Name: ひと下垂体腺腫の組織のプロテオームの分析のための質量分析法と相まって二次元ゲル電気泳動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 学ぶ二次元ゲル電気泳動と質量分析法を組み合わせた技術で、ヒト下垂体腺腫組織のプロテオームを分離・同定する方法です。高感度質量分析法により低存在量タンパク質も検出可能です。

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この作品は、国家自然科学基金中国 (許可番 81572278 と 81272798 XZ)、中国「863」計画プロジェクト (XZ にグラント号 2014AA020610-1)、才能入門 (XZ)、xiangya の第 3 病院の資金と、湖南省からの補助金によって支えられました。中国の地方の自然科学基礎 (XZ にグラント号 14JJ7008)。著者はまた博士ドミニク M. でテネシー大学健康科学センターでの科学の貢献を認めます。X.Z. 継続的に開発し 2001 年から始まって下垂体腺腫プロテオームを解析する 2DE MS メソッドを使用、現在の原稿のための概念を考案した、書いた原稿に、関連の仕事の調整し、に責任があった、財政支援と対応する作業。Y.L. は、原稿の修正に参加しました。YH は参加する参照のコレクションと原稿の修正。すべての著者は、最終原稿を承認しました。

<ol><li>Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pituitary+adenoma+proteomics%3A+new+progresses+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives.</a> Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+analysis+of+human+pituitary+adenomas%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives.</a> Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).</li>
<li>Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+functional+profiles+of+a+follicle-stimulating+hormone-positive+human+nonfunctional+pituitary+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma.</a> Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+microscopic+to+endoscopic+transsphenoidal+surgery+for+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas.</a> World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).</li>
<li>Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproliferative%2C+antiinvasive%2C+and+proapoptotic+activity+of+folate+receptor+%CE%B1-targeted+liposomal+doxorubicin+in+nonfunctional+pituitary+adenoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells.</a> Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenoma+nitroproteomics%3A+current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell.+Longev%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives.</a> Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710(2013).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference+map+of+a+pituitary+adenoma+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A reference map of a pituitary adenoma proteome.</a> Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).</li>
<li>Desiderio, D. M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+human+pituitary+proteome%3A+The+characterization+of+differentially+expressed+proteins+in+an+adenoma+compared+to+a+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control.</a> Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+human+pituitary+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome.</a> Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+tanscriptomics+analyses+of+secretagogin+down-regulation+in+human+non-functional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pituitary%22%5BJournal%5D)">Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas.</a> Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).</li>
<li>Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+molecular+signaling+in+human+clinically+non-functional+pituitary+adenomas+identified+by+gene+expression+profiling+and+proetomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses.</a> Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+analysis+of+the+proteomes+in+clinically+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas.</a> BMC Med. Genomics. 7, (2014).</li>
<li>Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+of+growth+hormone+isoforms+in+the+human+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary.</a> Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).</li>
<li>Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+pituitary+growth+hormone+variants+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pituitary+nitroproteome%3A+detection+of+nitrotyrosyl-proteins+with+two-dimensional+Western+blotting%2C+and+amino+acid+sequence+determination+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ion-trap+mass+spectrometric+characterization+of+human+pituitary+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins.</a> Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+proteomic+variations+of+invasive+relative+to+noninvasive+nonfunctional+pituitary+adenomas%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas.</a> Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+pathway+networks+mined+from+human+pituitary+adenoma+proteomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data.</a> BMC Med. Genomics. 3, 13(2010).</li>
<li>O’Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).</li>
<li>Klose, J., Kobalz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%3A+an+updated+protocol+and+implications+for+a+functional+analysis+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome.</a> Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).</li>
<li>Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+two-dimensional+gel+electrophoresis+and+multi-dimensional+liquid+chromatography+as+proteomic+separation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chromatogr.+Sep.+Tech%22%5BJournal%5D)">Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques.</a> Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009(2015).</li>
<li>Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+with+gene-product+mapping+of+the+Mollicutes%3A+Mycoplasma+genitalium%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.</a> Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+spatial+and+quantitative+reproducibility+between+two+second-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spot+volume+vs.+amount+of+protein+loaded+onto+a+gel.+A+detailed%2C+statistical+comparison+of+two+gel+electrophoresis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems.</a> Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).</li>
<li>Zhan, X. Two-dimensional electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhan%2C+X+%22Experimental+Protocols+for+Medical+Molecular+Biology+in+Chinese+and+English%22">Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English</a>. Zheng, W. , Peking Union Medical College Press. Beijing. 93-108 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Electrophoresis+in+Practice%3A+A+guide+to+Methods+and+Applications+of+DNA+and+Protein+Separations%22">Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations</a>. Westermeier, R. , VCH Wiley. Weinheim. (1997).</li>
<li>Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?</a> Electrophoresis. , (2018).</li>
</ol>

著者は、利害の衝突がないことを宣言します。

2DE MS PMF と 2DE ・ MS/MS を含む MS 方式と相まって、2DE は正常に私たちの長期的なプログラム - 人間の NFPA プロテオーム変動と分子機構の解明に向けた分子ネットワーク変動を研究するプロテオミクスの使用で使用されているとNFPAs に効果的なバイオ マーカーの発見。再現性の良い 2DE ベースの比較プロテオミクス NFPA プロテオーム変動9,10、11,12,13,の識別に重要な役割を果たしています。19、および抗体法と相まって 2DE 与えられた翻訳後修飾の検出とチロシン ニトロ化16,17の...

PA は、ひと下垂体腺で人間の内分泌系で重要な役割を果たす器官の視床下部-下垂体-ターゲット軸システムで発生する一般的な腫瘍です。PA には、臨床的に機能的および非機能的 (FPA と NFPA) PAs1,2が含まれています。NFPA はだけ小高いホルモン レベル (例えばLH と FSH) FPA 血3,4 に対応するホルモンのレベルを増加している大幅に比較して血液中のため初期段階の診断と治療における困難 ,5。分子機構の解明と効果的なバイオ マーカーの発見、診断、治療、および NFPA の予後に重要な臨床的意義。私たちの長期的な目標は、開発しプロテオーム メソッドを使用して、その分子メカニズムを明らかにする信頼性の高いバイオ マーカーの発見のための NFPA の研究し、効果的な治療上のターゲットとして診断と予後マーカーを認識することです。MS 方式と相まって 2 デは人間 PA プロテオーム1,2,6、7、プロテオーム参照の設立を含むに関する長期研究プログラムで広く使用されています。3、8、発現タンパク質プロファイル9,10、11,12,13, ホルモンの亜種14 の分析マップします。 ,15、リン酸化チロシンと14ニトロ化16,17,など18のポスト翻訳の修正、関連する侵襲のプロテオーム変化非侵襲的 NFPAs19、および NFPA サブタイプ13、複数の重要な経路ネットワーク (ミトコンドリア、細胞周期調節不全、酸化ストレス、MAPK シグナルの発見につながったのプロテオームの不均一性システム異常) NFPA13,,1920に変更します。
2DE は、等電点 (pI) (等電集中、IEF) と分子量 (ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動、SDS ページ) 経由で蛋白質を分ける1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. プロテオームと 1995年24プロテオ ミックスの概念の導入以来、プロテオミクスの分野で一般的で古典的な分離技術は、これ。MS は PMF と MS/MS の戦略を含む、2DE で区切られた蛋白質のアイデンティティを見つけることの重要な技法です。検出感度と LC システムの改善との組み合わせで、解像度の面で特に、MS の器械の非常に急速な開発向上を最大化するプロテオームの低または非常に低の豊富な蛋白質のアイデンティティ、プロテオームの報道。それはまた従来の概念を課題に 1 つまたは 2 つのタンパク質が第 2 ゲルの複雑な人体組織のプロテオームの分析にスポットに存在し第 2 ゲルの複雑な人体組織の分析にスポットで複数の蛋白質を識別する機会を提供しますプロテオームと NFPA プロテオームのカバレッジを最大化します。
ここで述べる 2DE MALDI MS PMF、2DE MALDI MS の詳しいプロトコル/MS と 2DE-クロマトグラフィー-タンデム質量人間 NFPA プロテオーム解析で正常に使用されています。プロトコルの準備は、サンプルの最初の寸法 (等電集中、IEF)、2 番目の次元 (SDS-PAGE)、タンパク質 (銀製の汚損とクマシー ブルー染色) の可視化、画像 2次元ゲル、ゲルのトリプシンの消化力の解析3,8,25,26の焼け付くようなデータベース ・ MS/MS、PMF 由来ペプチドの精製。また、このプロトコルは、他の人間の組織のプロテオームの分析のため簡単に変換します。

<table><tbody><tr><td>エッタンIPGphor 3&nbsp;</td><td>GEヘルスケアの</td><td></td><td>等電点電気集束システム。</td></tr><tr><td>Ettan DALTsix マルチゲル キャスター</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALT II System</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>縦型電気泳動システム</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor ストリップ ホルダー</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ,</td><td></td><td></td></tr><tr>USA<td>エッタン DALTsix マルチゲル キャスター</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA</td><td></td><td>マルチゲルキャスター</td></tr><tr><td>Voyager DE STR MALDI-TOF MS&nbsp;</td><td>ABI, Foster City,CA</td><td></td><td>MALDI-MS PMF</td></tr><tr><td>MALDI-TOF-TOF</td><td>Autoflex III, Bruker</td><td></td><td>MALDI-MS/MS 質量分析計</td></tr><tr><td>LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>ESI-MS/MS mass spectrometer</td></tr><tr><td>EASY-nano LC system&nbsp;</td><td>Proxeon Biosystems, Odense, Denmark</td><td></td><td>高速液体クロマトグラフィーシステム</td></tr><tr><td>PepMap C18 トラップカラム&nbsp;</td><td>300 μ;m i.d. &times;長さ5mm;Dionex Corp.、サニーベール、カリフォルニア州、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RP C18コラム</td><td>75 &mu;m i.d.、長さ15 cm。Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipe Kimvipe</td><td>&nbsp;</td><td></td><td>不溶性ペーパータオル</td></tr><tr>ワ<td>ッターPURELABフレックス機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>製ポリトロンモデルP710 / 35ホモジナイザー</td>ブ<td>リンクマンインスツルメンツ、ウェストベリー、ニューヨーク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDQuest</td><td>Bio-Rad、&nbsp;カリフォルニア州ヘラクレス</td><td>2Dゲル画像解析ソフトウェア</td>SEQUEST&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DataExplore (ver. 4.0.0.0) software</td><td></td><td></td><td>MS spectrum-processing software</td></tr><tr><td>Mascot software</td><td></td><td></td><td>PMF based protein searching software&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>マスコットソフトウェア</td><td></td><td></td><td>MS/MSベースのタンパク質検索ソフトウェア</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer software v.1.3 beta</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur software v.2.1</td><td></td><td></td><td>MS/MSデータ取得管理ソフトウェア&nbsp;</td></tr><tr><td>Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta</td><td></td><td></td><td>ヒトタンパク質データベース</td></tr><tr><td>SEQUEST (version No. 1.3.0.339)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>MS/MSベースのタンパク質検索ソフトウェアI</td></tr><tr><td>MASCOT (version 2.3.02)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>MS/MSベースのタンパク質検索ソフトウェア II</td></tr><tr><td>C18 ZipTip microcolumn</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PeptideMass Standard kit&nbsp;</td><td>Perspective Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay キット&nbsp;</td><td>サーモ&nbsp;フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>2-D クオンツキット</td><td>GE ヘルスケア</td><td>80-6483-56</td><td></td></tr><tr><td>ビスアクリルアミド</td><td>アムレスコ</td><td>0172</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>アムレスコ</td><td>0341</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>チオ尿素</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>VETEC</td><td>V900119</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>AMRESCO</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>AMRESCO</td><td>0465</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>M146</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>AMRESCO</td><td>M133</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>プロメガ、ウィスコンシン州マディソン、米国</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>IPG バッファー pH 3-10、NL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6000-87</td><td></td></tr><tr><td>イモビリンドライストリップpH 3-10NL、18cm</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-1235-01</td><td></td></tr></tbody></table>

ひと下垂体腺腫の組織のプロテオームの分析のための質量分析法と相まって二次元ゲル電気泳動

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

ひと下垂体腺腫 (PA) は、視床下部下垂体標的臓器軸システムのひと下垂体腺で発生し、臨床的に機能または機能しない PA (FPA と NFPA) として分類されるかもしれない一般的な腫瘍です。NFPA は、初期段階の診断とやっと FPA と比較して血液中のホルモンを高めるための治療困難です。私たちの長期的な目標は、PA の分子メカニズムの解明と効果的な診断、予後マーカーや治療標的の認識のための信頼性の高いバイオ マーカーを発見するプロテオミクス メソッドを使用します。効果的な二次元ゲル電気泳動 (2DE) 質量分析 (MS) 法と相まってがここで示されたサンプル、第 2 ゲルの電気泳動、タンパク質の可視化、画像解析、ゲルでの準備を含む人間の PA プロテオームの分析トリプシンの消化力、ペプチドマスフィンガー プリント (PMF)、タンデム質量分析 (MS/MS)2 二次元のゲルの電気泳動マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 PMF (2DE MALDI MS PMF) 2DE MALDI MS/MS、および 2DE 液体クロマトグラフィー (LC) MS/MS プロシージャを正常に NFPA プロテオームの解析に適用されています。高感度質量分析計を用いる多くの蛋白質は 2DE-LC ・ MS/MS メソッドを各第 2 ゲル人間 PA プロテオームのカバレッジを最大化する複雑な PA 組織の分析にスポットしました。

1 です 2DE MALDI MS PMF: FSH 表現 NFPA 組織から抽出した 150 μ g 蛋白質の合計上記実験の手順と (女性; 50 歳、ACTH (-), GH (-), PRL (-)、LH (-), FSH (+) と TSH (-)) 18 cm で配列と。IPG ストリップ (pH 3-10 NL) と銀染色で可視化し、大規模な形式の SDS-PAGE のゲル。NFPA 組織のプロテオーム (図 1)、1.98 ± 0.75 mm IEF 方向の平均位置偏差と 1.62 ± 0.68 mm SDS ページ方向と約 1,200 タンパク質スポットの再現性と良い 2DE ゲル パターンを得たpH 4-8 の質量の 15-150 kDa3エリア内で配布された主に 2DE ゲル マップで検出されました。合計では、337 ゲル スポットは摘出されゲル染め色、トリプシンの消化力、浄化の由来ペプチドと MALDI...

二次元ゲル電気泳動 (2DE) 質量分析 (MS) を人間の下垂体腺腫組織プロテオーム良いと再現可能な 2DE パターンを提示を区別して結合を紹介します。高感度 MS を使って複雑ながんのプロテオームを解析するとき、多くの蛋白質は各 2DE スポットで観察されます。

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

この2次元ゲル電気泳動と質量分析法の組み合わせの全体的な目標は、ヒトの下垂体腺腫組織プロテオームを分離し、同定することです。この方法は、プロテオームフィールドの主要な質問に答えるのに役立ちます。プロテオームの高さなど。そして、タンパク質の状況、タンパク質4、およびタンパク質の広さの発見。この手法の主な利点は、2次元ゲル電気泳動を高感度質量分析と容易に組み合わせて、プロテオーム、特に低存在量のタンパク質を同定できることです。タンパク質の状況、タンパク質4、およびタンパク質の広さ。この技術の実装は、動物療法のPQ反復に向かう傾向があります。タンパク質のキータンパク質のため、広々としたまたはタンパク質パターンは患者の診断に役立ちます。2次元ゲル電気泳動のステップは、時間がかかり、労働集約的で、いくつかの実験的なトリックがあるため、習得が難しいため、この方法のデモンストレーションが重要であることを示します。この手順を開始するには、あらかじめ調製したタンパク質サンプル溶液 250 マイクロリットルを 13 cm の IPG ストリップホルダーの各スロットに追加します。18 cmのIPGストリップをゲル面を下にして、気泡を避けながら各タンパク質サンプル溶液に置きます。次に、各IPGストリップを覆うために3〜4ミリリットルの鉱油を追加します。次に、各IPGストリップホルダーを、尖った端をバックプレートに、四角い端をフロントプレートにした等電点電気泳動システムに組み立てます。IPGストリップを室温で18時間再水和した後、等電点電気泳動システムのIEFパラメータを合計7.5時間および36,875ボルト時間に設定します。IEFの後、各IPGストリップを等電点電気泳動システムから取り出し、不溶性のペーパータオルで余分な鉱物油を取り除きます。次に、各ストリップをラップのシートで包み、摂氏マイナス80度で保管します。12%PAGEゲルをキャストするには、二重蒸留水、1.5モルのトリス塩酸緩衝液、40%アクリルアミド、ビスアクリルアミドストック溶液、10%過硫酸イモジウムを加え、ビーカーにタイミングを合わせます。ゲル溶液を泡立たないように注意しながら、穏やかに混合します。ゲル溶液をマルチキャスティングチャンバーに、予想されるゲル高さ19cmまで穏やかに注ぎます。すぐに約3ミリリットルの二重蒸留水をマルチキャスティングチャンバーに追加して各分離ゲルを覆い、各ゲルを約1時間重合させます。このステップは、高品質のSDS-PAGEゲルを調製するために非常に重要であり、各ゲルの上部に水をすぐに追加する必要があります。2リットルの電気泳動バッファーを調製し、そのバッファーを電気泳動分離ユニットのバッファータンクに加えます。集束したIPGストリップを冷凍庫から取り出した後、1ミリリットルの還元平衡バッファーと微量のブロモフェノールブルーを入れたプラスチック容器に入れ、穏やかに揺さぶって10分間平衡化します。還元平衡緩衝液を取り出した後、4ミリリットルのエクスカレーション平衡緩衝液と微量のブロモフェノールブルーをIPGストリップに加え、穏やかに揺さぶって10分間平衡化します。ゲル平衡中に、マルチキャスティングチャンバーを分解し、調製した分離ゲルカセットを取り出します。ゲルカセットを二重蒸留水で3回すすぎ、次に不溶性のペーパータオルでゲルカセットからアクセス水を取り除き、ゲルスタンダーに入れます。その後、平衡化したIPGストリップを電気泳動バッファーですすぎ、不溶性ペーパータオルで各IPGストリップ表面の余分な液体を取り除きます。IPGストリップを分離SDS-PAGEゲルに置き、IPGストリップのプラスチック面が長いガラスプレートに接触し、先の尖った端が左側になるようにします。次に、3〜4ミリリットルの高温の1%アガロースとSDS電気泳動バッファーをすばやく追加して、各SDS-PAGEゲルの上部にIPGストリップを密封し、気泡を避けながらIPGストリップの上面を短いガラスプレートの上部に置きます。これらの手順は、IPGストリップをSDS-PAGEゲルにシールするために非常に重要です。ホットアガロース溶液を直ちに添加し、IPGストリップを直ちにSDSゲルの上部に配置する必要があります。重合後、組み立てたゲルカセットを垂直電気泳動システムのプラスチックガスケットの間に垂直に挿入します。IPGストリップを装着したゲルの上部をカソードの隣に置きます。次に、電気泳動システムに適切な量のバッファーを添加することにより、電気泳動バッファーのレベルを調整してゲルカセットを浸漬します。電源を定電圧モードで接続してセットし、染料を監視しながら200ボルトで約370分間運転します。ランが完了したら、ゲルカセットを電気泳動システムから取り出し、ゲルが破れないように注意しながら、ゲルをゲルカセットから静かに取り出します。ゲルを250ミリリットルの固定溶液が入ったトレイに慎重に移し、ゲルを20分間穏やかに振とうします。これに続いて、溶液を廃棄し、トレイに250ミリリットルの50%メタノールを追加します。次に、ジェルを10分間静かに振とうします。ゲルを二重蒸留水で振とうした後、0.02%の硫酸ナトリウムを含む250ミリリットルの増感緩衝液を加えます。ジェルを1分間静かに振ってください。ゲルを二重蒸留水で2回振とうした後、250ミリリットルの銀反応溶液を加え、ゲルを20分間静かに振とうします。ゲルを二重蒸留水で振とうした後、250ミリリットルの現像液を加え、所望の染色が得られるまで(通常は1〜3分)穏やかに振とうします。次に、250ミリリットルの5%酸性酸を加えて染色を終了し、ゲルを10分間静かに振とうします。ゲルを二重蒸留水で振とうした後、250ミリリットルの8.8%グリセロールを加え、分析までゲルを摂氏4度で保存します。NFPA組織プロテオームの再現性のある良好な二次元ゲルパターンは、主にpH 4〜8および質量15〜150キロダルトンの領域内に分布した2次元ゲルマップで検出された約1,200個のタンパク質スポットを用いたゲル電気泳動から得られた。MALDI-MS PMF分析では、解析した337のゲルスポットのうち141のゲルスポットから合計192の冗長タンパク質が同定されましたが、残りの196のスポットではタンパク質は同定されませんでした。コンマッシーブルーで染色すると、浸潤性NFPA組織プロテオームの再現性のある高品質の2次元ゲルパターンが得られ、主にpH 4〜8、質量15〜150キロダルトンの範囲内に分布する2次元ゲルマップで検出された約1,100個のタンパク質スポットが得られました。スポットあたり平均1つのタンパク質が、MALDI tof tof MS MS分析で同定されました。対応する各スポットでできるだけ多くのタンパク質が LC-ESI-MS/MS 分析で同定されました。このデータは、各2次元ゲルスポットが複雑なヒトがん組織プロテオームに多くのタンパク質を含んでいることを明確に示しています。この技術を習得すると、適切に実行すれば、2次元ゲル電気泳動を32時間で行うことができます。この手順を試行するときは、特にプロトコルに従って、手順に従うことを忘れないでください。この手順に続いて、プロテオーム内のタンパク質のコード化などの追加の質問に答えるために、安定標識などの他の方法を実行できます。開発後、この技術は、タンパク質ミックスの分野の研究者が、モデル条件、患者、臓器系における大規模な低存在量タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質の特殊化、タンパク質スペーシャス、およびタンパク質4を探求する道を開きました。このビデオを見れば、質量分析と組み合わせた2次元ゲル電気泳動の実施方法と質量分析の組み合わせ方法、良好で再現性の高い2次元ゲル電気泳動パターンの達成方法、および各スポットで多くのタンパク質を同定する方法を十分に理解できるはずです。SDSの痛みやTEMEDでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常にプラスチック手袋の着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

two-dimensional-gel-electrophoresis-coupled-with-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、ヒト非機能性下垂体腺腫(NFPA)の腫瘍組織から得られた複雑なタンパク質混合物から個々のタンパク質を分離する二次元ゲル電気泳動法を実演します。タンパク質は、最初の次元では電荷に基づいて分離され、さらに2番目の次元では分子量に基づいて分離されます。...

二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動:電荷と分子量に基づく複雑なタンパク質混合物中のタンパク質の分析のための分離技術

出典:Wulf, M., et.al.ニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS / MS分析のためのレーザーマイクロダイセクションベースのプロトコル。J. Vis.

ヒト脳組織から単離されたニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS/MS分析

人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。...

コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動（2DE）および質量分析（MS）は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。...

タンパク質機能に2DE  - ゲルスポットから：慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

癌細胞プロテオームの詳細な分析は、新規の薬物標的と診断バイオマーカーの同定を容易にします。ここでは、液体および固体腫瘍に由来するがん細胞亜集団における(リン酸化)プロテオームの定量解析のための実験ワークフローについて説明します。これは、細胞濃縮戦略と定量的なSuper-SILACベースの質量分析を組み合わせることで達成されます。...

液体および固形腫瘍由来の癌細胞のプロテオームの定量的質量分析プロファイリング

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

このプロトコルは、臨床サンプルからのタンパク質の多重反応モニタリング(MRM)のための三重四重極質量分析計の使用を導入することを目的としています。我々は、サンプル調製から臨床サンプルのデータ分析に始まる体系的なワークフローを提供し、必要な予防措置をすべて講じています。...

ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー

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2D-TAUゲル電気泳動によるヒストンプロテオフォームの解明

ここでは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の単離関心領域を用いた質量分析法に基づくプロテオミクス法を確立します。このプロトコールは、アーカイブされたホルマリン固定パラフィン包埋組織切片の特定の組織領域からのプロテオームを解析するために使用されます。...

選択した組織領域を用いた質量分析ベースのプロテオミクスのための合理化されたアプローチ

このプロトコルは、レーザーキャプチャーマイクロディセプションを用いて、腫瘍血管新生の定量的プロテオミクス解析のために、グリオーマサンプルから高品質な新生血管組織を十分に調製することに成功し、従来の主に血管新生因子に焦点を当てた研究の限界を克服し、グリオーマ血管新生の大規模なプロテオミクスプロファイルを提供しました。...

腫瘍血管新生の定量的プロテオミクス解析のためのヒト膠質腫組織からの新生血管組織の調製

学ぶ二次元ゲル電気泳動と質量分析法を組み合わせた技術で、ヒト下垂体腺腫組織のプロテオームを分離・同定する方法です。高感度質量分析法により低存在量タンパク質も検出可能です。

ひと下垂体腺腫の組織のプロテオームの分析のための質量分析法と相まって二次元ゲル電気泳動

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