Name: タンパク質複合体の構造の解明 - JoVEジャーナル
Uploaded: 2017-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 本研究は架橋解析と質量分析を組み合わせて多サブユニットタンパク質アセンブリを解析し、その構造の理解を深めます。

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役に立つ議論の仲間たちに感謝いたします。我々 はまた蛋白質の複合体を提供するためイルメ シュリヒティングとカール ・ ピーター Hopfner をありがちましょう。我々 は、教育と研究のための中央政府大臣からの資金調達を認める (BMBF、ZIK プログラム、03Z22HN22)、欧州地域開発基金 (EFRE、ZS/2016/04/78115) と c. s.、Wellcome の信頼 (109854/658 から資金に MLU ハレ ・ ヴィッテンベルクZ/15/Z) を兼

著者が明らかに何もありません。

プロトコルは、複数のサブユニット蛋白質の複合体の質量分析を用いた構造解析のため提供しています。プロトコルで説明されている 2 つの手法は、主に相補的な結果を提供し、タンパク質でアレンジを構造に洞察力を得るために適しています (-配位子) 錯体従来構造技術によって研究することは困難であります。ネイティブの質量分析法は、subcomplexes と安定した相互作用モジュールを分析することによってタンパク質の結果として蛋白質の相互作用についての洞察を提供します。架橋、その一方で、直接連絡先のサイト上の情報が得られます。によって使用される架橋剤、特定の柔軟性またはできます分析に含まれるべきであります。
指定されたプロトコルは、一般的に簡単に実行でき、ない時間がかかる。全体のプロトコルは、一週間内で実行することができます、タンパク質複合体量は解析に成功に必要なほぼすべてのタンパク質にも適用できます。サンプル準備は簡単、特に精製したタンパク質複合体を必要としません。ただし、1 つの一般的な落とし穴は、質量分析を用いたタンパク質の同定のための試料調製中のサンプルの汚染です。ほとんどの場合これらの汚染には、ほこり、皮膚や髪から由来するケラチンが含まれます。したがって、手袋、白衣を着てなど余分なケアは、水性バッファーをろ過、高純度溶剤を使用べきである質量分析を用いたタンパク質の同定のためのサンプル準備の間。シャペロンなど他の汚染タンパク質は、親和性の札を使用するとき通常例えば蛋白質の浄化の時に紹介しています。これらのケースで蛋白質の浄化によって改善されるべき、例えば洗濯ステップ数を増やします。いずれの場合も、サンプルの蛋白質汚染容易に識別データベース検索時に分類フィルターを省略することによって (すなわち、すべての種からの蛋白質に対する検索)。場合にのみ、いくつかのペプチドが観察される (すなわち、低たんぱくのカバレッジが得られて) にもかかわらず、十分なサンプルがあり、消化中に異なるプロテアーゼを使用する必要があります。一般的にトリプシンを生成ペプチド; の十分な数しかし、膜タンパク質や膜タンパク質のドメインなどのいくつかの場合、トリプシンの切断点の数を減少、他のターゲットに疎水性アミノ酸の酵素がより良い選択。
計測、面で特に変更された楽器はネイティブ質量気相への移動中に非共有結合相互作用を維持するために必要。Q ToF および orbitrap 楽器を含む、いくつかの楽器の種類が紹介されています。変更 Q ToF 質量分析計は数年からネイティブの質量分析用市販、後者は最近導入され、ほとんどの場合必要があります専門の変更45。しかし、高解像度機器のアプリケーションは複数の配位子とその定量化46,47のバインディングを勉強できる、有望な将来のアプリケーションです。
液体クロマトグラフィー質量分析法による架橋・ ディ ・ ペプチドを識別するためにいくつかの変更と標準的な手順を適用できます。ただし、データベース検索は、制限の要因として、専用のソフトウェアが大規模なデータベースを扱うことがめったとの複合体の蛋白質の亜単位を含んでいる減らされたデータベースが必要です。近年使用される質量分析法による劈開ゲルビーズ全体のセル lysates48,49で蛋白質の相互作用を対象とします。タンデム質量分析の実験でフラグメントの主化学ゲルビーズの使用線形ペプチド (、架橋剤によって変更)、それ以上の分裂によって識別することができますを生成し、線形ペプチドおよびこれのデータベース検索を低減時間と計算検索空間を検索します。しかし、これらの実験を実行するイオン トラップ質量分析計またはイオン トラップを用いたハイブリッド質量分析計です。一般に、偽陽性は重要な問題、架橋ペプチドの質量スペクトルがしばしば手動でデータ解析時間が非常に長く、そのフラグメント スペクトルの質によってに検証されます。さらに検証手順、したがって潜在的な将来のアプリケーションなしに適用できる堅牢なスコアリング システムの開発。データ分析が向上し、偽陽性の数を減らす 1 つの方法は、偽の発見率の計算とデータ セット50を架橋への応用の紹介をされました。
さらに質量分析技術一般に、ここで説明したテクニックで補完することができます (例えば、共有ラベル) 解析からの出力を増加させる。その他の変更とプロトコルの改善は簡単に実装できます。よう比較架橋34は蛋白質の集合の構造変化を解きます。ネイティブの質量分析法のさらなる発展は最近膜蛋白質51,52の解析、脂質28,52,53,54との相互作用を許可します。.ネイティブの質量分析のための高分解能質量分析計の新展開アプリケーションとリガンド結合、例えば脂質膜蛋白質への結合を拡張、今解析45,に含まれることができます。46. 計算モデル化のアプローチと組み合わせて、これらの技術は可変解像度55の構造モデルを提供できます。そのまま複雑なまたは 1 つのサブユニットの結晶構造がない場合、質量分析は蛋白質の相互作用および未知の複雑なトポロジに最初の洞察力を提供できます。不明な複合体の低解像度のモデルによって使用される技術と得られた結果、56,57,58得られます。結晶構造やホモロジー モデルがある場合、質量分析法の構造情報もネイティブに近いモデル59をもたらすことができます。
質量分析法による他の構造技術と比較して利点がある、濃度の低いサンプルが必要です、それは異種のサンプルを扱うことが、蛋白質の複合体のサイズが無制限に適用できます。さらに、質量分析は蛋白質の動的なシステムの調査をことができます。ソリューション内に存在するタンパク質やタンパク質複合体の異なった人口が通常一緒に分析され、そのためとは異なり特定の集団の選択を必要とする他の構造技術とすべての立体構造中が維持されます。分析とは、1 つの実験で課税。定量的な架橋方法は最近導入された34,60,61有望な将来のアプリケーションをさまざまな条件下での構造変化を記述します。

タンパク質複合体の構造研究は、特に重要な細胞プロセスの理解のためになりました。その結果、多くの場合、技術を開発し、構造生物学1で改善が。ただし、これらのテクニックは時々 調査中蛋白質の複合体の不均一性や柔軟性、サイズにより、アプリケーションで制限されます。質量分析法は、これらの課題に対処することができますそして、したがって、構造生物学2,3,4、5の強力なツールとして浮上しています。質量分析法の最大の利点は、複雑で、異種混合6でもタンパク質を明確に識別する能力。このため、蛋白質は通常 endoproteinases と消化され、得られたペプチド混合物を液体クロマトグラフィーで分離し、質量分析計に直接溶離されます。ペプチッド固まりが決定されその後、ペプチドのフラグメント化の前駆イオンを選択しました。タンパク質は検索ペプチドおよび知られているデータベースに対して対応するフラグメント大衆によって、識別されます。この手順には、ペプチドやタンパク質も前駆体ペプチドと変更7を運ぶフラグメント イオンの質量変化をもたらします彼らのポスト翻訳の修正の識別だけでなくことができます。構造質量分析法における多くの技術のいくつかは、この原則4,8に基づいています。例えば、ラベリングなど水素重水素交換9,10技術、化学ラベリング戦略11,12、またはヒドロキシルラジカル足印刷13,14、特定の条件の下で蛋白質の表面のアクセシビリティに洞察力を与えます。
別の手法は、機能グループを通じて近くのアミノ酸の結合のリンケージを含む架橋 (化学) です。このためアミノ酸や紫外線アクティブ化可能な試薬、化学試薬が採用15,16です。、相互リンク後タンパク質はプロテアーゼと通常加水分解し、架橋・ ディ ・ ペプチドが液体クロマトグラフィー質量分析法によって分析されます。データベース検索、架橋物の同定ただし、様々 なタンパク質と別々 の地域17,18,19のペプチド配列を連結する特殊なソフトウェアの使用が必要です。化学ゲルビーズの使用には、関心のほとんどすべてのタンパク質の複合体を採用することができ、宿主細胞に興味の蛋白質を表現するときにのみ達成することができます紫外線アクティブ化可能なアミノ酸の取り込みを必要としない利点があります。など、汎用性の高いツールです架橋とも大きな蛋白質アセンブリ20の多くの構造研究で採用された正常に。
そのまま蛋白質複合体 ('native' 質量分析法とも呼ばれます)、その一方で、質量は、ペプチドにタンパク質とタンパク質加水分解なしの分析を含みます。組成、不均一性、化学量論、トポロジ、およびタンパク質複合体21,22のサブユニットの相互作用を明らかにします。イオン移動度と組み合わせて、さらにネイティブの質量はその構造23,24の決定をことができます。これは従来構造技術によって評価しにくいタンパク質複合体の構造の調査のための強力なツールになります。ただし、ネイティブの質量分析法は、エレクトロ スプレー イオン化の間に非共有結合蛋白質の相互作用を管理する分析バッファーを必要があります。これは通常アンモニウム酢酸25など水の揮発性のバッファーを使用して実現されます。さらに、楽器の変更が質量分析計26の気相に伝達の間に解離を防ぐために必要です。この方法で適用すると、多くの (大) 蛋白質の複合体を行った。印象的な例は、そのままリボゾーム27、ATP 合成酵素28、またはウイルス29の研究です。
ネイティブの質量と架橋の組み合わせを前の研究で特に成功した証明しました。予想外の Hsp70 ダイマーを含むシャペロン複合体の結果がそのまま蛋白質の複合体の質量分析実験から取得でした化学架橋の蛋白質の手配を明らかにしながら、例えば、アセンブリの30,31。別の研究では、複雑なそのまま ATP のシンターゼのポスト翻訳の修正の効果を調べた。ネイティブの質量分析法は、リン酸化やアセチル化32,33の有無でタンパク質の複雑な安定性への洞察を提供しました。比較架橋戦略34は、異なる条件の下で複雑な蛋白質の構造変化を明らかにしました。
ここでは、質量分析法、(化学) 架橋とデータ分析と解釈 (図 1) を含むネイティブの質量分析法によるタンパク質同定のプロトコルをいたします。2 つのよ特徴付けられたタンパク質複合体の助けを借りて、これらのメソッドから取得した相補的な結果の組み合わせは実証35です。我々 のプロトコルは、特定の純度と濃度に精製することができます任意の蛋白質のアセンブリに適用できます。アプローチはデータ解析データ、すなわちデータベースのサイズを架橋による限られたいくつかのケースで採用、必要な検索空間と時間を決定します。さらに、識別されたクロスリンクの手動の検証が必要、さらに出力を低減します。ネイティブの質量分析、サンプルの質、例えばバッファー制限は主、付加体の水溶液と揮発性のバッファーによって交換する浄化と可能性の時に使用します。ただし、通常構造の分析のための精製タンパク質複合体は私達のプロトコルの解析に成功に必要な品質を持っています。

<table><tbody><tr><td>化学薬品、試薬、消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]エタンスルホン酸(HEPES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>緩衝</td></tr><tr><td>液 酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>pH</td></tr><tr><td>アセトニトリルオプティマ LC/MS</td><td>フィッシャーケミカル</td>ズ <td>A955-1</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ遠心デバイス(異なるMWCO)</td><td>ミリポア</td><td>、すなわちUFC500396</td><td>バッファー交換、濃度</td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2706</td><td>ネイティブMS</td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td>ゲル内消化</td></tr><tr><td>アンモニウム溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9859</td><td>pH</td></tr><tr><td>ビス(スルホスクシンイミジル)サブエレート-d0 (BS3-d0)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21590</td><td>架橋剤</td></tr><tr><td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21595</td><td>架橋剤</td></tr><tr><td>ヨウ化セシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203033</td><td>キャリブレーション</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>ゲル内消化</td></tr><tr><td>毛細血管 (1.0 OD &times; 0.78 ID &times; 100 L mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>ネイティブMS</td></tr><tr><td>ジスクシンイミジルサブエレート(DSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21655架</td><td>橋剤</td></tr><tr><td>DL-ジチオスレイトール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545</td><td>ゲル内消化</td></tr><tr><td>DMSO(ジメチルスルホキシド)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>エ</td><td>タノール Fisher Chemicals</td><td>BP2818</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>ギ酸 Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A117-50</td><td>溶媒サプリメント</td></tr><tr><td>インスタントブルークーマシー染色液</td><td></td><td>ゲル電気泳動用</td><td>ISB1L</td>染色液</tr><tr><td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Trisゲル(1 mm、10ウェル)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>NP0323BOX</td><td>ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>I1149</td><td>ゲル内消化</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール、HPLCグレード</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>ズP750717</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>メタノール フィ</td><td>ッシャーケミカル</td>ズ <td>A456-212</td><td>溶媒</td></tr><tr><td>Micro BioSpin 6カラム</td><td>BioRad</td><td>732-6222</td><td>バッファー交換</td></tr><tr><td>NuPAGE 抗酸化</td>剤 <td>invitrogen</td><td>NP0005</td><td>ランニングバッファー、ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS サンプルバッファー (4 回;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0007</td><td>ゲル電気泳動用サンプルローディングバッファー (非還元)</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS ランニングバッファー</td><td>寿命技術</td><td>NP0001</td><td>ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー</td><td>寿命技術</td><td>NP0001</td><td>ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>NuPAGE サンプル還元剤 (10 回;)</td><td>invitrogen</td><td>NP0004</td><td>ゲル電気泳動用還元剤</td></tr><tr><td>PBS - リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>緩衝液</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 染色済み標準タンパク質マーカー</td><td>invitrogen</td><td>LC5925</td><td>ゲル電気泳動用染色済みタンパク質マーカー</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>エタノール沈殿</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン (トリス)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td><td>ゲル内消化</td></tr><tr><td>ビバスピン遠心装置 (異なる MWCO)</td> <td>ザルトリウス</td><td>すなわち VS0101</td><td>バッファー交換、濃縮</td></tr><tr><td>HPLC 用水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-2.5L-M</td><td>溶剤</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 Heraeus Fresco 21、卓上遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>ゲル電気泳動チャンバー Xcell SureLock MiniCell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Gold Coater Quorum Q150R S</td><td>Quorum Technologies Ltd.</td><td>Q150RS</td><td></td></tr><tr><td>ホリゾンタルゲルシェーカー Rotamax 120 T</td><td>Heidolph Instruments</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Q-TOF Ultima 質量分析計、MS Vision 高質量アップグレード</td><td>Waters (Micromass)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>逆相 C18 分析カラム Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td></td></tr><tr><td>逆相C18プレカラム(C18、内径150 mm、孔径2 cm、5 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>164213</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>Fisher Scientifc</td><td>10463989</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac SPD121P真空遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD121DP-230</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー C</td><td>エッペンドルフ</td><td>5382000015</td><td></td></tr>ピン<tr><td>セット AA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z680184-1EA</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機USC-TH、超音波処理浴</td><td>VWR</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>UltiMate Dionex 3000 nano-LCシステム、Q-Exactiveプラスハイブリッド質量分析計(nano-ESIソース)に結合</td><td>Thermo Scientific</td><td>0726030+</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Software, Software Tools, Database search</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascot</td><td>www.matrixscience.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massign</td><td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Micromass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassMatrix</td><td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>Cox, J. Nat. Biotechn.26 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLink</td><td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pXtract conversion tool</td><td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UniDec</td><td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XiNET</td><td>http://crosslinkviewer.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XLinkX</td><td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xQuest</td><td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvis</td><td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

化学架橋と複合体タンパク質複合体の建築を学びそのまま蛋白質の複合体の質量分析法を組み合わせた

Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

タンパク質は、様々 な細胞機能を遂行するフォームのアクティブ ・動的アセンブリへの配位子と対話します。したがって、これらの相互作用の解明です細胞プロセスの理解のための基礎。しかし、多くの蛋白質の複合体は動的アセンブリ、従来構造手法からはアクセスできません。質量分析法はこれらのアセンブリの構造研究に貢献し、特に様々 な質量分析技術の組み合わせの構造配置に貴重な洞察力を提供します。
この記事で述べるアプリケーション、2 つの相補的な質量分析技術の組み合わせ、すなわち質量とネイティブの質量と相まって化学架橋します。化学架橋、化学試薬を用いた近接中のアミノ酸の結合リンクが含まれます。プロテアーゼで消化後、架橋・ ディ ・ ペプチドは、質量分析法による識別され、タンパク質の相互作用部位が発見されます。ネイティブの質量分析法は、質量分析計における気相そのまま蛋白質アセンブリの分析を一方です。タンパク質とリガンドの相互作用と同様、蛋白質の結果を明らかにします。両方の方法は、したがってタンパク質-リガンド アセンブリおよびそれらの組み合わせは以前の研究の強力な証明の構造に関する補足情報を提供します。

タンパク質と錯体形成の構造解析はその機能を理解するため基本的です。質量分析法は、サイズに関係なく興味のほぼすべての複合体に適用することができますや不均一性のサンプル構造の調査にかなり貢献しています。2 つのよ特徴付けられたタンパク質複合体; を使用してプロトコルを例示します。まず、 c. thermophilumと第二に、大腸菌から複雑なヘテロ本 CPS からヘテロ種類 RvB1/B2。
最初に、2 つの複合体のタンパク質成分を同定しました。このため、蛋白質は SDS ページ (図 2) によって分かれていたし、ゲルのバンドがゲルからカットされました。蛋白質のゲルの消化力の後に、ペプチド混合物は液体クロマトグラフィー質量分析法によって分析したペプチドとフラグメントの大衆データベース検索に服従し、。このワークフローに従う我々 は高い自信を持って、すなわち、2 つの複合体のすべての蛋白質の亜単位を識別合理的なペプチドのスコアを持つペプチドの高数 (テーブル 1 のすべてのタンパク質サブユニットの高いシーケンス カバレッジをもたらす観察されました。).
我々 は、ネイティブ質量分析法 (図 3 a) による複雑なそのまま RvB1/B2 を分析しました。質量スペクトルでは、2 つの種、約 8,000 m/zに 1 つずつ、約 11,000-12,000 m/zで別の種を明らかにしました。これらの種の計算の大衆は、6 量体 (RvB1)3(RvB2)3リング (約 310 kDa) と dodecameric ダブル リング (RvB1)6(RvB2)6 (約 620 kDa) に対応します。両方のピーク シリーズは 2 つの細胞集団が表示します。これらは複合体の RvB2 サブユニットを彼タグ付きとタグなしの混合物に属します。RvB1/B2 複雑な結晶構造は36を得られた以前と二重リング (図 3 b) の配置を示しています。ネイティブの質量スペクトルは、したがってそのまま種類の化学量論を確認し、さらに安定したサブ複合体を明らかにします。さらに、共存の個体が識別されます。
RvB1/B2 複合体蛋白質相互作用のサイトを識別するために化学的に BS3 架橋剤と精製の複合体を架橋しました。我々 は最初、最適濃度を決定するための架橋反応中に BS3 の量を滴定。BS3 にはアミンに固有、共有リンク リジン側鎖タンパク質の N 末端が。架橋反応は、SDS ページ (図 2 a) が続いた。非架橋複合体は、RvB1 と RvB2 の両方のサブユニットを示した。BS3 を反応混合物に追加すること、高分子量蛋白質バンドの蛋白質の共有結合連鎖が原因発生します。SDS のゲルは、非架橋タンパク質サブユニットが減少、BS3 の増加する量をもたらす架橋種の高い金額を示しています。ゲルからタンパク質のバンドを切断し、蛋白質の相互作用のサイトを識別するために上記の提供されるプロトコルを後にします。架橋・ ディ ・ ペプチドのスペクトルの例を示す (図 3).スペクトルは、この分子間相互作用を確認する両方のペプチドの y イオン シリーズを示しています。合計で、我々 はサブユニット RvB1 と RvB2 と RvB2 の 2 つのコピー間の 2 つのクロスリンクの間 4 つの架橋を含む 14 の蛋白質の相互作用を得られる (表 2)。架橋 BS3 からの結果は、異なるサブユニット間相互作用と同様に、分子内相互作用を示す相互作用ネットワーク (図 3 D) で視覚化されます。分子内架橋は、RvB1 と RvB2 の両方のサブユニットが、N 末端と C 末端ドメインは近くの方法で折ることをお勧めします。分子内相互作用を同じサブユニットの分子間相互作用からここでは区別できないことに注意してください。2 つのサブユニット間の分子間架橋結合はまた観察されました。、これらの架橋方法を検証する構造で RvB1 と RvB2 の 2 つの分子間架橋を視覚化することができます。他の分子間架橋結合は、結晶構造に含まれていない柔軟なループであります。また同じペプチド配列を含む RvB2 で 2 つのクロスリンクがわかりました。これらの架橋、明確に彼らは同じタンパク質 (図 3 D) の 2 つのコピーから取得する必要があります、分子間に分類されます。架橋実験複合施設内、既存の結晶構造 (図 3 b) も確認できる彼らの構造配置に洞察力を提供する蛋白質の亜単位の中でもタンパク質相互作用部位を明らかにします。
行った 2 番目のタンパク質複合体は、CPS をだった。ネイティブの質量スペクトル (図 4 a) では、6,000 と 12,000 m/zの間の 3 つのタンパク質複合体を明らかにしました。640 kDa の最も大きい複合体は、そのままヘテロ八量体に対応します。小さい体を表す 2 つのサブの複合体;小規模および大規模な CPS サブユニット (160 kDa) とヘテロ テトラマーの各サブユニット (320 kDa) の 2 つのコピーを含むダイマー。これらのサブの複合体蛋白質アセンブリに最初の洞察力を提供します。すなわち、大きく、小さい亜単位は、直接接触 (ヘテロ二量体によって明らかになった) と、四量体二量体 2 つの製品があります。そのまま cps の複雑な構造の配置についての詳細を得るためにヘテロ八量体とヘテロ四量体のタンデム質量分析 (MS/MS) を行った。どちらの場合では、前駆体を示唆しているが、小サブユニット (図 4 b) アセンブリの周辺部にあることから分離した小サブユニット。確かに、小サブユニットは利用可能な結晶構造 (図 4)44周辺です。
BS3 架橋剤を使用して化学架橋も行った。増加する量を使って、CPS のサブユニットの結合の連携が強化されました。タンパク質の消化と前述のペプチドの分析、大サブユニットと小サブユニットの 1 つ架橋内の多くのタンパク質相互作用 (テーブル 2) が得られました。さらに、複雑な RvB1/B2 と同様に、わかったな CPS の大サブユニットの 2 つのコピー間分子間架橋結合 2 つ。これらの架橋結合は、2 つの大サブユニットの C 末端側でお互いに直面して配置します。以前の研究では、我々 はほとんどによって検証大サブユニットの 2 つのコピーのインターフェイスから発する大サブユニットの 3 つの追加操作を識別構造質量と計算モデル35、結晶構造と得られたモデル (図 4および表 2)。これらの相互作用は、大きな 4 つのサブユニットから成る複雑な CPS コアの配置を許可します。しかし、小さく、大きい亜単位間の間サブユニット クロスリンクは認められなかった。利用可能な結晶構造 (図 4) を調べることによって周辺の小サブユニットと大サブユニットから成る複合体の 4 量体のコア間の相互作用の表面はとても小さく、これを説明するかもしれないことが明らかになったサブユニット間相互作用の不在。小サブユニットは容易に小さなバインディング インターフェイスのためほとんど無傷の複合体から解離を示したネイティブの質量分析により確認しています。それにもかかわらず、化学架橋とネイティブの質量分析法を組み合わせた cps の複雑な蛋白質の相互作用を許可の構造配置 (図 4) を推測します。
一緒に取られて、ネイティブの質量分析と化学架橋架橋ペプチドの質量分析による同定と相まっての組み合わせは両方の例の複合体の構造の配置の再構成をことができます。蛋白質の亜単位、例えば相互作用 RvB1 と RvB2 の間または CPS の 4 量体のコア内の配置を明らかにした化学架橋ネイティブ質量無傷の複合体の蛋白質の結果を提供し、流行の subcomplexes。CPS の 2 つのサブユニット間の分子間相互作用が認められなかった化学架橋による場合は、ネイティブの質量分析法は、各大サブユニットが 1 つ小サブユニット (図 4) と対話すること示唆しています。タンデム質量分析は複合体および両方のサブユニット間小さなインターフェイスで小サブユニットの周辺位置を提案しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> 図 1: ネイティブの質量分析および架橋のワークフロー 。両者は相補的な結果を提供します。ネイティブの質量分析法では、結果と相互作用のモジュールを明らかにする、架橋複合体内タンパク質相互作用部位への洞察力を与えます。化学架橋のみとバイナリの相互作用が明らかにすることに注意してください。(A) ネイティブの質量分析の最初のステップはフィルター ユニットまたはゲルろ過カラムを使用して揮発性と水性バッファーにバッファー交換。そのまま蛋白質の複合体の質量は、その化学量論を明らかにします。タンデム質量分析法による実験では, 末梢のサブユニットの関連付けが解除されます。(B) 化学架橋用蛋白質の複合体の架橋試薬と培養です。架橋タンパク質は、ペプチド液体クロマトグラフィー質量分析法による分析はその後に、消化されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> 図 2: SDS-PAGE の架橋 RvB1/B2 (A) および CPS (B) 錯体。(A) 2.5 μ M ゲル レーンあたり RvB1/B2 を読み込みました。BS3 の濃度が変化します。非架橋 RvB1/B2 は約 50 kDa の 2 つの蛋白質の亜単位を示しています。BS3 の添加は、高分子量蛋白質バンドの蛋白質の亜単位の共有結合連鎖を発生します。BS3 の高濃度では、架橋の種の量をアップします。最適な架橋条件が強調表示されている (赤) です。ゲル レーン当たり 10 (B) μ M CPS を読み込みました。大きい (90 kDa) と小 (40 kDa) CPS の亜単位が得られます。BS3 の添加は、高分子量蛋白質バンドの蛋白質の亜単位の共有結合連鎖を発生します。最適な架橋条件が強調表示されている (赤) です。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> 図 3: ネイティブの質量分析法と複雑な RvB1/B2 の化学架橋します。(A) ネイティブの質量スペクトルを明らかに 2 種 RvB1/B2;約 11,000 に 12,000 m/zおよび約 8,000 m/z6 量体リング (RvB1)3(RvB2)3でそのままの種類 (すなわち、(RvB1)6(RvB2)6)。両種は、彼タグ付きとタグなしの RvB2 から生じる 2 つの集団を示します。スペクトルは、35から変更されています。RvB1/B2 の (B) 結晶構造 (PDB ID 4WVY) を示します。RvB1 と RvB2 が交互のサブユニットは 2 つの 6 量体リングを形成します。(C) 架橋・ ディ ・ ペプチドの断片化スペクトル。RvB1 の N 末端だった架橋 RvB1 の K23 と y イオン シリーズ両方のペプチド (赤とシアン) 得られました。(D) 内と間 protein の相互作用 RvB1/B2 複合体で得られました。内相互リンクは赤で示されている inter-cross-links は青で示されます。挿入は、結晶構造 (緑、挿入) で視覚化することができる、RvB1、RvB2 の亜単位の分子間架橋結合 2 つを示しています。2 つの RvB2 コピーから発信された相互作用は、青の点線として表示されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> 図 4: ネイティブの質量と CPS の化学架橋します。(A) CPS ショーのネイティブの質量スペクトル 3 複合体。ヘテロ ダイマー (160 kDa)、ヘテロ四量体 (320 kDa) と、ヘテロ八量体 (640 kDa)。スペクトルは、35から変更されています。(B) 4 量体および本 CPS 複雑な明らかに解離の CPS の小さい亜単位のタンデム質量分析法。Cps (C) 結晶構造 (PDB ID 1BXR) を示します。大きい亜単位は 4 量体のコアを形成、小サブユニットは、複合体の周辺に位置しています。大サブユニットの 2 つのコピー間の分子間架橋結合は (緑) で表示されます。(D) 大小の CPS サブユニットの相互作用。ネイティブの質量は subcomplexes を明らかにしたし、小サブユニットの周辺位置を示唆しています。化学架橋結合は、CPS の 4 量体の核内配置を示しています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
表 1: データベース検索の結果。タンパク質は、液体クロマトグラフィー質量分析法とデータベース検索によって識別されました。タンパク質名受入数、説明とタンパク質質量を与えられています。タンパク質のスコア、タンパク質あたりスペクトルにみられる数観測ペプチド配列の番号が表示されます。マスコット ペプチド スコアの上位 5 つのペプチドは、各蛋白質の亜単位の一覧表示されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
表 2: RvB1/B2 および CPS で観測されたクロスリンク。複合体の架橋残渣の亜単位が与えられます。クロスリンクの種類 (内分子間または) ペプチド配列の重複または以前研究35から明らかになった。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

タンパク質複合体の建築はその機能は欠かせません。様々 な質量分析技術を組み合わせることをそのアセンブリを勉強する強力な証明しました。化学架橋とネイティブの質量分析のためのプロトコルを提供し、これらの相補的な技術が複数のサブユニット蛋白質アセンブリのアーキテクチャを明らかにする方法を示します。

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

架橋と天然質量分析を組み合わせる全体的な目標は、マルチサブユニットタンパク質集合体に関する補完的な構造情報を取得し、その三次元配列の解明に役立てることです。化学架橋とネイティブ質量分析は、組成、結合性、化学量論など、構造生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。複数の手法を組み合わせる主な利点は、1つの手法だけでは得られない補完的な情報が得られることです。私たちのワークフローは、他のタンパク質複合体にも適用できます。塩や組織から精製することも、精製したタンパク質から再構成することもできます。まず、7.5マイクロリットルの4倍単純緩衝液と3マイクロリットルの10倍還元剤を目的のタンパク質複合体に適用します。サンプルを重力の16倍、200倍で1分間スピンダウンします。遠心分離後、サンプルを摂氏70度で10分間加熱します。電気泳動用に4〜12%グラジエントゲルを調製し、そのゲルを電気泳動チャンバーに入れます。予め調製したランニングバッファーを水で20倍に希釈し、電気泳動チャンバーを満たします。次に、内部チャンバーに0.5ミリリットルの抗酸素を追加します。ゲルの最初のキャビティに適切なタンパク質マーカーをロードし、タンパク質サンプルを残りのキャビティにロードします。次に、200ボルトで適切な時間、タンパク質を分離します。タンパク質バンドを染色するには、ゲルをゲル染色ボックスに移し、ゲルを水性のクマシースタンディング溶液で覆います。ゲルを水平ゲルシェーカーで室温で一晩インキュベートします。翌日、染色液を水に置き換えてゲルを脱汚します。ゲルの背景が鮮明になるまで、前の手順を約3〜5回繰り返します。次に、メスを使用して、ゲルから青いクマシー染色によって視覚化されたタンパク質バンドを切り取ります。タンパク質バンドを約1×1ミリリットルの小片に慎重に切ります。次に、タンパク質バンドを水とアセトニトリルで洗います。DTTでジスルフィド結合を減少させ、次にシステイン残基をヨードアセトアミドでアルキル化します。これに続いて、テキストプロトコルに記載されているように、トリプシンでタンパク質を消化します。ペプチドを抽出するには、ゲル片を重炭酸アンモニウムおよびアセトニトリルとインキュベートし、ペプチド含有上清を回収します。その後、ゲル片を5%ギ酸とアセトニトリルとインキュベートし、ペプチド含有上清を回収します。ペプチド含有上清を回収した後、両方の上清を混合し、抽出したペプチドを真空遠心分離機で溶媒を蒸発させて乾燥させます。ペプチドが乾燥したら、20マイクロリットルの2%アセトニトリル溶液と0.1%ギ酸溶液と混合します。ペプチドを超音波処理浴で2〜3分間溶解します。次に、遠心分離機でサンプルを重力の16倍、200倍で30分間スピンダウンします。サンプルをオートサンプラーバイアルに移した後、5マイクロリットルをナノLC-MS/MSシステムに注入し、ペプチド混合物を逆相C18プレカラムにロードして、ペプチドをオンラインで脱塩および濃縮します。サイズ排除スピンカラムから保存バッファーを取り出し、重力の1,000倍、摂氏4度で1分間遠心分離します。フロースルーを廃棄した後、500 マイクロリットルの 200 ミリモル酢酸アンモニウムを加えてカラムを 3 回洗浄し、続いて遠心分離します。遠心分離後、20マイクロリットルのタンパク質サンプルをカラムにロードし、重力の1,000倍、摂氏4度で4分間遠心分離します。次に、事前に準備した金でコーティングされたキャピラリーをキャピラリーホルダーに入れます。針の先端を開き、キャピラリーに1〜4マイクロリットルのタンパク質サンプルを充填します。キャピラリーホルダーを質量分析計のナノエレクトロスプレーソースに接続し、キャピラリーの先端をコーンオリフィスに対して0.5〜1.5センチメートルの位置に配置します。1時間あたり80〜150リットルのナノフローガスを使用してスプレーを開始し、ガスの流れを調整して安定したスプレーを維持します。Q-TOF機器のパラメータとチューニングページを調整します。次に、[Acquire]ボタンをクリックして取得を開始し、できるだけ多くのスキャンを組み合わせて良好な質量スペクトルを取得します。1.43ミリグラムのBS3と100マイクロリットルの水を溶解して、25ミリモルのストック溶液を調製します。次に、BS3をタンパク質複合体に加えます。さまざまな量のBS3を使用して、最適な架橋剤濃度を特定します。反応混合物を摂氏25度でサーモミキサーで1時間インキュベートします。次に、架橋タンパク質のSDSページを4〜12%グラジエントゲルで実行します。ゲルバンドを切断し、前述のようにゲル内消化によってタンパク質を消化します。ゲル内消化からペプチドを取得した後、前述のように液体クロマトグラフィー結合質量分析を行います。ヘテロドデカマーRvB1/B2およびヘテロオクタメ体CPS複合体のすべてのタンパク質サブユニットは、高い信頼性で同定されました。RvB1/RvB2の質量スペクトルは、六量体とドデカメアの二重環に対応する2つの種を明らかにします。RvB1/B2複合体の結晶構造は、二重リングの配置を示しています。RvB1/RvB2複合体にBS3が付加されると、タンパク質の共有結合が引き起こされ、その結果、より高い分子量のタンパク質バンドが生じます。また、BS3の量が増えると、架橋された分子種の量が多くなり、架橋されていないタンパク質サブユニットが減少します。架橋ジペプチドスペクトルは、このタンパク質相互作用を確認する両方のペプチドのYイオンシリーズを示しています。BS3架橋の結果は、分子内相互作用および異なるサブユニット間の相互作用を示す相互作用ネットワークで視覚化されます。CPSのネイティブマススペクトルは、ヘテロ二量体、ヘテロ四量体、およびヘテロオクタマーを示しています。テトラミックCPSとオクタメリックCPSのタンデム質量分析により、小さなCPSサブユニットの解離が明らかになります。BS3架橋剤を用いたCPSの化学的架橋は、大きなCPSサブユニットの2つのコピー間にいくつかの分子内架橋を示しています。結晶構造は、テトラミックコアと周辺の小さなサブユニットとの間の相互作用表面が非常に小さいことを明らかにしており、サブユニット間の相互作用がないことを説明できる可能性があります。一度マスターすれば、適切に実行すれば1週間でワークフローを完了することができます。タンパク質の集合体が複雑すぎるため、データ解析にはさらに時間が必要です。この手順に続いて、計算モデリングを後で実行して、タンパク質複合体の3次元モデルを取得できます。このビデオを見れば、化学架橋実験とネイティブ質量分析実験の方法について十分に理解できるはずです。これらの2つの補完的な手法がタンパク質集合体の構造の解明に役立つまで。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

質量分析は、大規模なタンパク質複合体を分析するための貴重なツールであることが実証されています。このメソッドは、マルチサブユニットのアセンブリの構成、化学量論と全体的なアーキテクチャへの洞察が可能になります。ここで、我々は、構造的な質量分析を実行し、巨大分子構造を特徴づける方法を、順を追って、説明します。...

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

イオンモビリティー質量分析法は、その衝突断面積と質量に基づいて、イオンを分離する新興気相技術です。方法は、タンパク質複合体の全体的なトポロジーと形状の三次元情報を提供します。ここで、我々は、機器設定や最適化、ドリフト時間のキャリブレーション、およびデータ解釈のための基本的な手順を概説する。...

T波イオンモビリティー質量分析：タンパク質複合体解析のための基本的な実験手順

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多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

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ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ...

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

質量分析 (MS) は、高分子アセンブリのダイナミクスと構造調査のための重要なツールとして浮上しています。ここでは、我々 はタンパク質複合体形成とリガンドを尋問する MS ・ ベース ・...

タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

ここでは、小角 x 線散乱 (SAXS) を高分子の構造を表す低解像度の封筒に情報を取得する利用できる方法を提案します。X 線結晶構造解析や核磁気共鳴などの高分解能構造技術と組み合わせて使用すると、小角はマルチ...

小角 x 線散乱による溶液中の高分子の構造研究

ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。これらのリンケージによって安定化された多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元 SDS − PAGE 分析を介して行う。ここで、この方法は、ヒト骨骨肉腫細胞株 dUTPase OS...

非還元 SDS − PAGE 分析と化学的架橋を組み合わせて、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する

マイクロトームを用いて汎用性の高い解起性BN-MSプロトコルを高解像度の複合プロファイリング用に提示する。...

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

質量分析検出を用いてジエチルピロカーボネートベースの共有標識を行うための実験的手順について説明する。ジエチルピロカーボネートは、単に目的のタンパク質またはタンパク質複合体と混合され、溶媒にアクセス可能なアミノ酸残基の修飾につながる。修飾残基は、タンパク質分解と液体クロマトグラフィー/質量分析分析の後に同定することができる。...

質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートとの共有結合標識

本研究は架橋解析と質量分析を組み合わせて多サブユニットタンパク質アセンブリを解析し、その構造の理解を深めます。

化学架橋と複合体タンパク質複合体の建築を学びそのまま蛋白質の複合体の質量分析法を組み合わせた

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