粒子の合成機能 10 nm ポリマー コーティング金対象化、血管内皮細胞とドラッグデリバリー

この手順の全体的な目標は、直径10ナノメートルで生体適合性があり、循環時間が長く、蛍光顕微鏡でイメージングできる官能基化されたポリマー被覆金ナノスフィアを合成することです。この方法は、疾患条件下での内皮透過性に関する心臓病学の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、さらなるカスタマイズに利用できる官能基を持つ生体適合性の超小型粒子を作成することです。

まず、マイクロ遠心チューブで、80%THPCの12マイクロリットルを1ミリリットルの超純水で希釈します。100ミリリットルの丸底フラスコを磁気攪拌板に掛けます。フラスコに45ミリリットルの水と小さな卵形の攪拌棒を加えます。

300RPMで水を攪拌し始めます。フラスコに0.5ミリリットルの1モルの水酸化ナトリウム溶液と1ミリリットルの希薄なTHPC溶液を加えます。反応混合物を5分間激しく攪拌し続けます。

次に、攪拌しながら反応混合物に2ミリリットルの25ミリリットルのクロロアウリン酸溶液を加えます。黄色の反応混合物が数秒以内に暗褐色になることを確認し、THPCキャップされた負に帯電した金ナノ粒子の形成を示しています。混合物を15分間攪拌し続けます。

混合物を攪拌しながら、ヘテロ二官能性アミンPEGチオール、カルボキシメチルPEGチオール、および単官能メトキシPEGチオールの水溶液を調製します。金ナノ粒子反応混合物を15分間撹拌したら、攪拌速度を100RPMに下げます。攪拌しながら、PEG溶液を混合物に滴下します。

室温で一晩中混合物を穏やかに攪拌し続けます。次に、12〜14キロダルトンのMWCOセルロースメンブレンの一端を透析クリップで閉じます。ピペットを使用して、反応混合物をメンブレンに移します。

メンブレンのもう一方の端を2番目の透析クリップで閉じます。ナノ粒子混合物を4リットルの水に対して60RPMで72時間透析します。最初の6時間は2時間ごとに、その後は6〜12時間ごとに水を交換してください。

次に、半精製したペグ化金ナノ粒子混合物を0.2マイクロメートルのシリンジフィルターでろ過し、50ミリリットルの円錐管に入れます。精製したナノ粒子溶液をマイナス80°Cで約5時間凍結します。精製したナノ粒子を凍結乾燥機で凍結乾燥します。

蛍光PEG化金ナノ粒子の調製を開始するには、100ミリリットルの丸底フラスコを磁気攪拌板にかぶせます。フラスコに18ミリリットルの超純水と小さな卵形の攪拌棒を加え、100RPMで攪拌を開始します。4ミリリットルの円錐管に、2ミリグラムの凍結乾燥ペグ化金ナノ粒子と2ミリリットルの水を組み合わせる。

次に、ナノ粒子溶液を丸底フラスコに移し、さらに再構成します。撹拌しながら、再構成したナノ粒子にpH 8.8、0.1モルの炭酸塩緩衝液1ミリリットルを加えます。次に、ジメチルスルホキシド中の蛍光無水キシスクシンイミドエステルの10ミリグラム/ミリリットル溶液の5マイクロリットルを追加します。

フラスコをホイルで包んで、光を完全に遮断します。蛍光ナノ粒子混合物を室温で一晩撹拌し続けます。次いで、ペグ化金ナノ粒子の調製に記載の手順を用いて、混合物を4リットルの水に対して72時間透析する。

透析中は、容器をホイルで覆ったままにしてください。精製された蛍光ペグ化ナノ粒子を1ミリリットル、特性評価のために取っておきます。残りの蛍光ナノ粒子を凍結、凍結乾燥、摂氏4度で保存します。

透過型電子顕微鏡で金ナノ粒子コアを可視化するには、まず精製した蛍光ナノ粒子溶液10マイクロリットルをカーボンコーティングされたメッシュTEMグリッド上に置きます。ドロップを5分間放置します。次に、濾紙を使用して、蛍光ナノ粒子のフィルムのみがグリッド上に残るまで、TEMグリッドの端から余分な液体を慎重に吸い取ります。

ナノ粒子を80キロボルトで、倍率50, 000〜150, 000で画像化します。流体力学的ナノ粒子サイズを測定するには、凍結乾燥THPC被覆金ナノ粒子1ミリグラムをマイクロ遠心チューブに入れます。各チューブに1ミリリットルの水を加え、溶液を1ミリリットルの透明なプラスチックキュベットに移します。

動的光散乱で各溶液を評価し、粒子の球状流体力学的直径を測定します。次に、蛍光ペグ化金ナノ粒子を含むキュベットを分光蛍光光度計に移します。エキサイテーション波長を633ナノメートルに設定し、650〜800ナノメートルの発光信号を読み取ります。

次に、7ナノ粒子濃度での生体適合性を評価するために、まず、DMEM中のラット脂肪パッド内皮細胞懸濁液100マイクロリットルを、96ウェルクリアボトム無菌組織培養処理プレートの21ウェルのそれぞれにピペットで注入する。コンフルエンシーが達成されるまで細胞をインキュベートし、その後、DMEM中の蛍光ナノ粒子の7つの溶液を、1ミリリットルあたり0〜1000マイクログラムの範囲の濃度で取得します。井戸からDMEMを吸引します。

7つのナノ粒子溶液のそれぞれ100マイクロリットルを、別々のウェルのそれぞれに三重に置きます。細胞とナノ粒子を16時間共インキュベートします。次に、DMEMを吸引し、ウェルから懸濁または緩く付着したナノ粒子を吸引します。

各ウェルに20マイクロリットルのMTS/PES溶液を含む100マイクロリットルの新鮮なDMEMを追加します。細胞を摂氏37度で2時間インキュベートします。次に、プレートリーダーで492ナノメートルのクロロメトリー分析により、細胞の生存率を評価します。

次に、種子ラット脂肪パッド内皮細胞を無菌の12ミリリットルガラスカバーに1平方センチメートルあたり10, 000細胞でスリップします。10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEMを細胞に供給する。完全なコンフルエントが達成されるまで細胞をインキュベートします。

必要に応じて内皮グリコカリックスを改変し、次いで、550マイクログラム/ミリリットルの蛍光金ナノ粒子で細胞を16時間インキュベートする。免疫蛍光顕微鏡法用の細胞を調製します。各カバースリップを、DAPIを含む退色防止封入剤を使用した顕微鏡スライドに取り付けます。

カバーのスリップエッジをマニキュアで密封します。免疫染色した内皮細胞を共焦点顕微鏡でイメージングします。核、ヘパリン硫酸グリコカリックス、ナノ粒子をそれぞれ青、緑、遠赤のチャネルで可視化します。

THPC被覆金ナノ粒子のTEMは、2〜3ナノメートルの粒子径を示した。PEGはTEM画像に見えないため、PEGは分散粒子の存在を確認するだけでした。THPCコーティングおよびペグ化ナノ粒子のDLSは、ピーク粒子径が2.5ナノメートルから10.5ナノメートルにシフトしたことを示しました。

蛍光発光は、633ナノメートルの光で励起されたときの最大660ナノメートルから672ナノメートルの間で、これは、使用した蛍光プローブの665ナノメートルで予想される最大発光と一致していました。ラット脂肪パッド内皮細胞は、1ミリグラムあたり最大1ミリグラムの濃度の蛍光ペゴル化金ナノ粒子と16時間共インキュベートした後、同程度の生存率を示し、ナノ粒子による有意な毒性は示されませんでした。健康なグリコカリックスを持つラット脂肪パッド内皮細胞へのナノ粒子の取り込みは最小限で観察されました。

グリコカリックスが分解された細胞では、ナノ粒子からの赤色蛍光シグナルの増加が示すように、有意に高い取り込みが見られました。この手順に続いて、開放性官能基への結合などのさらなる修飾を行い、内皮成分の特異的な標的化または薬物の送達のために粒子を修飾することができる。