クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備
2018年2月26日
哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II 上演します。クロマチン結合蛋白質と哺乳類の卵形成過程で染色体の形態の研究を可能にするこれらの基本的なテクニック。
このクロマチンスプレッド調製の全体的な目標は、哺乳類の卵形成全体を通じて、クロマチン結合タンパク質の動的局在パターンと卵子の染色体形態を時系列で視覚化することです。この方法は、相同染色体対形成、シナプス、DNA修復、減数分裂染色体分配など、女性生殖生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、染色体に関連するタンパク質の明確な免疫標識と可視化、および卵子の倍数性の評価を可能にすることです。
卵形成はエラーが発生しやすく、染色体のミスグレッションはしばしば遺伝性疾患を引き起こします。この方法は、異数性や不妊症の母性の原因についての理解を深めるために使用できます。性交後14〜19日の雌マウスを安楽死させた後、腹骨盤腔内にV字型の開口部を作ります。
次に、母体の子宮角を取り除きます。次に、胎盤から胚を分離し、斬首によって胚を犠牲にします。次に、摂氏37度で3ミリリットルのPBSを含む35ミリメートルのペトリ皿に移します。
次に、1匹の子犬を温かいPBSが入った別の皿に移します。胎児を安楽死させた後、後半分の腹側正中線に沿って、前肢の下半分に沿って、後肢と尾の真上に切り込みを入れます。次に、3.5インチのハサミを使用して胚の腹部を開きます。
先端の細い鉗子を使用して、肝臓と腸のループを変位または除去し、生殖腺を露出させます。次に、生殖腺が男性の生殖腺か女性の生殖腺かを判断します。卵巣は腎臓のすぐ下と後ろ、腹腔の後壁に向かって位置しています。
先端の細い鉗子を使用して両方の卵巣を摘出し、摂氏37度に維持されるPBSを含む小さな容器に移します。すべての胎児から卵巣を採取するために迅速に進行します。次に、新しい小さな容器に、卵巣の各別々のセットを半ミリリットルの新しく作られた低抽出緩衝液に完全に浸します。
摂氏25度で少なくとも15分間、ただし30分以内にインキュベートします。インキュベーション中に、疎水性バリアPAPペンを使用して、きれいなスライドガラス上に22 x 22ミリメートルの正方形を2つ描きます。卵巣のセットごとに1枚のスライドを準備します。
インキュベーションが完了したら、きれいなスライドに50マイクロリットルの100ミリモルスクロースを滴下し、1対の卵巣を滴に移します。次に、2つの27ゲージの針を使用して卵巣をからかい、その中の細胞を放出します。鉗子を使用して、卵巣の大きな部分を取り除き、廃棄します。
次に、スクロース溶液を慎重にピペットで分注して、放出された細胞を分散させます。次に、スライドに各正方形に40マイクロリットルの1%PFAと0.2%Triton X-100をロードします。ピペットチップを使用するか、スライドを前後に揺らして、溶液を正方形の周りに広げます。
次に、細胞を含むショ糖溶液の各プールについて、20マイクロリットルの懸濁細胞を2つの固定水溜めにロードして、各スライドが1セットの卵巣からの細胞を持つようにします。MIまたはMII卵子コレクションのいずれかの場合、最初にドナーマウスを準備して安楽死させます。次に、腹骨盤腔に大きなV字型の開口部を作り、鉗子を使用して腸を変位させ、各子宮角を見つけます。
胸郭の近位にある卵巣を見つけます。細い鉗子で卵管を押さえ、解剖ハサミで卵巣より上の脂肪を切開します。卵管を保持したまま、細い鉗子を使用して卵巣を滑液包から解放し、卵巣を摂氏37度に維持された培地を含む収集皿に移します。
GV期の卵子を採取するには、27ゲージの針が付いた1ミリリットルの注射器を使用して、大きな胞状卵胞に手動で穴を開けることにより、卵丘-卵母細胞複合体を放出します。MII期の卵子を採取するには、単に穿刺するのではなく、卵管の膨大部に穴を開けて卵子を放出します。次に、口操作式のガラスピペットまたはキャピラリーを使用して卵子を採取するか、手動式マイクロメータシリンジを使用します。
卵母細胞の中には、卵丘細胞に囲まれているものもあれば、そうでないものもあります。MI卵子については、MEM-α/BSA中の新鮮なヒアルロニダーゼを調製し、周囲の卵丘細胞の卵子を脱核する。卵子の各コレクションについて、調製したヒアルロニダーゼ2.5ミリリットルをインキュベーターで3分間処理します。
次に、MI卵子を新しくできた温かいMEM-alpha / BSA培地に移します。そこで、口で操作するガラスピペットを使用して、卵丘細胞を完全に剥離するために必要なせん断力を提供します。一般に、この手順を成功させるには、口で操作するガラスピペットまたはキャピラリーを使用した卵子の収集と操作を習得する必要があります。
卵子がインキュベーターで回復するのを待ちます。その間、加熱された9ウェルガラスプレートに、300マイクロリットルの温かいタイロード溶液をロードします。2つのウェルに300マイクロリットルの温かいMEM-alpha / BSAをロードし、1つのウェルに300マイクロリットルの温かいWaymouthの培地をロードします。
透明帯を除去するには、5〜10個のMIまたはMII期の卵子をTyrode溶液の浴に移し、解剖顕微鏡で観察しながらわずか30〜45秒間行います。透明帯が目に見えて溶解したら、すぐにMEM-alpha / BSA培地で予め湿らせたピペットを使用して卵子を培地に移します。次に、卵母細胞を温めた培地の2回目の浴に移します。
2回目の入浴後、卵子を温かいWaymouthの培地に移し、インキュベーターで30分間回復させます。クロマチンスプレッドの準備をするには、PAPペンを使用して、スライドガラス上に11 x 44ミリメートルの長方形を描きます。次に、スライドを1%PFAの薄層で0.2%Triton X-100を水中にコーティングし、スライドを前後に揺さぶって溶液を広げます。
次に、スライドをタップして余分な部分を削除します。次に、最小限の培地で5〜10個の卵子をサイフォンします。次に、ピペットチップを固定液に通すと同時に、卵子を約1cm上からスライドに落とすことにより、卵子を準備したスライドに移します。
卵子はすぐに破裂し、スライド上にクロマチンが広がります。次に、スライドを密閉した加湿チャンバーで室温でインキュベートします。クロマチンがスライドに付着するように一晩落ち着かせます。
記載された胚性クロマチンコレクションを用いて、C57 black/6J胚から採取した卵子におけるクロスオーバー形成を定量的に解析しました。前期クロマチンスプレッド調製物は、SYCP3、SYCP1、およびMLH1を検出するために免疫標識され、DAPIで染色されました。パキテン期の染色体は、27のMLH1病巣が20の完全に組み立てられたSC構造に沿って分布していました。
スプレッド調製物が最適でなく、個々の染色体が区別できない場合、調製物は評価に含まれませんでした。良好な調製では、SMC6はセントロメア周囲ヘテロクロマチン領域および染色体アームに沿って濃縮され、MLH1病巣はパキテン段階でSCに沿って分布していました。15の良好な野生型調製物からのMLH1陽性クロスオーバーの数は約24であった。
卵子採取法は、減数分裂再開後の卵子のクロマチン形態を評価するために使用されました。タンパク質の局在化と倍数性は容易に評価でき、染色体分配エラーの潜在的な原因が明らかになりました。トポイソメラーゼII-αは、染色体アームとセントロメア周囲ヘテロクロマチンに沿って見られました。
MII卵子では、ペアになった姉妹染色分体は染色体とセントロメアの形態によって区別できます。一度習得すると、培養なしまたは培養後にこれらの技術を習得すると、マウス1匹あたり1〜2時間以内に完了できます。この手順に続いて、全細胞卵子免疫標識や生細胞イメージングなどの他の補完的な方法を実行して、細胞のコンテキスト内の相同染色体と姉妹染色分体を評価することができます。
まとめると、ここで説明したクロマチン拡散法は、哺乳類の卵形成と、減数分裂中の染色体およびタンパク質動態の性的に二形の特徴を評価するために簡単に適用できます。
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概要
本稿では、前相のさまざまな段階、第一減数分裂中期、および第二減数分裂中期のマウス卵母細胞におけるクロマチン・スプレッド標本の作製方法を提示します。これらの技術は、哺乳類の卵形成過程におけるクロマチン結合タンパク質や染色体形態の研究を容易にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生殖生物学
- 細胞生物学
背景
- 哺乳類における卵子形成は、特に染色体の分離異常などのエラーが起こりやすい。
- これは遺伝性疾患や不妊症につながる可能性がある。
- これらのプロセスを理解することは、女性の生殖健康にとって極めて重要である。
- クロマチン結合タンパク質は、卵母細胞の発達過程における染色体の挙動において重要な役割を果たす。
研究の目的
- 卵母細胞におけるクロマチン結合タンパク質の局在パターンを可視化する。
- 卵形成過程全般における染色体の形態を評価する。
- 相同染色体の対合および分離のメカニズムを調査する。
使用された手法
- マウス卵母細胞からのクロマチン・スプレッドの調製。
- タンパク質可視化のための免疫標識法。
- 卵母細胞の倍数性の評価。
- クロマチン動態の経時的解析。
主な結果
- 卵母細胞におけるクロマチン結合タンパク質の可視化に成功。
- 異なる段階における染色体形態の明確な評価。
- 減数分裂における染色体分離のメカニズムに関する知見。
- 異数性の母体原因についての理解の向上。
結論
- クロマチン・スプレッド調製法は、卵母細胞の発達を研究する上で有効です。
- この手法は、生殖生物学への理解を深めます。
- 不妊症や遺伝性疾患に関連する課題の解決に寄与する可能性があります。
よくある質問
産業界への適用性と重要性
クロマチン拡げ法（Chromatin spread techniques）を用いることで、卵母細胞の減数分裂におけるタンパク質とDNAの相互作用の可視化が可能となり、生殖生物学におけるターゲットバリデーションを支援します。この手法は、クロスオーバー形成および染色体分離に関する定量的なデータを提供し、不妊症関連経路のメカニズム解析におけるリスク低減に寄与します。また、ステージ特異的なクロマチンのダイナミクスを捉えることで、前臨床モデルにおける減数分裂の忠実度の予測モデリングに役立ちます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 前期Iにおける相同染色体の対合およびシナプシス形成メカニズムの解析を可能にする。
- 科学的価値： DNA修復および交叉調節に関与するタンパク質の機能的検証をサポートする。
- 科学的価値： 卵母細胞の倍数性を評価し、標的パスウェイにおける異数性メカニズムのリスクを低減させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 運用の価値：SYCP3、SYCP1、およびMLH1フォーカスの再現性のある免疫標識のために、標準化されたクロマチン・スプレッドを作成する。
- 運用の価値：アッセイ読み取りの整合性を確保するため、パキテン期染色体あたりのクロスオーバーイベントの定量的スコアリングを可能にする。
- 運用の価値：比較スクリーニングのために、胎児、新生児、および成体の卵母細胞ソースにわたるプラットフォームの再利用をサポートする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 臨床的価値：卵母細胞におけるクロマチン形態と減数分裂再開の結果を関連付け、前臨床的な連続性を裏付ける。
- 臨床的価値：染色体分離の忠実度のバイオマーカーとして、トポイソメラーゼIIαの局在評価を可能にする。
- 臨床的価値：MIおよびMII卵母細胞のステージ特異的な解析を可能にし、性的二型による減数分裂のリスクをモデル化できる。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、前相から第2分裂中期までのクロマチン結合タンパク質の経時的な解析を可能にすることで発見生物学に統合され、卵母細胞の発達における仮説検証に寄与します。
- 探索生物学：染色体形態形成におけるタンパク質の空間的局在を通じて、減数分裂調節因子のパスウェイ解明を支援します。
- スクリーニング：遺伝的または環境的な条件を比較するための再現性のあるアウトプットとして、定量的なMLH1フォーカスデータを提供します。
- アナリティクス：クロスオーバー数およびSMC6濃縮パターンの統計解析を可能にし、減数分裂の進行を評価します。
- トランスレーショナルリサーチ：クロマチンスプレッドの知見を卵母細胞の倍数性評価へと結びつけ、分離異常の前臨床モデルに情報を供します。
- エンタープライズ再利用：縦断的研究のために、卵巣の発達段階全般に適用可能な標準化された細胞学プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：減数分裂中のクロマチン結合タンパク質のダイナミクスを可視化することで、標的メカニズムにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用上の価値：標準化された固定、スプレッド、および一晩のクロマチン吸着ステップを通じて、再現性を確保する。
- 戦略的価値：卵母細胞成熟経路におけるメカニズムの曖昧さを軽減し、標的選択におけるより適切なゴー/ノーゴー判断を支援する。
- ポートフォリオへの影響：クロスオーバーの忠実度および染色体形態の読み取り結果に基づいた、リスク調整済みの標的優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- ガラスピペットまたはキャピラリーを用いた卵母細胞の回収および操作に関する専門知識が必要です。
- 胎児卵巣の単離のための、タイミングを合わせた妊娠マウスおよび解剖器具へのアクセスに依存します。
- クロマチンの完全性を維持するため、低張抽出および固定工程における制御されたインキュベーション条件が必要です。
- 発生段階に応じて卵母細胞を均一に展延させるため、スクロースおよびPFA濃度の最適化が求められます。
- 正確なスコアリングを行うために、不十分な展延標本の中で個々の染色体を識別するために必要な技術的スキルによって制限されます。
