス卵母細胞の完全なシナプスによって示されます 20 の存在完全に準備を広げる重複 SYCP3 と SYCP1 のストレッチ、クロマチンを使用して視覚化することができます。シナプスが完了するという同族体間フォーム chiasmata を宛先とする成熟したクロス オーバーが飾られて mutL 相同物 (MLH1/3) ダイマーの正確な処理5,6を促進するために pachytene サブステージに入る時に,7. コヒーシン、コンデンシン、複雑な SMC5/6 など染色体 (SMC) 錯体の構造のメンテナンスが減数分裂8,9、全体構造と染色体ダイナミクスの制御のために重要 10、11,12。総称して、これらのイベントは紡錘体極次の SC の解体に反対する相同染色体の適切な双方向を確保します。
減数分裂の細胞周期は、ゲノム維持プログラム誘導と発癌の後続の修理のための様々 な蛋白質の役割について検討する強力なモデルです。さらに、哺乳類の減数分裂も、エピジェネティック修飾と刷り込み13の研究に関連するモデルです。ただし、女性減数分裂 (図 1) の哺乳類の胎児・新生児の卵巣で行われるこれらのイベントを評価するために技術的に困難です。前期 5 サブステージを分かれますことができます: leptonema、zygonema、pachynema、diplonema、dictyate。ここで、分離および胎児・新生児の卵巣と精巣 (図 2) を区別する方法をについて説明します。上記の方法から適応、この原稿も女性減数分裂前期の準備のためのビデオのデモとプロトコル (手順 1) の概要私クロマチン広がる14,15,16,17.このプロトコルにより前期の詳細なミクロ分析、immunolabelling、6-7 の手順で説明したようとつながれたとき私卵母細胞でのイベント。
卵はエラーを起こしやすいと第一減数分裂時に染色体紡錘イベントを表す子孫18,19の遺伝病の最も一般的なソース。本稿では (プロトコル手順 2)、GV 段の成熟した卵子を成熟雌マウスの発動を促された卵巣から抽出しプロトコルについて述べる.支持条件の下では、完全育てられた卵母細胞は黄体形成ホルモンに依存しない次の分離と培養20減数分裂の再開を受けます。減数分裂の再開後卵母細胞は減数分裂を経て進行し、中期 II で逮捕。卵母細胞は限り受精.中期 II で逮捕されました。手順 2-5、以前に報告されたプロトコルの収集、文化およびクロマチンを広める準備21MI と MII 卵子を準備する方法を説明するビデオ デモを適応させます。技術を広めるこのクロマチン染色体に関連付けられている蛋白質の明確な immunolabelling が可能です。さらに、このプロトコルし一価、二価染色体を区別するためにも使用できます、さらに単一の妹を解決できる卵母細胞の倍数性の評価を容易にする染色分け体。したがって、減数分裂タンパク質の局在パターンを明らかに加えこのプロトコルも MI と MII の間に染色体紡錘の潜在的な原因を解明するための非常に貴重なツールとして使用できます。

<table><tbody><tr><td>10Xリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)pH 7.4</td>品質<td>生物学的</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mmシャーレ</td><td>デンビル</td><td>T1106</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 12mmシャーレ</td><td>デンビル</td><td>T1103</td><td></td></tr><tr><td>ファイン鉗子</td><td>VWR</td><td>300-050</td><td></td></tr>マイクロ<tr><td>解剖はさみ</td><td>テッドペラ</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>解剖&nbsp;はさみ、鋭い先端、41/2 "</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr>時計<tr><td>ガラス正方形1 5/8</td><td>カロライナバイオロジカルサプライ</td><td>カンパニー742300</td>オート<td>クレーブ各使用前に</td></tr>ショ<tr><td>糖</td><td>シグマ</td><td>S8501</td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸三ナトリウム二水和物</td><td>シグマ</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>トリズマベース</td><td>シグマ</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ジチオスレイトール(DTT)</td><td>シグマ</td><td>646563</td><td>使用直前に低張緩衝液に加え</td></tr>る <tr><td>50倍プロテアーゼ阻害剤</td><td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td></td></tr>針<tr><td>付きターベルクリンシリンジ(1cc、27G x 1/2インチ)</td><td>ベクトン、ディキンソン(BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>金シール超霜ガラススライド(25X75mm、厚さ1mm)</td><td>サーモ</td><td>3063-002</td><td></td></tr><tr><td>スーパーPAPペン、大型(液体ブロッカー)</td><td>電子顕微鏡科学(EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>16%パラホルムアルデヒド水性</td><td>電子顕微鏡科学(EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>原稿中の洗剤</td></tr><tr><td>免疫染色水分チャンバー</td><td>エバーグリーン</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Coplinジャー</td><td>フィッシャー</td><td>08-815</td><td></td></tr><tr><td>Photo-flo 200</td><td>電子顕微鏡科学 (EMS)</td><td>74257</td><td>原稿の湿潤剤</td></tr><tr><td>妊娠中の牝馬血清ゴナドトロピン (PMSG)</td> <td>シグマ</td><td>G4877</td><td>-20C</td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン (HCG)</td> <td>シグマ</td><td>C0434</td><td>-20C でアリコートを保管</td></tr><tr><td>9 つの凹型空洞を持つ PYREX スポットプレート</td> フィ<td>ッシャー</td><td>13-748B</td><td>オートクレーブ 毎回使用前に</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>フィッシャー</td><td>22260943</td><td>卵子採取針を作るため</td></tr><tr><td>ブランド パラフィルム M</td><td>シグマ</td><td>BR701501</td><td>卵母細胞採取針を作るため</td></tr><tr><td>ラテックスゴムチューブ(内径3.2mm×外径6.4mm)</td><td>フィッシャー</td><td>14-178-5B</td><td>卵子採取針</td></tr><tr><td>を作るためラテックスゴムチューブ(内径6.4mm×外径11.1mm)</td><td>フィ</td><td>ッシャー14-178-5D</td><td>卵子採取針を作るため</td></tr><tr><td>柔軟なシリコーンゴムノーズピース、硬質プラスチックマウスピース、15インチのラテックスチューブ</td><td>シグマ</td><td>A5177-5EA</td><td>卵子採取針を作るため</td></tr><tr><td>ミツトヨマイクロメーターヘッド</td><td>ミツオヨ</td><td>150-208</td><td>卵子採取針を作るため</td></tr><tr><td>シリンジ5mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td>卵子採取針作成用</td></tr><tr><td>シリンジフィルター 0.45 &mu;mフィルター</td><td>コーニング</td><td>431220</td><td>卵子採取針を作るため</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット 5 3/4インチ</td> <td>フィッシャー</td><td>13-678-6A</td><td>卵子採取針を作るため</td></tr><tr><td>83 x 0.5 mm ピペットチップ</td><td>デンビル</td><td>P3080</td><td>卵子採取針を作るため</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11415049</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth's media</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>11220035</tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>フィッシャー</td><td>A3160602</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Σ</td><td>A3311</td><td>卵子培養培地用</td></tr><tr><td>500ml フィルターユニット 0.22um</td><td>デンビル</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>ΣH3506</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チロードs ソリューション</td><td>シグマ</td><td>T1788</td><td>-20C でアリコートを保管</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>シグマ</td><td>H-1270</td><td>ADB/洗浄バッファー用</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン (BSA)</td><td>シグマ</td><td>A1470</td><td>ADB/洗浄バッファー用</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 退色防止封入剤 DAPI</td><td>付き ベクターラボ</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバースライド (22mmx60mm)</td><td>フィッシャー</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>クリアマニキュア</td><td>アマゾン</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>名</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Microscopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-MLH1</td><td>Life Technologies</td><td>MA5-15431</td><td>希釈係数- 1:100</td></tr><tr><td>ウサギ抗SYCP1</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ PA1-16763</td><td>希釈係数 - 1:1000</td></tr><tr><td>ヤギ抗SCP3</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-20845</td><td>希釈係数 - 1:50</td></tr><tr><td>ヒト抗セントロメアタンパク質</td><td>抗体 組み込まれた</td><td>15-235</td><td>希釈係数 - 1:100</td></tr><tr><td>ウサギ抗TOPOII</td><td>アブカム</td><td>ab109524</td><td>希釈係数 - 1:100</td></tr><tr><td>マウス抗ヒストンH4 (ジメチルK20、トリメチルK20)</td><td>Abcam</td><td>ab78517</td><td>希釈係数 - 1:500</td></tr><tr><td>ウサギ 抗 Rec8</td><td>Courtesy of Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>希釈係数 - 1:10,000</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギIgG(H + L)アレクサフルーア568コンジュゲート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11057</td><td>希釈係数-1:500</td></tr><tr><td>ロバ抗マウスIgG(H + L)アレクサフルーア488コンジュゲート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21202</td>希釈<td>係数-1:500</td></tr>ロ<tr><td>バ抗ウサギIgG(H + L)アレクサフロー647コンジュゲート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-31573</td>希釈<td>係数-1:500</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H + L)Alexa Fluor 568コンジュゲート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11004</td>希釈<td>係数-1:500</td></tr><tr><td>ヤギ抗ヒトIgG(H + L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11013</td>希釈<td>係数-1:500</td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗ウサギIgG(H + L)アレクサフロー568コンジュゲート</td>サーモ<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11011</td>希釈<td>係数-1:500</td></tr></tbody></table>

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 ii の分析のための準備

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

クロマチン拡散技術は、配偶子、精子形成に特に様々 なタンパク質の動的局在を評価するために広く使用されています。これらのテクニックのシナプスと DNA 修復減数分裂において相同染色体対など中タンパク質と DNA の局在パターンの可視化を可能にします。いくつかのプロトコルは、文献に記載されている、哺乳類前期卵子を使用して一般的なクロマチン拡散技術が限られており、胎児の卵巣で減数分裂の開始のタイミングが難しい。比較では、前期の精母細胞はマイクロダイ セクションを必要とせずに高い利回りと少年の雄マウスから収集できます。しかし、少年と成人の精巣における減数分裂と後減数分裂生殖細胞集団の不均一性による特定の段階のセルの純粋な同期された人口を得ることが困難です。減数分裂の後の段階、卵母細胞成熟卵母細胞のグループは成熟雌マウスから収集および文化で減数分裂を再開する刺激できるので (mi) または減数分裂 II (MII) 減数分裂を受けてを評価すると便利です。ここでは、卵母細胞減数分裂クロマチンを広める準備法、胎児から新生児に解剖し、大人卵巣は、ビデオのデモを伴う説明。哺乳類卵母細胞の染色体紡錘イベントは、MI の間に特に頻繁に。行い卵形成の段階でさまざまな異なる突然変異や環境の露出の効果を特徴付けるこれらのテクニックを使用できます。内に記述された技術が減数分裂期哺乳類の卵形成過程の理解と染色体・ タンパク質ダイナミクスの性的に二形の機能を向上させる貴重なは配偶子形成の間の明確な相違点があると.

可視化し、卵母細胞の減数分裂期染色体を評価する 2 つの方法を説明しました。最初のテクニックは、胎生期および新生児の卵巣に前期の進行を評価への仕出し料理します。前期クロマチン普及準備、減数分裂、染色体、シナプスのペアリングを含む多数の動的プロセスを可視化するため非常に貴重な desynapsis、相同組換えと染色体のエピジェネティックな改造します。ここでは、このメソッド堅牢な可視化のためのユーティリティと c57bl/6 j 胚から採取した卵母細胞におけるクロス オーバー形成の定量的解析を行った (図 3 b と3 C)。Pachytene サブステージ内のセルの豊かにするには、マウス胚は 18.5 dpc (図 1) で取得されました。2 つの主要な認刻極印前期の pachytene サブステージの私は、同族体と相同物ペアあたり少なくとも 1 つ MLH1/3-肯定的なクロス オーバー...

哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II 上演します。クロマチン結合蛋白質と哺乳類の卵形成過程で染色体の形態の研究を可能にするこれらの基本的なテクニック。

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

このクロマチンスプレッド調製の全体的な目標は、哺乳類の卵形成全体を通じて、クロマチン結合タンパク質の動的局在パターンと卵子の染色体形態を時系列で視覚化することです。この方法は、相同染色体対形成、シナプス、DNA修復、減数分裂染色体分配など、女性生殖生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、染色体に関連するタンパク質の明確な免疫標識と可視化、および卵子の倍数性の評価を可能にすることです。卵形成はエラーが発生しやすく、染色体のミスグレッションはしばしば遺伝性疾患を引き起こします。この方法は、異数性や不妊症の母性の原因についての理解を深めるために使用できます。性交後14〜19日の雌マウスを安楽死させた後、腹骨盤腔内にV字型の開口部を作ります。次に、母体の子宮角を取り除きます。次に、胎盤から胚を分離し、斬首によって胚を犠牲にします。次に、摂氏37度で3ミリリットルのPBSを含む35ミリメートルのペトリ皿に移します。次に、1匹の子犬を温かいPBSが入った別の皿に移します。胎児を安楽死させた後、後半分の腹側正中線に沿って、前肢の下半分に沿って、後肢と尾の真上に切り込みを入れます。次に、3.5インチのハサミを使用して胚の腹部を開きます。先端の細い鉗子を使用して、肝臓と腸のループを変位または除去し、生殖腺を露出させます。次に、生殖腺が男性の生殖腺か女性の生殖腺かを判断します。卵巣は腎臓のすぐ下と後ろ、腹腔の後壁に向かって位置しています。先端の細い鉗子を使用して両方の卵巣を摘出し、摂氏37度に維持されるPBSを含む小さな容器に移します。すべての胎児から卵巣を採取するために迅速に進行します。次に、新しい小さな容器に、卵巣の各別々のセットを半ミリリットルの新しく作られた低抽出緩衝液に完全に浸します。摂氏25度で少なくとも15分間、ただし30分以内にインキュベートします。インキュベーション中に、疎水性バリアPAPペンを使用して、きれいなスライドガラス上に22 x 22ミリメートルの正方形を2つ描きます。卵巣のセットごとに1枚のスライドを準備します。インキュベーションが完了したら、きれいなスライドに50マイクロリットルの100ミリモルスクロースを滴下し、1対の卵巣を滴に移します。次に、2つの27ゲージの針を使用して卵巣をからかい、その中の細胞を放出します。鉗子を使用して、卵巣の大きな部分を取り除き、廃棄します。次に、スクロース溶液を慎重にピペットで分注して、放出された細胞を分散させます。次に、スライドに各正方形に40マイクロリットルの1%PFAと0.2%Triton X-100をロードします。ピペットチップを使用するか、スライドを前後に揺らして、溶液を正方形の周りに広げます。次に、細胞を含むショ糖溶液の各プールについて、20マイクロリットルの懸濁細胞を2つの固定水溜めにロードして、各スライドが1セットの卵巣からの細胞を持つようにします。MIまたはMII卵子コレクションのいずれかの場合、最初にドナーマウスを準備して安楽死させます。次に、腹骨盤腔に大きなV字型の開口部を作り、鉗子を使用して腸を変位させ、各子宮角を見つけます。胸郭の近位にある卵巣を見つけます。細い鉗子で卵管を押さえ、解剖ハサミで卵巣より上の脂肪を切開します。卵管を保持したまま、細い鉗子を使用して卵巣を滑液包から解放し、卵巣を摂氏37度に維持された培地を含む収集皿に移します。GV期の卵子を採取するには、27ゲージの針が付いた1ミリリットルの注射器を使用して、大きな胞状卵胞に手動で穴を開けることにより、卵丘-卵母細胞複合体を放出します。MII期の卵子を採取するには、単に穿刺するのではなく、卵管の膨大部に穴を開けて卵子を放出します。次に、口操作式のガラスピペットまたはキャピラリーを使用して卵子を採取するか、手動式マイクロメータシリンジを使用します。卵母細胞の中には、卵丘細胞に囲まれているものもあれば、そうでないものもあります。MI卵子については、MEM-α/BSA中の新鮮なヒアルロニダーゼを調製し、周囲の卵丘細胞の卵子を脱核する。卵子の各コレクションについて、調製したヒアルロニダーゼ2.5ミリリットルをインキュベーターで3分間処理します。次に、MI卵子を新しくできた温かいMEM-alpha / BSA培地に移します。そこで、口で操作するガラスピペットを使用して、卵丘細胞を完全に剥離するために必要なせん断力を提供します。一般に、この手順を成功させるには、口で操作するガラスピペットまたはキャピラリーを使用した卵子の収集と操作を習得する必要があります。卵子がインキュベーターで回復するのを待ちます。その間、加熱された9ウェルガラスプレートに、300マイクロリットルの温かいタイロード溶液をロードします。2つのウェルに300マイクロリットルの温かいMEM-alpha / BSAをロードし、1つのウェルに300マイクロリットルの温かいWaymouthの培地をロードします。透明帯を除去するには、5〜10個のMIまたはMII期の卵子をTyrode溶液の浴に移し、解剖顕微鏡で観察しながらわずか30〜45秒間行います。透明帯が目に見えて溶解したら、すぐにMEM-alpha / BSA培地で予め湿らせたピペットを使用して卵子を培地に移します。次に、卵母細胞を温めた培地の2回目の浴に移します。2回目の入浴後、卵子を温かいWaymouthの培地に移し、インキュベーターで30分間回復させます。クロマチンスプレッドの準備をするには、PAPペンを使用して、スライドガラス上に11 x 44ミリメートルの長方形を描きます。次に、スライドを1%PFAの薄層で0.2%Triton X-100を水中にコーティングし、スライドを前後に揺さぶって溶液を広げます。次に、スライドをタップして余分な部分を削除します。次に、最小限の培地で5〜10個の卵子をサイフォンします。次に、ピペットチップを固定液に通すと同時に、卵子を約1cm上からスライドに落とすことにより、卵子を準備したスライドに移します。卵子はすぐに破裂し、スライド上にクロマチンが広がります。次に、スライドを密閉した加湿チャンバーで室温でインキュベートします。クロマチンがスライドに付着するように一晩落ち着かせます。記載された胚性クロマチンコレクションを用いて、C57 black/6J胚から採取した卵子におけるクロスオーバー形成を定量的に解析しました。前期クロマチンスプレッド調製物は、SYCP3、SYCP1、およびMLH1を検出するために免疫標識され、DAPIで染色されました。パキテン期の染色体は、27のMLH1病巣が20の完全に組み立てられたSC構造に沿って分布していました。スプレッド調製物が最適でなく、個々の染色体が区別できない場合、調製物は評価に含まれませんでした。良好な調製では、SMC6はセントロメア周囲ヘテロクロマチン領域および染色体アームに沿って濃縮され、MLH1病巣はパキテン段階でSCに沿って分布していました。15の良好な野生型調製物からのMLH1陽性クロスオーバーの数は約24であった。卵子採取法は、減数分裂再開後の卵子のクロマチン形態を評価するために使用されました。タンパク質の局在化と倍数性は容易に評価でき、染色体分配エラーの潜在的な原因が明らかになりました。トポイソメラーゼII-αは、染色体アームとセントロメア周囲ヘテロクロマチンに沿って見られました。MII卵子では、ペアになった姉妹染色分体は染色体とセントロメアの形態によって区別できます。一度習得すると、培養なしまたは培養後にこれらの技術を習得すると、マウス1匹あたり1〜2時間以内に完了できます。この手順に続いて、全細胞卵子免疫標識や生細胞イメージングなどの他の補完的な方法を実行して、細胞のコンテキスト内の相同染色体と姉妹染色分体を評価することができます。まとめると、ここで説明したクロマチン拡散法は、哺乳類の卵形成と、減数分裂中の染色体およびタンパク質動態の性的に二形の特徴を評価するために簡単に適用できます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

卵母細胞が減数分裂成熟中に染色体の分離の誤差による異数性になりやすいです。異数体卵は不妊、流産やダウン症などの発達障害を引き起こす可能性があります。ここでは、卵母細胞と減数分裂成熟を研究し、倍数性を評価する方法に選択の材料を導入する方法を説明します。...

マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

ここでは、核小体の組織に基づいて、マウス胞状卵母細胞の特徴付けのためのプロトコルを提示します。...

核小体クロマチン組織に基づいてマウス洞卵母細胞の単離とキャラクタリゼーション

成熟したショウジョウバエ卵子の収集、調製、イメージングのためのプロトコールを提示します。これらの方法により、減数分裂中の染色体の挙動と紡錘体の組み立てと機能の視覚化が可能になります。...

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

この原稿は、形態学的および生化学的に馬の卵母細胞を特徴付けるための実験的アプローチを記載している。具体的には、超音波誘導卵子ピックアップ（OPU）による未成熟および成熟ウマの卵母細胞の採取方法および染色体分離、紡錘体形態、全球ヒストンアセチル化およびmRNA発現を調べる方法を具体的に説明する。...

馬の卵母細胞における染色体分離、ヒストンアセチル化およびスピンドル形態の解析

減数分裂は、DNA 複製の単一の円形および染色体の 2...

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。...

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。...

マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

このプロトコルはマウス卵母細胞系の核形そして内部膜のない細胞小器官に対する細胞骨格の物理的な影響を文書化するために実験フレームワークを提供する。このフレームワークは、他の細胞タイプやコンテキストでの使用にも適合させることができます。...

マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

シナプスと組換えの減数分裂エラーは、哺乳類の卵母細胞に共通しています。これらのプロセスに関与するタンパク質の厳密な分析は、卵子形成がどのように、そしてなぜしばしばうまくいかないのかを理解するために不可欠です。ここで紹介する技術により、組換えとシナプスを包括的にモニタリングし、マウスの卵子の質を評価することができます。...

シナプシスおよび組換えの評価のためのマウス卵母細胞からの減数分裂染色体スプレッドの調製

クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々...

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

学ぶマウス卵母細胞のクロマチン広がり調製法。減数分裂期の染色体タンパク質動態と形態を可視化し、不妊や染色体異常の原因解明に貢献する技術を習得できます。

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

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