Name: 粒子の合成機能 10 nm ポリマー コーティング金対象化、血管内皮細胞とドラッグデリバリー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ、10nmポリマーコーティング金ナノ粒子の合成法。血管内皮細胞への標的化と薬物送達に応用可能な生体適合性ナノ粒子を作製する手法です。TEMと動的光散乱法で特性評価を行います。

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この作品は、ノースイースタン大学化学工学部によって支えられた、スタートアップ資金と東北大学学長オフィスや NIH K01 HL125499 NSF IGERT から層 1 パイロット研究グラント NSF/DGE-096843 を付与します。作者はトマス j. ウェブスターと彼らの支援ナノメディシン科学および技術センター、ノースイースタン大学で薬学教育研究センターの彼の研究室に感謝によってたいです。

1. 準備や原液の調達 (常温保存するまたは使用するまで冷凍)
<ol><li>1 M 水酸化ナトリウム (NaOH) のストック溶液を準備するには、400 mg 室温で 10 mL の純水に水酸化ナトリウムを溶解し、材料をよく混合します。 注: 超純水は、微粒子、細菌、核酸分解酵素、イオン、微量有機物などの不純物のない水として定義されます。浄化システムは、純水、その抵抗率最大 18.2 mΩ·cm、低い陰イオン性汚染を示す結果を取得する使用されます。市販のボトル入りの純水の使用は推奨されません。今後は、この純水に届けられる水として特に指定しない限り。</li>
	<li>6 M NaOH 原液を水 10 mL に水酸化ナトリウムの 2.4 g を溶解することにより準備し、室温でソリューションを格納します。</li>
	<li>乾燥 HAuCl4 10.16 mL の水に 1 g を溶解して塩化金酸 (HAuCl4) の 250 mM の原液を準備します。250 mm HAuCl4 25 mM HAuCl4の作業濃度を取得する 9 mL の水を 1 mL を希釈します。室温で HAuCl4ソリューションを格納します。</li>
	<li>10 mL の水で炭酸水素ナトリウム 84 mg を溶解し、ステップ 1.2 から 6 M NaOH を加えることによって 8.8 pH を調整する ph 8.8, 0.1 M 炭酸バッファーを準備します。常温の炭酸バッファーを格納します。</li>
	<li>ミックス 20 mL テトラゾリウムの化合物、3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium の塩 (MTS)、安定化剤、ethosulfate フェナジン (PES) (材料の表を参照してください)。暗闇の中での-20 ° C で (最大 10 freeze-thaw 周期) のための因数で MTS/PES 混合物を格納します。</li>
</ol>金ナノ粒子のコアの合成
<ol><li>80% の 12 μ L を追加することで薄めた THPC を準備 THPC を室温で遠心管中の水の 1 mL の水の中。</li>
	<li>電磁攪拌プレートの中央に 100 mL の丸底フラスコを保護します。45 mL の水をフラスコに注ぎ、小さな卵型電磁攪拌棒を使用して 300 rpm で水をかき混ぜます。0.5 mL 1 メートル naoh 水溶液の希釈 THPC 溶液 1 mL を追加します。5 分は積極的に反応混合物を攪拌し続けます。</li>
	<li>混合物を攪拌を続行し、25 mM HAuCl4ソリューションの 2 mL を追加します。混合物の色は、数秒以内に、THPC の形成は、負の電荷と金ナノ粒子を上限を示すダークブラウンに黄色から変更されます。金コアの完全な形成を許可する追加の 15 分のための混合物をかき混ぜなさい。</li>
</ol>金ナノ粒子を高分子コロナの追記
<ol><li>2.3 の手順に従って 15 分期間中にペグ ソリューションによって準備 4 mL ガラスバイアルに 1 mL の水で、次のそれぞれの溶解: 30 mg NH2-ペグ-SH。7.5 mg m-ペグ-SH。7.5 mg COOH ペグ SH。 注: 結果として得られる濃度は 8.8 M NH2をする必要があります-ペグ-SH、3.75 M m-ペグ-SH と 3.75 M COOH-ペグ-SH。</li>
	<li>100 rpm を丸底フラスコの溶液の攪拌速度を減らし、THPC のソリューションに PEG 溶液滴下金ナノ粒子の上限を追加します。THPC の効率的な除去やペグが交換できるように、室温で一晩ゆっくり混合物を攪拌し続けます。</li>
	<li>次の 72 h 60 rpm で攪拌水を 4 L バケットに対する撹拌した混合物を dialyze に 12-14 kDa の分子量カットオフ セルロース膜を使用します。透析クリップによって膜の両端を結ぶし、ピペットによるソリューションを転送します。 注: この透析プロセス 12-14 kDa カットオフ膜を削除だけ未反応ペグ、THPC、および他の化学反応によって濃度勾配に沿う拡散です。</li>
	<li>高濃度勾配を維持し、継続的な拡散を促進するため、最初の 6 h の h ごとの 2 と残り 66 時間ごとの 6-12 h 水を変更します。 注: この水変更スケジュールの目的は、サンプル内で最初に高い濃度のために、早い段階で発生する急速な普及に対応するためです。透析プロセス上記葉半精製、ナノ粒子溶液ナノ粒子、沈殿物、集計、および他の大きいサイズの不純物は、12-14 kDa カットオフ膜の細孔を通過できませんので。</li>
	<li>半精製ナノ粒子溶液を 0.2 μ m のシリンジ フィルターを使用して残りの沈殿物、集計、および他の大きいサイズの不純物を削除する、50 mL の円錐管にフィルターします。</li>
	<li>-80 ° C のフリーザーに円錐形の管を配置でき、約 5 時間の凍結する精製ペグインターフェロン AuNP (ペグ AuNP) ソリューション。</li>
	<li>精製ペグ AuNP を凍乾するのに凍結乾燥機を使用します。</li>
	<li>使用するまで 4 ° c の乾燥、精製のペグ AuNP を格納します。</li>
</ol>4. NH2グループに N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステルを用いた PEG AuNP Fluorophores の活用
<ol><li>電磁攪拌プレートの中心に 50 mL の丸底フラスコを保護します。18 mL の水でフラスコを満たすし、卵型電磁攪拌バーを使用して 100 rpm で水をかき混ぜます。</li>
	<li>高精度卓上スケールを使用して 4 つの mL の円錐管に 2 mg 凍結乾燥ペグ AuNP の重量を量る。静電気とチューブ表面にペグ AuNP パウダーの付着を除去するために帯電防止銃を使用します。チューブに 2 mL の水を追加します。2 mL ペグ AuNP ソリューションを 20 mL の水の合計で再建の丸底フラスコに注ぐ。卵型電磁攪拌バーを使用して 100 rpm で混合物を攪拌し続けます。</li>
	<li>炭酸塩の pH 8.8 20 mL の丸底フラスコに含まれる再構成された AuNP のバッファー、0.1 M の 1 mL を追加します。攪拌を続けます。</li>
	<li>ジメチルスルホキシド中 10 mg/mL 蛍光 NHS エステルの 5 μ L を追加します。 注: 任意の蛍光染料は、このプロセスで使用することができます。蛍光のペグを一晩撹拌します。部屋の温度でそれを維持し、箔で覆われています。</li>
	<li>次の 72 h 手順 3.3 で説明したプロトコルを使用して余分な蛍光物質を削除します。簡単に言えば、水と 12-14 kDa の分子量カットオフ セルロース膜の 4 L バケットを使用して攪拌混合物を dialyze します。最初の 6 h 毎 2 h と残り 66 時間毎 6-12 h 水を変更します。</li>
	<li>特性次のセクション 5 で説明するために、精製の蛍光ペグ AuNP 溶液 1 mL を取得します。フリーズし、3.5 3.7 の手順で説明されているように 4 ° C で保存用の粉末状の形で蛍光ナノ粒子を取得する残りの溶液を凍結乾燥します。</li>
	<li>0.2 μ m シリンジ フィルターを使用して、殺菌、細胞培養用再構成一度任意の潜在的な沈殿物を削除します。</li>
</ol>5. 蛍光 peg 化金ナノ粒子のキャラクタリゼーション
<ol><li>金ナノ粒子のコアを視覚化し、サイズを数値化する透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用<ol>
<li>カーボン コート メッシュ TEM グリッドに精製された蛍光ペグ AuNP 液の 10 μ L をドロップします。</li>
		<li>5 分後に慎重にまで PEG 結果を残した蛍光を含むフィルム TEM グリッドの端から離れて余分な液体を放出するのにろ紙の部分を使用します。</li>
		<li>80 で蛍光ペグ金ナノ粒子を表示 kV、50,000-150, 000 の倍率。デジタル写真を撮る。 注: ペグは電子温度に密ではないため金コアのみが表示されます。</li>
		<li>測定ソフトウェアを使用すると、スケール バーの相関関係の計測スケールを設定します。約 20 の金コアの直径を計算し、平均金コア径を決定します。 注: 電子顕微鏡イメージング システムは自動的にデジタル画像のスケール バーを配置します。</li>
	</ol></li>
	<li>動的光散乱法 (DLS) を使用して流体力学的ナノ粒子サイズの測定<ol>
<li>手順 4.2 で説明したアプローチを使用して微量遠心チューブに凍結乾燥 THPC 被覆金ナノ粒子の 1 mg を転送します。別の管内凍結乾燥ペグ AuNP 1 mg を転送します。各管に 1 mL の水を追加し、各 AuNP ソリューションを 1 mL の透明なプラスチックに転送します。</li>
		<li>DLS 音色にキュベットを置き、DL システムに組み込まれている粒子アナライザー ソフトウェアを使用して球状の流体力学的直径を測定します。</li>
		<li>ヒストグラム形式を使用して測定流体力学的直径をプロットします。 メモ: ヒストグラムは、サイズによってナノ粒子をグループ化されます。ナノ粒子の最大のグループはこのプロトコルで合成された金ナノ粒子のサイズに最も近い直径を明らかにします。</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光蛍光確認 注: 同じサンプルと手順 5.2 からのキュベットは、蛍光信号を測定する使用できます。<ol>
<li>DL からのキュベットを削除、挿入、蛍光します。650-800 nm の波長範囲に沿って信号の励起波長 633 nm と読んで放出される蛍光のセット。</li>
		<li>ピークが約 665 であることを確認 nm は、NHS の放出ピークに関連します。 注: によると、プロセスで使用される蛍光体励起と放射の波長を調整します。</li>
	</ol></li>
	<li>MTS は、生体適合性を評価するために11を試金します。<ol>
<li>治療 96 ウェル透明な底無菌培養プレート、ダルベッコ変更イーグル培地の 100 μ L をピペット (DMEM; 10% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを補完) と各ウェルに 10 の3セル × 3.2。 注: この研究では、ラットの脂肪パッドの内皮細胞が使用されます。ウェルズ 21 の合計は、(興味の特定濃度 5.4.3 手順を参照してください) 7 の異なるナノ粒子濃度のそれぞれ 3 複製のために使用されます。</li>
		<li>37 ° C11時 CO2制御インキュベーターの湿度と 5% の confluency に成長する細胞を許可します。</li>
		<li>それぞれ様々 な濃度の微粒子を含む DMEM の 300 μ L を含む個々 の遠心管を準備します。今回次のペグ AuNP 濃度 DMEM の 7 の異なるチューブが必要です: 0 μ g/mL、10 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL、250 μ g/mL、500 μ g/mL、1,000 μ g/mL。</li>
		<li>チューブから DMEM を吸い出しなさい。0、10、50、100、250、500、または AuNP の 1,000 μ g/mL を含む DMEM メディアの 100 μ L で 3 通の井戸を埋めます。</li>
		<li>細胞と共同のインキュベート時間 16 h のためにここの前もって決定された長さにナノ粒子を許可します。</li>
		<li>潜伏期間の終わり、近くステップ 1.5 から MTS/PES の混合物を解凍します。</li>
		<li>インキュベーション後、井戸から中断、緩く接続されているナノ粒子と、DMEM を吸引します。製造元のプロトコルに従って DMEM 比 1:5 の MTS/PES を取得する MTS/PES 溶液 20 μ L と一緒に新鮮な DMEM の 100 μ L を追加します。2 h の 37 ° C で MTS/ペスとセルを孵化させなさい。 注: この 2 h、インキュベーション時間は内皮細胞の代謝活動によって決定され、他の細胞型の 4 h までに増やすことができます。2 h 以内では、MTS は、DMEM にミックス色の塩に内皮細胞によって代謝されます。ペグ AuNP の生体適合性と細胞生存率の可能性より色の塩で実証されます。ペグ AuNP と細胞が死んでいるチャンスの毒性は、あまり強烈な色になります。</li>
		<li>492 吸光度を読み取ることによって各ウェルの比色分析を行うと互換性のあるプレート リーダーの nm。</li>
		<li>それぞれのナノ粒子濃度の帳票の吸光度の値から平均吸光度を計算します。平均吸光度を 0 μ g/mL ナノ粒子を含む井戸の吸光度の平均から取得した値で除算します。 注: 結果が含まれていないこれらの井戸は、他井戸の投与ナノ粒子治療への反応の割合の細胞生存率を計算するためのコントロールとして機能します。</li>
	</ol></li>
	<li>そのまま、または機能不全の糖衣11血管内皮細胞の接着におけるナノ粒子の吸収量の蛍光共焦点顕微鏡による評価<ol>
<li>種子 1.0 × 104セル/cm2ラット脂肪滅菌 12 mm ガラス カバーガラス上血管内皮細胞をパッドし、10% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを DMEM に細胞をフィードします。約 3 日間の湿度と 37 ° C で CO2制御インキュベーターで完全 confluency に成長する細胞を許可します。</li>
		<li>該当する場合、糖衣を修正する治療を追加します。たとえば、2.5 x 10-6 IU ヘパリナーゼ III 酵素による培養内皮細胞の 2 h 治療特にヘパラン硫酸、そのコンポーネントを切断し、糖衣が低下します。 注: 手順 5.5.1 分解酵素の添加なしで内皮細胞を成長することにより健全な糖衣をモデリングできます。</li>
		<li>そのまままたはレンダリング機能不全の内皮の糖衣と 16 時間 550 μ G/ml または他の目的の時間に蛍光金ナノ粒子と内皮細胞をインキュベートします。</li>
		<li>2 ml 37 ° C 1% ウシ血清アルブミン リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 100 mg/L のカルシウムとマグネシウム 100 mg/L を含む) の細胞を優しく洗います。2% パラホルムアルデヒドの 2 mL のセル、pbs は、0.1% グルタルアルデヒドが水没し、室温で 30 分間を修正するセルを許可します。</li>
		<li>アルデヒド固定ソリューションを削除し、3 つの 5 分サイクルの室温 PBS のセルを洗ってください。</li>
		<li>一次抗体のアプリケーションの前に PBS で非特異的結合部位をブロックするために室温で 30 分間の 2% ヤギ血清に内皮細胞を公開します。セルは、ブロッキング液で完全にカバーする必要があります。</li>
		<li>血管内皮細胞の一晩 1% 尖端のヘパラン硫酸コンポーネントのラベルに 4 ° C で PBS で 2% ヤギ血清中抗ヘパラン硫酸一次抗体を孵化させなさい。固定セルを完全に抗体溶液と接触していることを確認します。</li>
		<li>次の日を 3 つの 10 分サイクルの室温 PBS で抗体を洗います。</li>
		<li>縮尺暗いまたはアルミ箔で覆われて、室温で 30 分間の適切な蛍光抗体の希釈で内皮細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>3 つの 10 分サイクルの PBS の室温の二次抗体を洗い流します。</li>
		<li>耐フェード取付の媒体含んでいる 4', 6-diamidino-2-phenylindole、核染色 (DAPI) 二塩酸塩を使用して顕微鏡スライド上に coverslip をマウントします。マニキュアを使用してカバーガラスのエッジをシールします。</li>
		<li>蛍光 immunostained 内皮細胞の画像は、共焦点顕微鏡、それぞれ核、ヘパラン硫酸糖衣、ナノ粒子を視覚化する青、緑と遠赤のチャンネルを使用してサンプルします。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

この手法は、カスタマイズ可能な極小 PEG 被覆金ナノ粒子を合成する効果的な方法です。この手順の重要な部分は THPC の初期形成頂いた金ナノ粒子は、黄色から褐色を色の変化で確認することができますが HAuCl4 を丸底フラスコ (プロトコル手順 2.3) の内容を追加した後に発生します。色の変化は、ナノ粒子形成がないこと、最初の手順のチェックし進む前に繰り返されるべきであることを示しません。色はワインレッドやグレーなどブラウン以外に変更する場合、ターゲット 2.5 nm の周り、パーティクルはできません可能性があります、新しいバッチはもすべきであります。
ゴールドの核の形成、ペグの精製の手順 THPC の交換プロトコルを正常に完了にいくつか重要なステップを格納します。一晩混合置換反応を完了することができます。失敗した浄化は、透析水が所定の頻度で変更されていない場合に発生する可能性が。集計および粒子の沈殿物はできる粒子が 72 時間以上の透析に残っている場合にも発生します。他の潜在的な問題は、凍結乾燥中に観察できます。極小 PEG 被覆 AuNP ソリューションが完全に凍結されていない場合、または、エアカーテンが正しくセットアップされていない場合は、サンプルが失われる可能性があります。いくつかの機器が異なるサンプル準備を必要とは、エアカーテンのマニュアルを参照してください。
合成の容易さと結果として得られる粒子の生体適合性は、これらのペグ-金ナノ粒子を使用してのための利点を表しています。さらに、これらのナノ粒子には、これらのナノ粒子の通風管によって劣化した糖衣を識別する機能によって示されるようにナノスケール細胞構造と対話することができるという利点があります。この利点は、新しい動脈硬化の治療法と予防対策の開発に活用できます。を超えて何を提案するここでは、このプロトコルの別の利点は、それ粒子の広範なカスタマイズを可能し同様4金ナノ粒子上に PEG を含むチオールをアタッチすることにより安定性とストレージの機能を増加します。PEG 鎖のもう一方の端は、機能グループに含めることができ、無数の分子はそれらのグループに共役することができます。このプロトコルを接続するすべての一般的な機能グループ 3 (メチル、カルボキシル基、アミノ酸と)。止め釘の比率は蛍光検出を最初に、優先順位を選択し、カルボン酸基を使用してセカンダリ ・ ターゲット部位を組み込む能力。これらのグループの比率はアプリケーションに基づいて調整できます、長さ・ ポリマーの形状は、同様に調整することができます。
粒子の吸収を測定するには、機能グループの 1 つに蛍光プローブを共役系。それは、記述したものを超えて任意の共役は、ナノ粒子の表面特性の変化になります注意してください。追加のコンポーネントおよび抱合反応に関するナノ粒子の各反復は、目的のプロパティのテスト必要があります。
このメソッドは、従来サイズのナノ粒子の取り込みを阻害する内皮細胞の糖衣の防御特性を克服するために意図して極小の金ナノ粒子を生成します。ただし、小さいサイズは、イメージングと薬の側面の読み込みの両方の難しさに貸します。これらの粒子は典型的なナノ粒子サイズの範囲よりも大幅に小さく、結果として治療と鎖を対象の添付ファイルの使用可能な表面領域が大幅減少します。これは難易度共焦点画像のように粒子のクラスターは、容易に識別することができますはまだがのイメージング アプリケーション、個々 の信号を拾うにつながる可能性があります。配位子と治療対象の添付ファイルの面の縮小は、目標投与量の要件を達成するために管理する多くの粒子を必要があります。尖端を考慮したとき、小さい粒子はより効率的な配信になります。
これら新規の微小粒子が困難に配信できる、微小環境の最小限の中断で体内のナノスケール領域に到達します。ペグの追加増加した生体適合性は、多様なアプリケーションに粒子の重いカスタマイズ機能群を提供しています。いくつかの欠点が付属して典型的なナノ粒子と比較して小さいサイズが微小粒子は、血管の複雑なおよび壊れやすい糖衣に侵入することは困難の宿泊施設に有望なアプローチで戦略的に開発されている場合ターゲットおよび薬剤配達。

ナノ粒子が適用された薬剤配達およびイメージ投射金利1,2のターゲット地域に到達する体をナビゲートする機能のために。粒子は漏れの血管を介して腫瘍内に蓄積、ターゲット リガンドは過剰に発現して、露出をローカライズします。具体的には、金は、輸送と治療3のリリースに影響を与えるユニークな化学的および物理的特性のために一般的に使用されるナノ粒子材料をなっています。金は、効果的なナノ材料は、その表面をチオールにバインドする変更できるためで、その低毒性4高生体適合性。大きな生体分子薬のキャリアであることの結果、2、4をターゲットにも良好な結果を許可するペプチド、核酸や蛋白質を提供することに成功しています。
残念ながら、ナノ粒子薬配信の効果は、ほとんどの哺乳類の細胞の膜に細胞外のコートと細孔径最大 7 nm5,6負荷電の糖衣によって妨げられています。この細孔径は 50-200 nm に至る典型的な直径を持っている、ほとんどのナノ粒子薬物キャリアより小さいです。病気の条件の下でこれらの糖衣の毛穴は劣化、を介して血管内皮細胞への透過性の増加のため大きくなります。ただし、ほとんどのナノ粒子が大きすぎてこの構造変化を尖端で活用するまだです。このサイズの不一致の 1 つの含意は、従来サイズの粒子が、ラインの血管内皮細胞と好意的対話しないことです。これは、内皮細胞への静脈内投与された粒子の配信に影響を与えるし、血液脳関門7,8,9,10による粒子輸送のも言えます。
この問題に対処する方法の 1 つは、尖端に小さな孔を通過する小さな粒子を利用することです。ここでは、10.5 nm 極細金ナノ粒子、通常そのままで、健康な糖衣で阻止されるべきであるこれを合成します。尖端開始される危険にさらされると、ナノ粒子は細胞間隙の増加のサイズを簡単に貫通すべき。本プロトコルの詳細を PEG で、生体適合性を向上し、減少全身クリアランス4コーティング極小ゴールド コアの合成。ペグには、機能グループのいくつかの種類を含めることができますも配位子、蛍光物質、およびその治療の活用のための道を開きます。以前出版された結果は、これらの微小ナノ粒子が取り上げられるもっと好意的中断内皮糖衣関数の地域でアクティブな4,11をターゲットがなくても傾向があることを示します。これは、可能性と配信アプリケーションの正しいサイズの粒子を活用の重要性を示します。次のプロトコルは、仕立ての官能基と他のアプリケーションのための動詞のための議論と、合成、精製、PEG 被覆金ナノ粒子 (ペグ AuNP) の特性を示します。

<table><tbody><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>金(III)塩化三水和物(HAuCl<サブ>4</サブ>.3H<サブ>2</サブ>O)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S5761</td><td></td></tr>テ<tr><td>トラキス(ヒドロキシメチル)塩化ホスフニウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>404861</td><td></td></tr><tr><td>単官能mPEG-チオール</td><td>レイソンバイオ(株)</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td>Mw:2,000 Da</td></tr><tr><td>のヘテロ二機能アニメ-PEG-チオール</td><td>レイソンバイオ株式会社</td><td>NH2-PEG-SH-3400-1g</td><td>Mw:3,400 Da</td></tr><tr><td>カルボキシメチル-PEG-チオール</td><td>レイソンバイオ株式会社</td><td>CM-PEG-SH-2000-1g</td><td>Mw:2,000 Da</td></tr>セル<tr><td>ロース透析膜(12-14 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9777</td><td></td></tr><tr><td>Zerostat帯電防止装置</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z108812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647(AF647)カルボン酸スクシンイミジルエステル</td><td>Fisher</td><td>A20006</td><td>Fluorophore</td></tr><tr><td>Fisherbrand定性的グレードプレーンフィルターペーパーサークル-P5グレード</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-801-B</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>JEOL USA</td><td>JEOL JEM-1000</td><td>TEM</td></tr><tr><td>動的光散乱</td><td>ブルックヘブン・インスツルメンツ・コーポレーション ブルックヘブン・インスツルメンツ・コーポレーション</td><td>ブルックヘブン 90 プラス 粒度分布分析装置</td><td>DLS</td></tr><tr><td>蛍光光度計</td><td>堀場製作所 サイエンティフィック</td><td>・ジョビン イヴォン・フルロマックス 4</td><td>蛍光光度計</td></tr><tr><td>セルタイター 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>MTS</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M4</td><td>プレートリーダー</td></tr><tr><td>10E4 エピトープ HS マウスモノクローナル IgM 抗体 (一次抗体)</td><td>Amsbio</td><td>370255</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (二次抗体)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R37120</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 封入剤DAPI</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1000</td>と<td>DAPI</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td>カール<td>ツァイスメディテックスAG</td><td>ツァイスLSM 700</td><td>コンフォコール顕微鏡</td></tr></tbody></table>

粒子の合成機能 10 nm ポリマー コーティング金対象化、血管内皮細胞とドラッグデリバリー

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

金ナノ粒子 (結果) は、サイズ、生体適合性、および変更可能な表面のための医学研究で広く使用されています。特定のターゲットおよび薬剤配達は、これらの結果が、内皮細胞の細胞外マトリックスの防御的な特性を妨げる粒子取り込みのアプリケーションの一部です。この問題を解決するには、カスタマイズ可能な官能基とポリマー長さ調整でさらに血管の配信を改善するために極小の金ナノ粒子の合成方法をについて説明します。プロトコル収量 2.5 nm の金ナノ粒子テトラキス (ヒドロキシメチル) ホスホニウム塩塩化物 (THPC) とキャップをしています。ヘテロ機能ポリエチレング リコール (PEG)、AuNP の表面と THPC の交換が増加 10.5 に流体力学的半径表面にさまざまな官能基を提供しながら nm。プロトコルの最後の部分には、金ナノ粒子蛍光ナノ粒子の摂取量を追跡するための下で可視化することを許可する fluorophore のオプション追加が含まれています。透析および凍結乾燥は、浄化し、金ナノ粒子を分離する使用されました。これらの蛍光ナノ粒子を可視化することができますペグ コーティングと蛍光をプローブ両方in vitroとin vivoの実験、生体適合性のために。さらに、これらのナノ粒子のサイズの範囲をレンダリングそれら理想的な候補デリバリー改善と治療につながる可能性があります通常の血管機能を中断させることがなく、糖衣をプロービングのため。

THPC または PEG 被覆合成の結果 (図 1 aと図 1 b、それぞれ)、TEM と粒子サイズは適切なナノ粒子径分布を確保するため TEM および DLS を使用して測定されます。図 2 THPC AuNP サンプルの TEM 像を示しています 80 kV と 150,000 倍の倍率。2-3 nm、TEM 画像で校正バーから THPC AuNP 粒子範囲の直径。この THPC AuNP サイズは明らかにも 2.5 でピークを持っている示されて AuNP は、THPC をコーティングで DL サイズ測定ヒストグラム図 2に示すように、nm。ポリマーは電子密度の高いではないと、peg 修飾操作は電子顕微鏡下で表示されません。ペグ AuNP サンプルの TEM イメージ投射は単にナノ粒子の周りペグ高分子コロナ支援凝集の防止が期待されている個々 の分散粒子の存在を確認します。これらのペグ AuNP サンプル DL サイズ測定ヒストグラムは、約 10.5 に、ピークのシフトを示しています。 DL の nm。それ以上の配位子や官能に薬物の添付ファイルは、同様に、ナノ粒子のサイズに影響を与える、直径を測定するとき考慮に入れする必要があります。
Fluorophore また (図 1) を図 3に示すように、ナノ粒子のサンプルからの蛍光信号を測定するため、蛍光光度計を用いて確認しました。633 の波長で励起されると最大 660 672 nm 665 における最大排出量のメーカーの製品情報に一致する間に nm、発光を測定 nm。その他の蛍光プローブの添付ファイルは、蛍光応答を確保するため同様の方法でチェックしなければなりません。
粒子と関連セル実行可能性の生体適合性を評価するには、MTS の試金を使用してナノ粒子の様々 な濃度で 16 時間培養後 MTS の相対的な細胞の代謝をチェックします。蛍光体共役 peg 化金ナノ粒子を示しています重要な毒性同様 1 mg/mL (図 4 a) までの全ての濃度で細胞生存率のレベルによって示される。この生体適合性は、治療または粒子をさらにカスタマイズする残りの機能グループに接続されている配位子により異なります。薬剤添付は毒性を増加する傾向が作業濃度に応じてそれない活力に影響重要な方法で。
蛍光灯、peg 化金ナノ粒子 (図 1) 付着性のセルでの取り込みは、そのまま、または機能不全の糖衣 (図 4 b) 培養ラットの脂肪パッドの内皮細胞を用いた評価されます。機能不全の糖衣の条件は、文化をヘパリナーゼ III 酵素を追加、ヘパラン硫酸糖衣部品の劣化の結果および行列12を損なうことによって達成されます。図 4 bは、代表的な血管内皮細胞の断面図の赤い点としてペグ-金ナノ粒子の取り込みのさまざまなレベルを示しています。健康な糖衣を躊躇させるこれらの金ナノ粒子の取り込みが、酵素が雇われた11の大幅な増加が観察されます。この結果は、糖衣健康に基づく明確な相互作用によって制御される方法で血管内皮細胞に治療を提供するこれらの微小粒子の可能性を強調表示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig1.jpg"> 図 1: 金ナノ粒子概略図。(A) THPC ペグ交換前に、AuNP ナノ粒子のコーティングします。(B) ペグ AuNP ペグ終了、COOH、NH2CH3などの 3 種類。青い波は、ポリマーを表しています。(C) 蛍光イメージングのためのナノ粒子を共役します。赤い星は、NH2官能に共役 fluorophores が付いてを表示します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig2.jpg"> 図 2: 金ナノ粒子の測定のサイズします。左: 80 で PEG 添加する前に金ナノ粒子の TEM kV とのスケールバーで 150,000 の倍の倍率。右: ナノ粒子サイズのヒストグラムを用いて (AuNP) 前に DL とペグと (ペグ-AuNP)、THPC 交換後。THPC コーティング AuNP の DLS 結果を定量化何が電子顕微鏡で可視化しました。DLS PEG 被覆 AuNP 結果は、高密度電子されていないポリマーによる TEM による釘を見ることができないの課題を克服します。TEM の PEG-AuNP コア金ナノ粒子のみが表示され、THPC 頂いた AuNP と同じになります。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig3.jpg"> 図 3: 蛍光ペグ AuNP の蛍光データ。蛍光体の発光共役ペグ AuNP に 667 の nm 試合で蛍光ピーク。A.U.: 任意の単位。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56760/56760fig4.jpg"> 図 4: 細胞の蛍光ペグ AuNP と相互作用します。(A) ラット脂肪細胞生存率 (MTS 代謝) プロット蛍光ペグ AuNP 16 h 共培養後の血管内皮細胞のパッドします。(B) 固定ラット脂肪の断面画像はパッド染色 DAPI 核 (青) とヘパラン硫酸は、糖衣コンポーネント (緑) に対する抗体の血管内皮細胞です。トップ画像は健全な糖衣と底が劣化した糖衣層;劣化した糖衣とサンプルではナノ粒子から赤い蛍光性大幅に多くがあります。スケール バーは、10 μ m<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56760/56760fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。

修飾表面にポリ エチレング リコールのコーティングによる生体適合性の 10 nm 金微粒子の合成法について述べる。生体外で使用することができますこれらの粒子と生体内でナノスケール細胞および細胞外スペースに治療を提供するため従来のナノ粒子のサイズとアクセスしにくい。

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

この手順の全体的な目標は、直径10ナノメートルで生体適合性があり、循環時間が長く、蛍光顕微鏡でイメージングできる官能基化されたポリマー被覆金ナノスフィアを合成することです。この方法は、疾患条件下での内皮透過性に関する心臓病学の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、さらなるカスタマイズに利用できる官能基を持つ生体適合性の超小型粒子を作成することです。まず、マイクロ遠心チューブで、80%THPCの12マイクロリットルを1ミリリットルの超純水で希釈します。100ミリリットルの丸底フラスコを磁気攪拌板に掛けます。フラスコに45ミリリットルの水と小さな卵形の攪拌棒を加えます。300RPMで水を攪拌し始めます。フラスコに0.5ミリリットルの1モルの水酸化ナトリウム溶液と1ミリリットルの希薄なTHPC溶液を加えます。反応混合物を5分間激しく攪拌し続けます。次に、攪拌しながら反応混合物に2ミリリットルの25ミリリットルのクロロアウリン酸溶液を加えます。黄色の反応混合物が数秒以内に暗褐色になることを確認し、THPCキャップされた負に帯電した金ナノ粒子の形成を示しています。混合物を15分間攪拌し続けます。混合物を攪拌しながら、ヘテロ二官能性アミンPEGチオール、カルボキシメチルPEGチオール、および単官能メトキシPEGチオールの水溶液を調製します。金ナノ粒子反応混合物を15分間撹拌したら、攪拌速度を100RPMに下げます。攪拌しながら、PEG溶液を混合物に滴下します。室温で一晩中混合物を穏やかに攪拌し続けます。次に、12〜14キロダルトンのMWCOセルロースメンブレンの一端を透析クリップで閉じます。ピペットを使用して、反応混合物をメンブレンに移します。メンブレンのもう一方の端を2番目の透析クリップで閉じます。ナノ粒子混合物を4リットルの水に対して60RPMで72時間透析します。最初の6時間は2時間ごとに、その後は6〜12時間ごとに水を交換してください。次に、半精製したペグ化金ナノ粒子混合物を0.2マイクロメートルのシリンジフィルターでろ過し、50ミリリットルの円錐管に入れます。精製したナノ粒子溶液をマイナス80°Cで約5時間凍結します。精製したナノ粒子を凍結乾燥機で凍結乾燥します。蛍光PEG化金ナノ粒子の調製を開始するには、100ミリリットルの丸底フラスコを磁気攪拌板にかぶせます。フラスコに18ミリリットルの超純水と小さな卵形の攪拌棒を加え、100RPMで攪拌を開始します。4ミリリットルの円錐管に、2ミリグラムの凍結乾燥ペグ化金ナノ粒子と2ミリリットルの水を組み合わせる。次に、ナノ粒子溶液を丸底フラスコに移し、さらに再構成します。撹拌しながら、再構成したナノ粒子にpH 8.8、0.1モルの炭酸塩緩衝液1ミリリットルを加えます。次に、ジメチルスルホキシド中の蛍光無水キシスクシンイミドエステルの10ミリグラム/ミリリットル溶液の5マイクロリットルを追加します。フラスコをホイルで包んで、光を完全に遮断します。蛍光ナノ粒子混合物を室温で一晩撹拌し続けます。次いで、ペグ化金ナノ粒子の調製に記載の手順を用いて、混合物を4リットルの水に対して72時間透析する。透析中は、容器をホイルで覆ったままにしてください。精製された蛍光ペグ化ナノ粒子を1ミリリットル、特性評価のために取っておきます。残りの蛍光ナノ粒子を凍結、凍結乾燥、摂氏4度で保存します。透過型電子顕微鏡で金ナノ粒子コアを可視化するには、まず精製した蛍光ナノ粒子溶液10マイクロリットルをカーボンコーティングされたメッシュTEMグリッド上に置きます。ドロップを5分間放置します。次に、濾紙を使用して、蛍光ナノ粒子のフィルムのみがグリッド上に残るまで、TEMグリッドの端から余分な液体を慎重に吸い取ります。ナノ粒子を80キロボルトで、倍率50, 000〜150, 000で画像化します。流体力学的ナノ粒子サイズを測定するには、凍結乾燥THPC被覆金ナノ粒子1ミリグラムをマイクロ遠心チューブに入れます。各チューブに1ミリリットルの水を加え、溶液を1ミリリットルの透明なプラスチックキュベットに移します。動的光散乱で各溶液を評価し、粒子の球状流体力学的直径を測定します。次に、蛍光ペグ化金ナノ粒子を含むキュベットを分光蛍光光度計に移します。エキサイテーション波長を633ナノメートルに設定し、650〜800ナノメートルの発光信号を読み取ります。次に、7ナノ粒子濃度での生体適合性を評価するために、まず、DMEM中のラット脂肪パッド内皮細胞懸濁液100マイクロリットルを、96ウェルクリアボトム無菌組織培養処理プレートの21ウェルのそれぞれにピペットで注入する。コンフルエンシーが達成されるまで細胞をインキュベートし、その後、DMEM中の蛍光ナノ粒子の7つの溶液を、1ミリリットルあたり0〜1000マイクログラムの範囲の濃度で取得します。井戸からDMEMを吸引します。7つのナノ粒子溶液のそれぞれ100マイクロリットルを、別々のウェルのそれぞれに三重に置きます。細胞とナノ粒子を16時間共インキュベートします。次に、DMEMを吸引し、ウェルから懸濁または緩く付着したナノ粒子を吸引します。各ウェルに20マイクロリットルのMTS/PES溶液を含む100マイクロリットルの新鮮なDMEMを追加します。細胞を摂氏37度で2時間インキュベートします。次に、プレートリーダーで492ナノメートルのクロロメトリー分析により、細胞の生存率を評価します。次に、種子ラット脂肪パッド内皮細胞を無菌の12ミリリットルガラスカバーに1平方センチメートルあたり10, 000細胞でスリップします。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEMを細胞に供給する。完全なコンフルエントが達成されるまで細胞をインキュベートします。必要に応じて内皮グリコカリックスを改変し、次いで、550マイクログラム/ミリリットルの蛍光金ナノ粒子で細胞を16時間インキュベートする。免疫蛍光顕微鏡法用の細胞を調製します。各カバースリップを、DAPIを含む退色防止封入剤を使用した顕微鏡スライドに取り付けます。カバーのスリップエッジをマニキュアで密封します。免疫染色した内皮細胞を共焦点顕微鏡でイメージングします。核、ヘパリン硫酸グリコカリックス、ナノ粒子をそれぞれ青、緑、遠赤のチャネルで可視化します。THPC被覆金ナノ粒子のTEMは、2〜3ナノメートルの粒子径を示した。PEGはTEM画像に見えないため、PEGは分散粒子の存在を確認するだけでした。THPCコーティングおよびペグ化ナノ粒子のDLSは、ピーク粒子径が2.5ナノメートルから10.5ナノメートルにシフトしたことを示しました。蛍光発光は、633ナノメートルの光で励起されたときの最大660ナノメートルから672ナノメートルの間で、これは、使用した蛍光プローブの665ナノメートルで予想される最大発光と一致していました。ラット脂肪パッド内皮細胞は、1ミリグラムあたり最大1ミリグラムの濃度の蛍光ペゴル化金ナノ粒子と16時間共インキュベートした後、同程度の生存率を示し、ナノ粒子による有意な毒性は示されませんでした。健康なグリコカリックスを持つラット脂肪パッド内皮細胞へのナノ粒子の取り込みは最小限で観察されました。グリコカリックスが分解された細胞では、ナノ粒子からの赤色蛍光シグナルの増加が示すように、有意に高い取り込みが見られました。この手順に続いて、開放性官能基への結合などのさらなる修飾を行い、内皮成分の特異的な標的化または薬物の送達のために粒子を修飾することができる。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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