Name: 統合欠陥レンチウイルスベクターにパッケージ化された転写調節睡眠美容システムによって効率的な体外転位法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぶ統合欠陥レンチウイルスベクターを用いた転写調節Sleeping Beautyシステムによるヒト初代細胞への遺伝子安定統合法。この手法は遺伝子治療研究における細胞工学への応用を可能にする。

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我々 は教授 Zappavigna、モデナ大学、レッジョ ・ エミリア、モデナ、イタリア pCCL PGKrtTA2Sと私たちを提供するために感謝-M2 プラスミド。我々 はまた pCMVSB100X と pT2/BH プラスミドの教授 Z. Ivics (ポール Ehlrich 研究所、ドイツのランゲン) と教授 Z. Izvak (Max Delbruck センター分子医学、ベルリン、ドイツ) を認めます。この作品は、国際デブラとイタリア大学・研究省によって支えられました。

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<li>Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+system+to+redirect+T-cell+specificity+for+human+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications.</a> J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).</li>
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<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+adeno-associated+viral+vectors+utilizing+transposase-mediated+somatic+integration+for+stable+transgene+expression+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76771(2013).</li>
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ここでは、眠れる森の美女による標的細胞のゲノムに安定、五井を統合する広くアクセスできる方法論について述べる-転位を介する。SB システム nonviral ゲノムの編集法を提供するために開発されましたが、統合機械 (トランスポザーゼと T2 トランスポゾン) の効率的な配信は必須です。したがって、SB システムをほとんど transfectable の一次電池、使用する SB コンポーネントのウイルスの伝達は近年10,12,15で追求されました。ただし、採用までウイルスのベクトルのどれも今構成式のトランスポザーゼ トランスポゾンの手に負えない rehopping のリスクにつながる可能性の問題に対処。
転写トランスポザーゼ表現を調整するため、変更したテトでシステム16を利用をしました。RtTA2s結合に伴う重音...

T2 ベース トランスポゾンと結合した多動 SB100X トランスポザーゼは既に臨床遺伝子療法アプリケーション1,2,3, ゲノムの変更4、5で使用されていて、誘導多能性幹細胞 (iPSC)6,7をプログラムし直します。通常、SB コンポーネント一過性トランスフェクション プラスミドによって提供されます、強い構成プロモーター ドライブ、トランスポザーゼの式。ただし、トランスフェクションの向上新しい方法にもかかわらず二成分系の配信のまま多くのアプリケーションのための挑戦です。したがって、新しい配信プロトコルの開発は、関心が高まっています。トランスフェクション法プラスミド8と mRNA9、ほかウイルス配信によるアデノ ウイルス10、11、アデノ随伴ウイルス (AAV)12、バキュロ ウイルス13、gammaretroviral14レンチウイルスベクター15は過去に提案されています。特に、選択肢のシステムはウイルスのベクトルの統合がなければ SB コンポーネントの一時的な配信を保証しなければなりません。それにもかかわらず、構成式のトランスポザーゼは、トランスポゾンの手に負えない rehopping の危険があるため安全上の懸念を発生させます。
したがって、洗練されたテトのシステムによる SB100X の転写調節機構は、初挑戦です。単純ヘルペス ウイルス 1 (HSV-1)16, Timidine キナーゼ (TK) 遺伝子の最小プロモーター (-81) とオリジナル開発最小限サイトメガロ ウイルス (CMV) のプロモーターを置き換えることによって得られる変更されたテト応答性プロモーターのクローンの上流、SB100X cDNA (pTetOTKSB100X)。変異の逆テトラサイクリン トランス rtTA2s-M217は異なるプラスミドの複製 (ホスホ グリセリン酸プロモーター、PGK) 強い構成プロモーターの制御下で表されます (pCCL PGKrtTA2S・ m 2)。Dox を培養培地に加え、rtTA2sがバインドされます-M2 の変調器は、複雑なまたは、SB100X 式18の堅く調整された誘導の Tet プロモーターをテザーします。
2 番目の主要な課題は、物理的・化学的手法によるひと初代培養細胞の非能率的なトランスフェクションから発生します。ひと細胞のトランスフェクション、SB100X、rtTA2sに耐性トランスポザーゼを効率的に配信-M2 式カセットが 2 つ統合欠陥レンチウイルスベクター (IDLVs)19にパッケージ化: IDLVTKSB と IDLVrtTA2s-M2。ウイルスのベクトルは一過性 HEK293T 細胞20と Vescicular 性口内炎ウイルス (VSV G)、感染症の広範なスペクトルを与えるの糖蛋白質 G の新規第 3 世代ベクトルとして生産されています。ベクトル粒子は遠心によって濃縮され、HIV 1 ギャグ p24 イミュノキャプチャー滴定します。細胞と細胞を変換するには、ベクトル粒子は polybrene 複合体し、dox の有無と標的細胞培養が。薬物依存性活性化導入された細胞における SB100X の発現は、定量的 RT-PCR (qRT PCR)18によって測定されます。
テト規制 SB100X 式を示した一度ターゲット細胞のゲノムに (例えば、緑色蛍光タンパク質 GFP) 五井の転位は明らかに Bak とミケルセン21描き出しました分子イベントに従います。IDLV 3 分の 1 は、五井 T2 トランスポゾン IRs (IDLVT2) 間のクローン作成の式カセットが構築し上記のようにパッケージを運ぶベクターします。最後に、効率的に生体外で人間の細胞 (例えば、プライマリ ケラチノ サイト) 変換し、ドキシサイクリン18存在下で五井を統合する 3 つの IDLV ベクトルを使用できます。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ修正されたイーグル」4.5g/Lグルコース含有培地、L-グルタミン</td><td>ロンザ</td><td>BE12-614F</td><td>細胞培養培地なし。</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum(米国)、特性評価</td>された<td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>のSH30071.03</td>血清は<td>、レンチウイルス粒子の生産のためのHEK293T細胞培養に使用されました。</td></tr><tr><td>ペニシリン 10.000 UI/ml ストレプトマイシン 10.000 UI/ml</td><td>ロンザ</td><td>DE17-602E</td><td>細胞培養培地用試薬。</td></tr><tr><td>L-グルタミン 200mM</td><td>ロンザ</td><td>BE17-605E</td><td>細胞培養培地用試薬です。</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>HBS 2X調製用試薬。</td></tr><tr><td>HEPESバッファー、1M生理食塩水ロン</td><td>ザ</td><td>BE17-737EHBS</td><td>2X調製用試薬にストック。</td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム二水和物(Na2HPO4&middot;2H2O)、99.5%</td><td>Merck</td><td>106580</td><td>HBS 2X調製用試薬。</td></tr><tr><td>塩酸 - ACS試薬37%(HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>HBS 2X調製用試薬。</td></tr><tr><td>注射用滅菌水</td><td>フレゼニウス・カビ</td><td>-</td><td>HBS 2X調製用の試薬。</td></tr><tr><td>0.45 以上m PESSフィルター</td><td>Whatman</td><td>10462100</td><td>ウイルス上清から細胞の破片を除去するために使用されるフィルター。</td></tr><tr><td>ポリアロマー ベックマンチューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>超遠心分離によりIDLVベクターを濃縮するための326823チューブです。</td></tr><tr><td>PBS-1X w/o Ca, Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>細胞洗浄およびレンチウイルス粒子再懸濁液用バッファー。</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>(オプション)レンチウイルス粒子再懸濁液用バッファー。</td></tr><tr><td>HIV-1 Gag p24免疫捕捉キット</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>IDLV粒子滴定用NEK50001KTキット。</td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>形質導入効率を高める試薬。</td></tr><tr>HBSS w/o Ca、Mg <td>GIBCO</td><td>BE17-160E</td>試薬<td>中のトリプシン(10X)2.5%</td>で<td>HeLa細胞(ストック溶液、希釈)を剥離します。</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩(EDTA)</td><td>100938B</td><td>トリプシン作業溶液調製用の</td><td>AnalaR BDH</td>試薬。</tr><tr><td>0.5% トリプシン-EDTA、フェノールレッドなし (10X)</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>ケラチノサイト(ストック溶液、希釈)を剥離する試薬。</td></tr><tr><td>ドナーウシ血清、ニュージーランド原産地</td><td>GIBCO</td><td>16030-074</td>スイス<td>マウス3T3-J2細胞培養用血清(フィーダー層)。</td></tr><tr><td>ハムs F12 培地</td><td>GIBCO</td><td>21765</td><td>ケラチノサイト用培地。</td></tr><tr><td>HeLa細胞培養培地用</td>ウ<td>シ胎児血清</td><td>ロンザ</td><td>DE14-801F</td>。</tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、オーストラリア原産</td>地 <td>GIBCO</td><td>10099-141</td><td>ヒト初代ケラチノサイト培養培地用血清。</td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500</td><td>ケラチノサイト成長用試薬。</td></tr><tr><td>アデニンVWR</td><td></td><td>1152-25</td><td>ケラチノサイト成長用試薬。</td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>VWR</td><td>3867-1</td><td>ケラチノサイト成長のための試薬。</td></tr><tr><td>コレラ菌由来のコレラ毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>ケラチノサイト増殖用試薬。</td></tr><tr><td>ケラチノサイト増殖のための</td><td>トリヨードチロニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td>試薬。</tr><tr><td>ケラチノサイトの成長のための</td><td>人間のEGF</td><td>の南オーストラリアの生物的</td><td>GF-010-9</td>試薬。</tr><tr><td>マウスモノクローナルAPC標識抗フィーダー抗体</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-099</td><td>フィーダー層を標識する。</td></tr><tr><td>RNeasy Plusミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RNA精製キット。</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18080051</td><td>逆転写酵素キットです。</td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチドミックス、10 mM (dNTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7295</td><td>半定量的PCR用試薬。</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>(any)</td><td>-</td><td>Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR (半定量的 PCR および非</td>活性 DNase/RNase-フリー蒸留水(任意)-試薬)</tr><tr><td>GoTaq G2ホットスタートポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M740B</td><td>Taqポリメラーゼ。</td></tr><tr><td>アガロース、分子生物学用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>アガロースゲル電気泳動用試薬。</td></tr><tr><td>UltraPure TBE Buffer, 10X</td><td>Invitrogen</td><td>15581028</td><td>アガロースゲル電気泳動用試薬、ddH2Oで希釈(1X)。</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>アガロースゲル電気泳動用試薬。</td></tr><tr><td>HeLa細胞およびケラチノサイトでトランスポゼース発現を誘導する</td><td>ドキシサイクリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9891</td>薬剤</tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystem</td><td>4304437</td><td>TaqMan Universal PCR Master Mix including Primers and probe.</td></tr><tr><td>15mL高透明度ポリプロピレン遠心分離チューブ、円錐底、ドームシールスクリューキャップ付き、細胞</td><td>収集およびベクター希釈調製用の</td>滅菌<td>ファルコンコーニング</td><td>352096</td>チューブ。</tr><tr><td>150 mm TC処理細胞培養ディッシュ、20 mmグリッド、滅菌</td><td>済みFalcon Corning</td><td>353025</td><td>ウイルス生産用細胞培養ディッシュ。</td></tr><tr><td>6ウェルクリアフラットボトムTC処理マルチウェル細胞培養プレート、蓋付き、個別包装、滅菌</td><td>済みFalcon Corning</td><td>353046</td><td>HeLaおよびヒト初代ケラチノサイト形質導入用の細胞培養プレート。</td></tr><tr><td>Safe-Lock 微量遠心チューブ、容量 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>希釈調製用チューブ。</td></tr><tr><td>Safe-Lock 微量遠心チューブ、容量 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>希釈調製用チューブ。</td></tr><tr><td>フラットキャップ付き0.2ml PCRチューブ、RNase、DNase、DNAおよびPCR阻害剤フリー</td><td>(任意)</td><td></td>-<td>半定量的PCR用チューブ。</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL</td><td>Applied Biosystem</td><td>4346906</td><td>96-well for qRT-PCR.</td></tr><tr><td>5mL丸底ポリスチレンチューブ、キャップなし</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td>フローサイトメトリー取得用チューブ。</td></tr><tr><td>使い捨て血清ピペット、ポリスチレン、個別包装、滅菌(異なる容量)(</td><td>任意)</td><td>-</td><td>滅菌組織培養アプリケーション用のピペット。</td></tr><tr><td>フィルターチップ、滅菌済み、およびRNase、DNase、DNAおよびパイロジェンフリー(容量が異なります)(</td><td>任意)</td><td>-</td><td>滅菌組織および分子生物学アプリケーション用のフィルターチップ。</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>(任意)</td> <td>-</td> <td>HBS 2X pHの測定のための機器。</td></tr><tr><td>PCR サーマルサイクラー</td><td>(任意)</td> <td>-</td> <td>半定量的PCR用の装置です。</td></tr><tr><td>アガロースゲル電気泳動装置</td><td>(任意)</td> <td>-</td> <td>半定量PCRのアガロースゲル電気泳動のための装置。</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II 2LSR 4/2</td><td>BD</td><td>フロー</td><td>サイトメーター。</td></tr><tr><td>7900HT 高速リアルタイムPCRシステム</td><td>Applied Biosystem</td><td>7900HT</td><td>qRT-PCR用機器。</td></tr><tr><td>細胞培養アプリケーションで効率的なサンプル処理を行う卓上型遠心分離機、冷蔵、マイクロプレートバケット付き。</td><td>(任意)</td><td>-</td><td>細胞培養処理および脊髄形成用の遠心分離機。</td></tr><tr><td>Optima L-90K SW32TIローター</td>ベ<td>ックマン・コールター</td><td>-</td><td>レンチウイルス粒子生産用超遠心分離機</td>を装備した超遠心分離機。</tr><tr><td>細胞培養および分子生物学研究室用の機器(例:BSL2材料、細胞培養インキュベーター、冷蔵庫、冷凍庫(+4°C)を含む作業用に設計されたクラスII層流フード。C、-20 >C、-80 >C)、マイクロピペットおよびピペットエイド)。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>研究所の規則および規制に従った保護用実験コート、手袋、フェイスプロテクション、特にレンチウイルス粒子の生成と形質導入用。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

統合欠陥レンチウイルスベクターにパッケージ化された転写調節睡眠美容システムによって効率的な体外転位法

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

眠れる森の美女(SB) トランスポゾンは遺伝子導入および機能ゲノム解析の実証済みの有効性と非ウイルス性統合システムです。SB トランスポゾン機械を最適化するためには、転写規制多動トランスポザーゼ (SB100X) やトランスポゾンの T2 ベースを採用します。通常、トランスポザーゼとトランスポゾンは一過性トランスフェクション プラスミッドによって提供される、SB100X 式が構成のプロモーターによって駆動されます。ここでは、SB100X 式を制御し、安定した統合により、「カットアンド ペースト「アンチモン (五井) 興味遺伝子のいくつかの物理的および化学的遺伝子導入方法に耐性がある人間の細胞に SB コンポーネントを提供する効率的な手法について述べるメカニズム。多動トランスポザーゼの式は 1992 年以来の遺伝子発現の制御に広く用いられる、テトのシステムによって厳しく制御されています。興味の遺伝子は、反転の繰り返し (IR) T2 トランスポゾンによって挟まれています。SB の両方のコンポーネントは、欠陥レンチウイルスベクターは一過性 HEK293T 細胞で生産される統合パッケージ化されます。ヒトの細胞、細胞株あるいは人間のティッシュから初代培養細胞は体外一過性のウイルスのベクトルを導入です。培地にドキシサイクリン (dox、テトラサイクリン アナログ) の追加が、トランスポザーゼ式の微調整は、測定し、扱われた細胞のゲノムの興味の遺伝子の長期的な統合の結果します。このメソッドは効率的で (例えば、HeLa 細胞) と初代培養細胞 (例えば、人間プライマリ ケラチノ サイト) に適用される、従って遺伝子工学や遺伝子治療のための貴重なツールを表します。

ここで説明されて手順を使用して規制される SB 成分を運ぶ 3 つの IDLV ベクトル (SB100X、rtTA2S-M2 と T2 GFP のトランスポゾン) パッケージ化され使用を効率的に配信し、しっかりと人間の細胞で SB 系を調節します。図 1 aは、体外伝達 HeLa 細胞 (表 2に報告される) 2 つの IDLV ベクトルの最高用量の組み合わせで SB トランスポザーゼの転写制御を行った方式を示しています。SB100X の転写制御だった qRT PCR (図 1 b) を用いて、オフ状態に対して相対的な量 (RQ) 値としてプロット (IDLVTKSB だけで RQ = 1)。導入された HeLa 細胞の背景 (IDLVTKSB) に SB100X 式の 8 活性化 (+ dox) が得られました。特に、rtTA2sTetTK プロモーターのタ...

このプロトコルでは、転写調節の眠れる森の美女システムによって人間のゲノムへの興味の遺伝子の安定した統合を実現する方法について説明します。統合導入された細胞の分子アッセイ、ひと細胞の体外伝達不良レンチウイルスベクターの作製が報告されます。

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

この方法の全体的な目標は、転写制御されたスリーピングビューティーシステムを統合欠陥のあるレンチウイルスベクターにパッケージ化することにより、目的の遺伝子を初代細胞のヒトゲノムに安定的に統合することです。この方法は、スリーピングビューティーシステムを使用して目的の遺伝子を初代細胞に統合するなど、遺伝子治療分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、誘導性過活動スリーピングビューティーシステムが、いくつかのトランスフェクション法に耐性のある初代細胞を効率的に送達することです。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるDaniela Benatiです。形質導入の日の前に、ヒト初代ケラチノサイトは、テキストプロトコルに記載されているように増殖します。培養中のサブコンフルエントなケラチノサイトを分離するには、培地を取り出し、細胞を1X PBSで洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの予熱済みトリプシンワーキング溶液を加えます。細胞培養インキュベーターで37°Cで15分間インキュベートします。ウェルの細胞を完全に再懸濁し、細胞懸濁液を2ミリリットルの血清含有培地を含む遠心チューブに移します。3ミリリットルの1X PBSでウェルを一度すすぎ、すすぎた溶液を細胞懸濁液と一緒に遠心分離チューブに加えます。580 g で 5 分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞を5ミリリットルの1X PBSで洗浄し、580倍gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。15ミリリットルのポリプロピレンチューブで、1ミリリットルのCFAD培地で5番目のケラチノサイトに1.6倍の10を希釈します。各条件につき1つの希釈液を準備します。3つのIntegration Defective LentiviralまたはIDLVベクターは、テキストプロトコルに記載されているように、以前に調製されました。IDLVTKSBは、TET制御の多動性SB100X転置を運びます。モジュレーターのIDLVrtTAコードとIDLVT2は目的の遺伝子を運びます。この例では、GFPはトランスポゾン逆繰り返しに隣接しています。この表に示されているように、20マイクロリットルのポリブレンの存在下で、レンチウイルスベクターを1ミリリットルのCFAD培地で希釈します。.1、2、および 3 は、ベクトルのない負のコントロールです。4 と 5 には IDLVTKSB と IDLVrtTA が含まれています。6、7、8、および9には、3つのレンチウイルスベクターすべてが含まれています。各レンチウイルスベクター希釈液を対応するケラチノサイト懸濁液に添加することにより、懸濁液中の細胞を形質導入します。1日前に後退した致死照射された3T3-J2フィーダー細胞から培地を取り出し、形質導入したケラチノサイトをそれらの上に播種します。井戸を形質導入した後、次の井戸に進みます。25°Cで30分間インキュベートします。次に、セルを37度に6時間移します。6時間後、各ウェルに1ミリリットルのCFAD培地を加えます。ドキシサイクリンの1マイクロモルを5、8、および9のウェルに追加します。セルを摂氏37度に戻します。続いて、テキストプロトコルに記載されているように、各ウェル内の細胞を処理します。細胞蛍光分析では、3日目と6日目に分離した形質導入された初代ケラチノサイトを、マウスモノクローナルAPC標識抗フィーダー抗体で細胞を標識することにより、3T3-J2フィーダー層から識別する必要があります。5%FBS、500ミリモルEDTA、および1X PBSを組み合わせて、各サンプルに4ミリリットルの染色バッファーを調製します。剥離した細胞を1ミリリットルの染色緩衝液で洗浄します。580 g で 5 分間遠心分離し、上清を捨てます。フローサイトメトリー取得用チューブ内で、100マイクロリットルの染色バッファーに4番目の細胞に10の5倍を再懸濁します。2マイクロリットルの抗フィーダー抗体を1〜50の希釈液で加え、よく混合します。暗闇の中で氷上で30分間インキュベートします。30分後、2ミリリットルの染色緩衝液で洗浄します。580倍gで5分間遠心分離します。上清を捨て、200マイクロリットルの染色緩衝液に再懸濁します。青色レーザー、赤色レーザー、およびGFPおよびAPC蛍光を検出するためのフィルターで構成されたフローサイトメーターを使用して、APCおよびGFPシグナルを取得します。APC陰性細胞集団のGFP陽性細胞画分は、形質導入されたケラチノサイトを示す。リアルタイムPCRを行うには、最終反応容量25マイクロリットルの96ウェルプレートで反応を3倍にセットアップします。各反応には、1マイクロリットルのcDNA、12.5マイクロリットルの2Xマスターミックス、1.25マイクロリットルの20Xプローブミックス中のプライマー、および10.25マイクロリットルの滅菌水が含まれています。このPCRプログラムに従って、95°Cで1サイクル10分間、次に95°Cで15秒間、60°Cで1分間の40サイクルを行い、4°Cで保持するというリアルタイムPCRを実行します。最後に、テキストプロトコルで説明されているように、リアルタイムPCRデータを分析します。モジュレーターベクターのトランスポーズ量を増やして形質導入したHeLa細胞の発現解析では、ドキシサイクリンをプラスまたはマイナスして、SB100Xの発現を強力に誘導するためには、両方のIDLVを高用量で必要とすることが示されました。トランスポーズベクターを形質導入したHeLa細胞のSB100X発現を、モジュレーターベクターの存在下または非存在下で定量的に解析した結果、ドキシサイクリンの存在下でバックグラウンド上で8倍の活性化が明らかになりました。転写制御されたスリーピングビューティーシステムは、初代細胞にも使用できます。トランスポーズおよびモジュレーターベクターで形質導入したケラチノサイト上のSB100X発現は、オフ状態で15倍の活性化を示しました。3つのIDLVベクタープラスマイナスドキシサイクリンで形質導入したケラチノサイトで行った転位実験では、ドキシサイクリンで処理された細胞の12%がゲノムにGFPの少なくとも1つのコピーを安定して組み込んでいることが示されました。習得すれば、初代細胞における重要な形質導入は8時間で、細胞蛍光分析は2時間で、発現分析は適切に行えば3時間で完了します。この手順を試行する際には、初代細胞の形質導入に使用されるベクターの用量の組み合わせを最適化し、誘導可能な眠れる森の美女の転置のより高い発現レベルを達成することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、細胞あたりのトランスポゾンコピー数やゲノムファイリングのための組み込みなどの追加の質問に答えるために、定量PCRやリンカー媒介PCRなどの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、遺伝子治療の分野の研究者が臨床関連細胞のエンジニアリングにおける眠れる森の美女システムの応用を探求するための道を開きました。ビデオを見た後、IDLVベクターで初代ケラチノサイトを最初に形質導入する方法を十分に理解しているはずです。次に、ドキシサイクリン状態に対する活動亢進トランスポーズの発現を測定し、最後にフローサイトメトリーによるトランスポジションを追跡します。ウイルスベクターの取り扱いは非常に危険であるため、これらの手順を実行する際には、レベルを封じ込めるためのBCLや使い捨ての供給などの予防策を常に携帯する必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

このビデオでは、受精マウス胚の周辺空間へのレンチウイルスベクターの核前注入について説明しています。レンチウイルスには導入遺伝子が含まれており、受精胚のゲノムに組み込まれ、最終的にトランスジェニックマウスが生まれます。...

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マウスへのレーザ レンチ ウイルス遺伝子導入受精卵

編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン...

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我々は、ニワトリ胚への人工マイクロRNA配列の導入とゲノム組み込みを、 in ovo...

Tol2トランスポゾンを介した人工マイクロRNAのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ

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低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いたhESCおよびNPCへのshRNAのレンチウイルス媒介送達

私たちは、レンチウイルスベクターを使用して、 in vivoで腹膜組織に常在するマクロファージの遺伝子機能を調べるための段階的なプロトコルを示します。...

マウスにおける腹腔組織常在マクロ ファージの 効率的な遺伝子およびマイクロRNA調節のためのレンチウイルスベクター調製

学ぶ統合欠陥レンチウイルスベクターを用いた転写調節Sleeping Beautyシステムによるヒト初代細胞への遺伝子安定統合法。この手法は遺伝子治療研究における細胞工学への応用を可能にする。

統合欠陥レンチウイルスベクターにパッケージ化された転写調節睡眠美容システムによって効率的な体外転位法

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