分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

この手順の全体的な目標は、骨髄間質細胞(BMSC)を分離して培養することです。この方法は、前駆細胞に関する骨および脂肪細胞分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、BMSCを比較的迅速で再現性があり、安価な方法で分離できることです。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、テキストだけでは解剖手順を説明するのが難しい場合があるため、便利です。骨採取手順を開始する前に、採取する骨3本につき1.5ミリリットルの微量遠心チューブ1本に100マイクロリットルの骨髄幹細胞培養培地を追加します。また、マイクロ遠心チューブ1本につき200マイクロリットルのピペットチップ1本の端を切り取り、蓋を閉じた状態で各チップが1本のチューブに収まるようにします。

次に、最初の78週齢の安楽死マウスを解剖ボード上の仰臥位に置き、動物に70%エタノールを噴霧します。鉗子を使用して腹部に皮膚のテントを作成し、滅菌解剖はさみを使用して約1センチメートルの皮膚切開を行います。皮膚をはがして下腹部と脚を露出させます。

各股関節の腸骨稜に沿って切開して大腿骨頭を骨盤から分離し、骨盤の正中線を切開して腸骨を分離し、足首の関節の下を切開して足を取り除きます。次に、膝関節を切って脛骨を大腿骨から分離します。次に、糸くずの出ないワイプを使用して、大腿骨、脛骨、腸骨から筋肉を慎重に取り除きます。

すべての骨が収集されたら、サンプルを氷上のPBSに入れ、サンプルを滅菌培養フードに移します。滅菌技術を使用して、各骨の近位端と遠位端の両方で1〜2ミリメートルの切開を行い、その後、マイクロ遠心チューブ内の各改変マイクロピペットチップに3つの骨を配置します。遠心分離によって骨から骨髄を採取し、スピンの終了時に骨髄が各微量遠心チューブの底に完全にペレット化されているかどうかを確認します。

すべての骨髄が採取されると、骨は白く見えます。マイクロピペットの先端と骨を採取チューブから取り外して、バイオセーフティを適切に廃棄してください。骨髄細胞をプレート化するには、まず25ゲージの針を備えた1ミリリットルのシリンジを使用して、ペレットをゆっくりと再懸濁し、凝集体を分解し、サンプルを1つの15ミリリットルの円錐管にプールします。

サンプル500マイクロリットルあたり10ミリリットルの骨髄幹細胞培養培地を追加し、70ミクロンのフィルターで細胞懸濁液を50ミリリットルの円錐管にろ過して、骨片を除去します。計数後、骨髄細胞を新鮮な培地で1平方センチメートル密度あたり10〜6番目の細胞に1回播種し、摂氏37度とCO2の5%で72時間のインキュベーションを行います。3日目に、上清を新しい培地と交換し、その後、細胞が80%から100%の密度に達するまで2日ごとに培地を交換します。

分裂した骨髄細胞集団培養液をプレートするには、1匹のマウスから採取した骨髄細胞を10cmの細胞培養皿に48時間、細胞培養インキュベーター内の新鮮な培地でプレートします。培養2日目に、非接着性造血幹細胞含有上清を除去し、付着性骨髄細胞を乱さずにPBSでプレートを慎重に洗浄します。PBSを0.25%トリプシンに交換します。

摂氏37度で1〜3分後、新鮮な細胞培養液で反応を急冷し、得られた細胞懸濁液中の細胞をカウントします。プレーティングに適した数の細胞を遠心分離し、ペレットを目的のプレーティング密度になるまで十分な新鮮な培養培地に再懸濁します。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに合流するまで置きます。

骨髄幹細胞の骨芽細胞の分化を誘導するには、細胞が肉眼的に観察できる白い石灰化の結節を産生し始めるまで、2日ごとに細胞培養培地を分化培地に交換します。骨髄幹細胞の脂肪細胞分化を誘導するには、コンフルエントな骨髄細胞培養の細胞培養培地を脂肪細胞誘導培地に置き換えます。2日間の培養後、上清を新鮮な脂肪細胞誘導培地に交換し、4日目に脂肪細胞ベース培地に切り替えます。

7日目に、細胞に脂肪滴が蓄積していること、および成熟脂肪細胞と同様の表現型を示すことを確認します。造血幹細胞を破骨細胞に分化させるためには、全骨髄細胞培養または非接着性細胞培養が接着性になったら、細胞培養培地を破骨細胞分化培地に置き換えてください。培地を2日ごとに交換し、破骨細胞が融合して多核細胞を形成するまで、通常は分化の5〜7日目頃に、光学顕微鏡で10倍の倍率で毎日破骨細胞の分化を確認します。

BMSCのコンフルエント培養は、アスコルビン酸とβ-グリセロリン酸からなる骨形成培地を用いて骨芽細胞に分化することができる。分化の数日後、骨芽細胞はアルカリホスファターゼを発現し始めます。そして、さらなる分化がオステオイドマトリックスの生成を引き起こし、最終的にはこのマトリックスの鉱化作用を引き起こします。

興味深いことに、結晶紫色染色によって明らかになったように、in vitroで骨芽細胞に分化する細胞はごく一部です。混合集団を使用する場合も、骨髄細胞集団を分割して使用する場合でも、一部の細胞のみが脂肪細胞に分化し、脂肪細胞は複数の脂質液胞を持つ丸い細胞として現れ、オイルレッドO色素で染色できます。マウス細胞刺激因子とRANKLを添加したヒト幹細胞培養物は、急速に融合して、TRAP陽性の多核細胞を形成します。

これらの破骨細胞は、in vitroでミネラルマトリックスを吸収する能力があり、破骨細胞の活性を評価するために使用できます。このテクニックを習得すると、マウスの数にもよりますが、適切に実行すれば、1時間以内に完了することができます。この手順を試行する際は、可能な限り迅速かつ無菌的に作業できるように、ツールを滅菌し、事前に培地を準備することを忘れないでください。

このビデオを見れば、骨髄間質細胞の単離と培養の方法についてよく理解できるはずです。