蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

この実験の全体的な目標は、生細胞におけるSNAREタンパク質の複雑な形成を視覚化することです。この方法は、特定のオルガネラの輸送ステップを触媒するSNAREタンパク質のセットを特定するなど、膜輸送分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、SNAREが複雑な形成に関与する細胞位置を直接視覚化できることです。

この実験では、3つのエッペンドルフチューブに分割された900, 000個のHeLa細胞をトランスフェクションに使用します。テキストプロトコルに記載されているように、以下のコンストラクトを使用して細胞をトランスフェクションします。サンプル番号 1 は syntaxinin-4 mCitrine コンストラクト、サンプル番号 2 は syntaxinin-4 mCitrine と VAMP3-mCherry、サンプル番号 3 は syntaxinin-3 を mCitrine と mCherry の両方に融合させたものです。

トランスフェクションした細胞を、10%FCSと1%抗生物質を添加した高グルコースDMEMで、摂氏37度、5%CO2の細胞培養インキュベーターで一晩培養します。翌日、培地を吸引し、細胞をライブセルイメージング培地で2分間1回洗浄します。その後、細胞を新鮮なイメージング培地に入れます。

この手順を開始するには、サンプル番号2を摂氏37度の加熱ステージに置き、ドナー蛍光色素のパルス励起源と時間分解データ取得を備えた時間領域蛍光寿命イメージング共焦点顕微鏡の下に置きます。各蛍光ライフタイムイメージング顕微鏡法またはFLIM測定の前に、mCitrineおよびmCherry標識SNAREタンパク質の発現が見える細胞を選択し、両方の蛍光色素を同時に励起して256×256ピクセルの共焦点画像を記録します。FLIM画像を記録するには、FLIM画像が以前に記録された共焦点画像と同じ寸法と空間解像度で記録されている状態でFLIMの実行をクリックします。

全細胞FLIM分析のために少なくとも50、000光子、またはピクセルあたり少なくとも400光子で画像を記録します。反射ビューを避けるために、ガラスの表面から少なくとも1マイクロメートル離れた場所でFLIM測定値を記録することが重要です。サンプル番号2の複数の細胞から、およびサンプル番号1とサンプル番号3の細胞からイメージングを繰り返します。

次に、装置の応答関数またはIRFを記録するために、顕微鏡ステージに清潔なガラスカバースリップを置きます。発光検出器のモノクロメーターを励起波長に調整し、FLIM実行ボタンをクリックして、ガラスカバースリップからの後方散乱でFLIM画像を記録します。写真の録画は、PT32ICS変換ソフトウェアでFLIM画像に変換されます。

ソフトウェアを設定します。FLIM イメージを生成するには、出力を ImageJ に設定します。画像サイズを 256 x 256 ピクセルに、チャネルを 2 に設定します。

変換を押して、1つ以上のフォトントレースをロードします。コントロールキーを押したままにすると、複数のフォトントレースが選択されます。FLIM画像は、フォトントレースが保存されているのと同じフォルダに生成する必要があります。

まず、デコンボリューションでフィッティングできるデータ解析ソフトウェアプログラムを開きます。各フォトントレースのヒストグラムを含むテキストファイルをインポートします。IRF がテーブルの 2 番目の列、列 A の時間値の隣に来るようにテーブルを再編成します。すべての列を選択して、記録されたフォトン トレースの品質を確認します。

反射率の高いピークを持つフォトントレースは解析しないでください。次に例を示します。制御キーを使用して、フィットする品質管理されたライフタイムヒストグラムを含むすべての列と、列BのIRFを選択し、非線形フィットを読み込みます。

デコンボリューションフィット関数を読み込みます。この関数を解析ソフトウェアに追加してください。フィット関数ファイルを選択します。この関数は、IRF でデコンボリューションされたモノ指数減衰関数を持つ蛍光寿命ヒストグラムに適合します。

フィットした曲線のX軸スケーリングを実行します。はめ込みを押して曲線をはめ込みます。これにより、フィットが変換され、蛍光寿命、オフセット、および振幅を含むテーブルを含むレポートシートが配列に生成されます。

また、フィット曲線とフィットの残差を含むデータシートも生成されます。示されているのは、4 mCitrineのシンタキシンのみ、VAMP3 mCherryを併用したスニタキシン4 mCitrine、または3 mCitrine mCherryタンデムコンストラクトのシンタックスのみを発現するヘロセルの代表的な共焦点像です。これらの付随する蛍光寿命画像では、色は平均見かけの蛍光寿命を示しています。

次に、画像はmCitrineドナー蛍光色素の蛍光強度で畳み込まれました。次に、双指数関数減衰関数を使用したフィッティングを使用した同じ画像です。ピクセルの色は、VAMP3と複素数で4のシンタックスの推定分数を示しています。

セットアップの機器の応答関数は、ガラス水界面の後方散乱を使用して測定されました。4 mCitrineの構文のみを発現する細胞、4 mCitrineの構文をVAMP3 mCherryと共発現する細胞、および3つのmCitrine mCherryタンデムコンストラクトの構文を発現する細胞について、全細胞寿命ヒストグラムを示します。パネルEは、パネルB、C、およびDの減衰曲線のオーバーレイを示しています。インレイは同じグラフを示していますが、Y軸の対数スケーリングがあります。

顕微鏡カバースリップの表面に近すぎる蛍光寿命ヒストグラムが記録された結果、黄色の影付きの領域で示される大きな反射ピークが発生しました。最後に、双指数減衰関数を使用した代表的なフィットを持つライフタイムヒストグラムを示します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2〜4時間で完了します。

この手順を試行する際には、ドナーとインターセプターSNARESの発現レベルが寿命に影響を与える可能性がある一方で、複数の細胞を記録することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、SNARE媒介膜輸送の再ルート化に関連する細胞タイプ固有の質問に答えるために、細胞を活性化することができます。その開発後、この技術は、膜輸送分野の研究者がすべての真核細胞のオルガネラ輸送の細胞間経路を探索する道を開きました。

このビデオを見れば、FLIMデータの記録方法と分析方法について十分に理解できるはずです。遺伝子組み換え生物や高出力レーザーを扱う作業は非常に危険であり、この手順を試みる際には手袋や目の保護具などの予防策を常に講じる必要があることを忘れないでください。