Name: AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: 学ぶドットブロット法によるAAV滴定とアセンブリ活性化タンパク質の機能評価。HEK293細胞を用いた簡便で低コストな遺伝子治療ベクター定量法とカプシド組立体制の解析手法です。

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シャオシャオ ノースカロライナ大学チャペルヒル校でにありがとう pEMBL CMV GFP プラスミドを提供してくれる。原稿の批判的な読み、クリストファー ・ チェンとサミュエル ・ j ・黄に感謝します。この作業によって支えられた公衆衛生サービスを付与 (NIH R01 NS088399 ・ T32 EY232113)。

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<li>Sonntag, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly-activating+protein+promotes+capsid+assembly+of+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes.</a> J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).</li>
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<li>Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+computational+evolution-based+method+to+study+a+mode+of+co-evolution+of+overlapping+open+reading+frames+in+the+AAV2+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome.</a> PLoS One. 8 (6), e66211(2013).</li>
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<li>Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+are+biologically+active+and+free+of+detectable+helper+and+wild-type+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses.</a> Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).</li>
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<li>Wobus, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+adeno-associated+virus+type+2+%28AAV-2%29+capsid%3A+epitope+mapping+and+identification+of+capsid+domains+involved+in+AAV-2-cell+interaction+and+neutralization+of+AAV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection.</a> J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titration+of+AAV-2+particles+via+a+novel+capsid+ELISA%3A+packaging+of+genomes+can+limit+production+of+recombinant+AAV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2.</a> Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).</li>
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</ol>

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本報告では、AAV 薬学会合同とキャプシド アセンブリでの役割を研究する定量的ドットしみアッセイの有用性を説明します。これらの研究から得られた知識は、AAV キャプシド アセンブリの過程で生得的な違いとそれぞれ異なる血清型間薬学会合同の機能的役割に関する詳細情報を提供できます。この点で、AAV VP3 AAP クロス補完ドットしみアッセイ蛇 AAV VP3 はキャプシド アセンブリの同種の AAP の共発現に厳格な依存関係を表示して蛇 AAP が異種血清型のキャプシド アセンブリを促進しないことを明らかにしました。.AAP 依存 AAV の血清型をので、この観察は興味をそそられる以前調べた (AAV1、2、3、6、7、8、9、および 12) すべて異種 AAP6を利用してある程度、少なくともアセンブリを処理することができます。
定量的ドットまたはスロットしみの交配は、便利な方法25で同時に複数のサンプルに含まれている核酸の定量のための伝統的な方法です。メソッドは、qPCR 流行した 19...

アデノ随伴ウイルス (AAV) は、約 4.7 kilobases (kb) のゲノムと小さく、非エンベロープ、一本鎖 DNA ウイルスです。AAV のゲノムには、担当者とキャップの遺伝子のオープンリーディング フレーム (Orf) が含まれています。2010 年、AAV2キャップ遺伝子内の +1 フレーム シフト ORF がエンコードされた未知の非構造蛋白だったゾンタークらによって発見され、ウイルス AAV2 VP 単量体蛋白質のアセンブリで重要な役割を果たすことが判明カプシド1。この蛋白質はキャプシド アセンブリ1の推進における役割後アセンブリ活性化タンパク質 (AAP) を選ばれました。
AAP の ORFs 属Dependoparvovirus、内がパルボ ウイルス家族1,2の別属のウイルスのゲノム内にないすべてのパルボ ウイルスのゲノムの特定の bioinformatically をされています。この蛋白質の機能調査された最初 AAP AAV2 のプロトタイプから (AAP2)、集積の形成に核小体に組み立ての VP 蛋白質を完全にターゲットに AAP2 の重要な役割を確立しているに焦点を当ててください。カプシド1,3、4を組み立てください。AAV2 カプシドの AAP 式の不在でアセンブルすることができないが個別にされている我々 を含む複数のグループによる1,2,3,4,5 を確認.AAV 血清型 1、8、および 9 の後の研究に裏付け薬学会合同の AAV1、8 の VP3 単量体蛋白質とキャプシド アセンブリ内の重要な役割と 9 は AAP2の共発現の不在で完全に組み立てられた構造を形成することができませんでした。
最近では、定量的なドットの使用を含むアプローチを試金のしみ、AAP の発現の有無と AAP1 の能力で縁どら VP3 モノマーからのアセンブリを促進するために 12 をアセンブルする 12 VP3 モノマーに AAV1 の機能を調べた異種血清型。本研究は明らかにその AAV4、5 と 11 の VP3 モノマーが AAP なく組み立てることができます。さらに、調べた 12 の AAP の血清型のうち 8 つがわかっただった (すなわち、すべてが AAP4、5、11、および 12) AAP4、5、11、12 を表示中、異種の AAV 血清型カプシドのキャプシド アセンブリをサポートする広範な権限を表示、大幅にこの点6の限られた能力。これらの 4 つの血清型が系統他 AAP 血清型2,の3から遠いです。また、研究では異なる薬学会合同6の細胞レベル下のローカリゼーションの重要な不均一性が明らかになった。さらに、研究は、組み立てられたカプシドと核小体、AAV2 キャプシド アセンブリの特徴 AAP の緊密な関連を AAV5 を含む他の血清型に拡張して必ずしもできないことを示唆している 8、および 9 は、核小体の排除を表示組み立てカプシド6。したがって、任意の特定の血清型 AAP の研究から得られる情報はすべて AAP 生物に広く適用できません。AAP の生物学のような不可解な性質は、正規と非正規の AAV 血清型から各 AAP の機能と役割を調査する必要性を強調します。
人間の萌芽期の腎臓 (HEK) で AAV のウイルスの粒子の完全パッケージ化抗体生産 293 細胞 AAV のベクトル生産、AAP の蛋白質の有無の最も一般的に使用されるセル行の決定によって評価されるキャプシド アセンブリの AAP の生物学的役割式です。AAV を定量化するための標準的な方法は量的な PCR (qPCR)-基づいた試金7,8としみに基づく定量的ドット9を試金します。酵素免疫アッセイ10,11など光学密度計測12 AAV ウイルス粒子の定量のための他の方法は、多くの異なる AAV の血清型に由来サンプルまたはサンプル不純物 (粗野な lysates または文化メディア)、AAV の研究に使用されるサンプルが多いと汚染されます。現在、qPCR 最も広く AAV 定量; の使用します。ただし、システム エラーや大きな価変動13,14qPCR ベース試金の試金としての潜在的な注意事項が発生を確認する必要があります。PCR に基づく試金は潜在的交絡増幅13を阻害する PCR テンプレートで共有閉じたターミナル ヘアピンの存在などの要因の数の影響を受けます。経験豊富な人であっても潜在的な紹介 qPCR ベースに交絡要因を無意識のうちに13試金。対照的に、定量的なドットのしみアッセイ、ゲノム増幅を必要としない、qPCR に基づく試金と比較してエラーの最小限のリスクで多くの単純な原理を使用して古典的な分子生物学手法です。このメソッドは技術的に困難な; 以下したがって、アッセイ結果が合理的に経験の浅い個人によっても再現可能です。
本報告では、AAV ベクターを定量化するために使用、(AAV5 と AAV9) の血清型共通の薬学会合同のアセンブリ促進の役割を勉強するアッセイを適用する方法と例を提供しています定期的に定量的なドットのしみの試金の方法論の詳細について述べる以前メタボライト AAP 蛇 AAV14から。自然の中で AAV VP 蛋白質および AAP 蛋白質は単一の遺伝子 (すなわち、VP AAP cis 補完) 中でここで説明アッセイから cis で表されます、VP、AAP の蛋白質は 2 つの独立したプラスミド (すなわち、VP AAP からトランスで指定されました。トランス-補完)。それぞれ異なる血清型から各 VP または AAP 蛋白質は、それぞれ独立したプラスミドから表現できる、キャプシド アセンブリ (つまり、VP AAP クロス補完) の異種の VP AAP の組み合わせをテストすることが可能になります。簡単に言えば、様々 な血清型から AAV VP3 は同種の血清型 AAP、または異種血清型 AAP の存在の有無で、AAV ベクター ゲノムをパッケージ化するプラスミド DNA トランスフェクションによって HEK 293 細胞で表されます。次の生産、文化メディアとセル lysates はキャプシド シェル内でウイルスのゲノムを定量化するドット プロット法にさらされます。点のしみの分析の最初の手順は、サンプルの汚染のプラスミド Dna とアンパックの AAV のゲノムを削除するヌクレアーゼとサンプルを扱うことです。そう失敗は unpurified サンプル試金されるとき、背景信号を特に増加させます。ウイルスのカプシドを破るし、サンプル ソリューションにヌクレアーゼ耐性ウイルスのゲノムを解放するプロテアーゼ処理によるこれは後します。次に、ウイルスのゲノムは、変性、膜の quantitation のためウイルス ゲノム特定 DNA プローブとハイブリダイズします。蛇 AAV VP3 がキャプシド アセンブリの蛇 AAP を必要とし、ヘビ AAP が薬学会合同総会を促進することも AAP 依存型の血清型に由来の多くとは異なり AAV9 カプシドのアセンブリを促進しないことを示すここで報告例の分析で異種血清型カプシド。最後に、我々 は qPCR に重要な注意点を報告またはドットのしみベース AAV 定量アッセイ ヌクレアーゼの選択は、分析結果に対して大きな影響を及ぼすこと。

<table><tbody><tr><td>Benzonase</td><td>MilliporeSigma</td><td>1016970001</td><td>本文では Serratia marcescen endonuclease と表記されています。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>本文ではDNase I Enzyme Aと表記されています。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td>本文ではDNase I Enzyme Bと表記されています。</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td>本文ではDNase I Enzyme Cと表記されています。</td></tr><tr><td>1.5 mL 付属 O リング スクリュー キャップ マイクロ遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>430909</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL マイクロ遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ポリプロピレン コニカル チューブ</td><td>コーニング</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>3 M 酢酸ナトリウム</td><td>Teknova</td><td>S0298</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ポリプロピレン コニカル チューブ</td><td>コーニング</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>AAV-293 Cells</td><td>Agilent</td><td>240073</td><td>HEK-293細胞株は、AAVビリオンのパッケージングに最適化されています。</td></tr><tr><td>AccuGENE 0.5 M EDTA Solution</td><td>Lonza</td><td>51234</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 10% SDS</td><td>Lonza</td><td>51213</td><td></td></tr><tr><td>AccuGENE 1X TE Buffer</td><td>Lonza</td><td>51235</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>セルリフター</td><td>コーニング</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>DNA 抽出キット</td><td>和光純薬工業</td><td>295-50201</td><td>精製ウイルスの定量的ドットブロットに使用されます。各ステップで、メーカーが提供するマニュアルのプロトコルスキーム2に推奨されるすべての試薬の半分の量のみを使用します。</td></tr><tr><td>ダルベッコS Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Cells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18290015</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22095</td><td>Polysucrose 400.</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 40 CFL</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>ロシュ</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>ニシン精子 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15634-017</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-247-150</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant TL</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>ImageQuant TL</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Mini Quick Spin DNA Columns</td><td>MilliporeSigma</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-RC2 Vector</td><td>Cell Biolabs Inc</td><td>VPK-422</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ロンザ</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>リン光イメージング露光カセット</td><td>GE ヘルスケアライフサイエンス</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>リン光イメージングスクリーン</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド マキシキット</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>プラチナ Pfx DNA ポリメラーゼ</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11708013</tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polysciences Inc</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone</td><td>MilliporeSigma</td><td>P5288</td><td></td></tr><tr><td>Prime-It II Random Primer Labeling Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>300385</td><td></td></tr><tr><td>Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning:CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAAA-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>カスタムプライマープライマーAAP</td><td></td></tr><tr><td>リバース(N25はAAP ORFの最後の25ヌクレオチドであり、RE2はクローニングの制限酵素部位です):TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>カスタムプライマー</td><td></td></tr><tr><td>プライマーVP3フォワード(N25VP3 ORFの最初の25ヌクレオチド、RE1はクローニングの制限酵素部位です):CTAA-RE1-CACC-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>カスタムプライマー</td>プライマーVP3<td></td></tr><tr><td>リバース(N25は、AAP ORFの最後の25ヌクレオチドです。 RE2 はクローニング用の制限酵素部位です): TCTT-RE2-N25</td><td>MilliporeSigma</td><td>Custom Primer</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K Solution</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>制限酵素</td><td>New England Biolabs</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>サーモン 精子 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>6321000515</td><td></td></tr><tr><td>組織培養処理済み 6 ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td></td><td></td>353046</tr><tr><td>Tris Base</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>台風 FLA 7000</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Buffer-Saturated Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15513-047</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>XLE-1000</td><td>Optimal Crosslink mode is used with 120 mJ/cm2。</td></tr><tr><td>ゼータプローブメンブレン</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0165</td><td></td></tr></tbody></table>

aav 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

アデノ随伴ウイルス (aav ベクター) は遺伝子療法のための魅力的なベクトルとして広く受け入れられて、それはまた、ウイルスの生物学を理解するためのモデル ウイルスとして提供しています。後者の点でアセンブリ活性化タンパク質 (AAP) と呼ばれる非構造 AAV 蛋白質の最近の発見はキャプシドにウイルス キャプシド VP のアセンブリにかかわるプロセスに新たな光を当てます。我々 が最近報告している多くの AAV の血清型には、アセンブリの AAP が必要ですが、その AAV4、5、11 がこの規則の例外を。さらに、薬学会合同と異なる血清型の組み立てのカプシドを別の細胞内コンパートメントにローカライズすることを示した。生物学的特性と異なる AAV 間薬学会合同の機能的役割で予期しないこの不均一性アンダー スコア薬学会合同研究の重要性は多様な血清型に由来の血清型します。この原稿は、AAV の定量とその応用キャプシド アセンブリの AAP 依存性と血清型特異性を評価するために簡単なドット プロット法を詳しく説明します。このドット プロット法の有用性を示すためには、カプシド アセンブリおよび AAP 蛇 AAV, 以前メタボライト爬虫類 AAV と同様、AAV5 および AAV9、AAP 自立・ AAP 依存以前示されている依存性を特徴付けるに着手しました血清型、それぞれ。アッセイでは、蛇 AAV キャプシド アセンブリ蛇 AAP を必要とし、AAV5 と AAV9 から薬学会合同によって昇格できませんを明らかにしました。試金はまた、一般的な血清型異種キャプシド アセンブリを促進する相互補完によって薬学会合同の多くとは異なり蛇 AAP を促進しない AAV9 カプシドのアセンブリを示した。ヌクレアーゼの選択に大きく影響するドット プロット法の読み出し、したがって、最適な酵素を選択することは、AAV 価の成功評価のため重要です。 さらに、示します。

大規模な生産精製 AAV ベクター株式を定量化するため、定量的なドット ・ ブロットの代表的な結果を図 1に示します。このドットのしみアッセイで二本鎖 AAV2G9 CMV GFP ベクトル株式の価を測定しました。ベクトルは、セシウムの塩化物 (CsCl) 密度勾配超遠心法に続いて前述20として透析の 2 つの円形によって精製した.一般に、精製の AAV ベクター株各 AAV ベクター素材 (例えば、0.3 μ L、0.1 μ L、0.03 μ L) の 3 つの異なるボリューム変更と重複で上記ドットしみプロシージャに服従するが。ステップ 3.2、 s. の marcescensエンドヌクレアーゼの代わりに DNase I 酵素 A が使用され (材料表参照) 3.4 の手順で抽出・ ウイルスの DNA を精製する市販のキットを使用します。図 1</str...

アデノ随伴ウイルス (AAV) 抗体とアセンブリ活性化の役割を研究する応用を定量化するための簡単なドット プロット法の詳細を本稿では蛋白質 (薬学会合同)、すべて AAV が見つかりましたウイルスの非構造タンパク質の新規クラス血清型、同種および異種 AAV の血清型に由来するカプシドのアセンブリを促進します。

AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

この方法では、精製されたAVワクチン力価と精製されていないAVワクチン力価の両方を測定し、AAV AAPが同族および異種のAV血清型カプシスの組み立てを促進する能力を評価できます。この手法の主な利点は、他のAAV滴定方法の欠点を回避する、簡単で安価な方法であることです。この方法は一般的にAAVベクター定量に使用されてきましたが、このプロトコルに示されているように、AAV生物学に関するさまざまな基本的な問題に対処するためにも適用できます。0日目に、HEK 293細胞を90%の密度で培養した後、カルシウムまたはマグネシウムを含まない96マイクロリットルのPBSにプラスミドを混合し、無菌の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブでトランスフェクション試薬を調製します。この表に示されているように、DNAの総量はウェルあたり2マイクログラムです。PBSプラスミドDNAミックスに4マイクロリットルのPEI溶液を加えます。最終容量は約100マイクロリットルまたは培地の5%容量です。チューブを短時間ボルテックスし、DNA PEI混合物を室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、マイクロ遠心分離機でチューブを短時間回転させ、液体を底に集めます。そして、DNA PEI混合物をHEK 293培養プレートの各ウェルの培地に滴下します。その後、プレートを穏やかに攪拌し、5%CO2を入れた摂氏37度のインキュベーターに戻します。HEK 293細胞のトランスフェクションは、このプロトコルの高力価ウイルス産生のための重要な要素です。健全で継代数が少ない細胞を使用し、細胞の単層を破壊しないように注意する必要があります。1日目と2日目は、倒立蛍光顕微鏡でPCMVGFPプラスミドをトランスフェクションした細胞を観察し、トランスフェクション効率を評価します。5日目に、細胞とウイルス含有培地を上下にピペットで動かすか、セルスクレーパーを使用してすべての細胞を掻き取ります。次に、懸濁液を15ミリリットルのポリプロピレン円錐管に移します。サンプルは使用するまでマイナス80°Cで保管してください。ウイルス粒子を回収するには、凍結したチューブを摂氏37度の水浴ですばやく解凍します。次に、チューブを1分間激しくボルテックスして、細胞からのAAVの回収を最大化します。細胞破片を3.700倍Gおよび摂氏4度で10分間遠心分離することによりペレット化します。次に、各チューブから200マイクロリットルの上清を、ドットブロットアッセイ用のスクリューキャップ付きの標識マイクロ遠心チューブに移します。サンプルをSerratia marcescens endonucleaseで処理するには、ミックスA試薬とミックスB試薬を調製します。各試薬を10マイクロリットルずつ各サンプルチューブに加えます。サンプルを5秒間ボルテックスし、短時間回転させて液体をチューブの底に集めます。次に、チューブを摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートします。サンプルを短時間回転させた後、ミックスC試薬を調製し、各チューブに180マイクロリットルを添加してプロテイナーゼK処理を行います。次に、チューブをボルテックスし、再び短時間回転させた後、摂氏55度で1時間インキュベートします。サンプルが室温に戻ったら、200マイクロリットルのフェノールクロロホルムを加え、チューブを1分間ボルテックスします。次に、Gの16倍、100倍、室温で少なくとも5分間、マイクロ遠心分離機でサンプルを回転させます。320マイクロリットルの水層または80%の水溶液を新しい標準的なマイクロ遠心チューブに移します。AAV定量の精度を維持するためには、サンプルから同じ量を採取する必要があるため、この移管ステップは非常に重要です。水層を除去する際に有機相を避けるように注意する必要があります。ミックスD試薬を調製し、各サンプルチューブに833マイクロリットルを加えます。チューブをボルテックスした後、マイナス80°Cで少なくとも20分間インキュベートします。遠心分離後、上清を注ぎ、清潔なペーパータオルでチューブを一度拭き取ります。約500マイクロリットルの70%エタノールを各チューブにピペットで入れ、チューブを5秒間ボルテックスします。サンプルを再度回転させた後、上清を注ぎ、清潔なペーパータオルでチューブを一度吸い取ります。次に、ペレットを摂氏65度で乾燥させてから、TEバッファーに再懸濁します。ドットブロットアッセイを実施するには、AAVベクターゲノムプラスミドDNAを水またはTris-HCLバッファーで1マイクロリットルあたり10ナノグラムに希釈することにより、プラスミドDNA標準液を調製します。希釈したプラスミドDNAの25マイクロリットルアリコートを新しいチューブに移し、50マイクロリットルの反応容量で適切な制限酵素で1時間直鎖化します。消化されたプラスミドDNA標準液が入ったチューブに450マイクロリットルの水またはTEを加え、十分に混合します。次に、この混合物の70マイクロリットルを、1,330マイクロリットルの水またはTEを備えた新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移して、希釈プラスミド標準液を調製します。ドットブロット装置をセットするには、ハサミを使用して、ブロッティングメンブレンをサンプル数と標準試料の数に適したサイズにカットします。メンブレンを水で10分間浸してから、ドットブロット装置に置きます。次に、未使用の井戸を覆います。サンプルがロードされる井戸に水を追加します。掃除機をかけ、井戸から水を引っ張り、エラーがないか確認してから、ネジを締め直します。必要に応じて再テストします。希釈したプラスミドDNA標準試料を各ウェルに400マイクロリットルずつ適用し、標準希釈液を4レーン実行します。標準ダイジェストの2つの別々のアリコートを使用し、それぞれを重複してロードします。次に、各ウイルスDNAサンプルのウェルあたり200マイクロリットルを適用します。穏やかな真空を適用して、DNA溶液をウェルに引き込みます。次に、すべてのウェルが空になったら、三方弁を調整して真空を解除します。各ウェルに400マイクロリットルのXアルカリ溶液1個を加えます。次に、5分間待ってから、バキュームを再適用してウェルを空にします。バキュームを再度塗布し、ドットブロット装置を分解します。次に、メンブレンをはがし、2つのX SSCですすいでください。DNA結合面を上にして、清潔なペーパータオルの上にメンブレンを置き、余分なバッファーを取り除きます。適切なUVクロスリンカーを使用して、ブロットしたDNAをメンブレンにUVクロスリンクします。これで、メンブレンはハイブリダイゼーションの準備が整いました。DNA結合面を上にして、メンブレンをハイブリダイゼーションボトルに入れます。5〜10ミリリットルの予め加温したハイブリダイゼーションバッファーでメンブレンをすすぎ、バッファーを廃棄します。次に、10ミリリットルの予め温めたハイブリダイゼーションバッファーを加え、ボトルを摂氏65度に設定された回転ハイブリダイゼーションオーブンに入れます。ボトルを少なくとも5分間回転させます。変性した精子DNAと放射性プローブをボトル内のハイブリダイゼーションバッファーにすばやく加え、10秒間振とうして混合します。ボトルを摂氏65度のオーブンに戻し、摂氏65度の回転で少なくとも4時間インキュベートします。ハイブリダイゼーションが完了したら、回転を停止します。ハイブリダイゼーションボトルを取り外し、漏れ防止プラグシールキャップ付きの50ミリリットルの円錐管に放射性プローブ溶液を注ぎます。メンブレンを洗浄するには、20〜30マイクロリットルの予め温めた洗浄バッファーをハイブリダイゼーションボトルに加え、5分間回転させます。この洗浄をさらに2回繰り返します。3回目の洗浄後、ハイブリダイゼーションボトルからメンブレンを取り出し、ペーパータオルでメンブレンから余分な緩衝液を取り除きます。次に、メンブレンを透明なプラスチックペーパーホルダーに入れます。ガイガーカウンターを使用して、メンブレン上の放射性信号を確認します。消去した蛍光体イメージングスクリーンをメンブレンに露光した後、蛍光体イメージングスキャンシステムを使用してスクリーンをスキャンし、各ドットの信号強度に関するデータを取得します。テキストプロトコルに従ってデータ分析を実行します。このAAV 2G9ベクター滴定用の定量的ドットブロットには、2セットの標準と、0.3、0.1、0.03マイクロリットルの重複を含む3つの異なる量のAAVベクター調製が含まれています。ブロットでアッセイされる量は、経験的に、または予備的なアッセイに基づいて決定されます。補間により、AAV 2G9ベクターの0.3、0.1、0.03マイクロリットルの力価は平均5.16、0.27ナノグラム相当のマイクロリットルであることが決定されました。AAV5、AAV9、およびスネークAAV由来のVP3 cas-pidおよびAAPタンパク質の可能な同族および異種血清型の組み合わせをすべて、定量的ドットブロットアッセイによりカプシドアセンブリについて評価しました。このグラフの結果は、AAPがトランスで提供されたかどうかに関係なく、AAV5 VP3がアセンブルすることを示しています。さらに、AAP5およびAAP9は、AAP9 VP3キャプシドアセンブリを促進することができますが、AAP5はAAP9よりも効果的に機能しません。AAP5もAAP9もヘビAAV VP3のアッセンブリー促進活性は示さず、ヘビAAPはヘビAAV VP3のアッセンブリーを促進するだけです。ドットブロット分析を、細胞および培地由来の不純物を含む最適化されていない条件下で、市販の3つのヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を評価するために適用しました。酵素Aは他の2つの酵素ほど活性がないことが判明し、ヌクレアーゼの選択がドットブロットアッセイの読み出しに大きく影響する可能性があることが示されました。この手法は、AAVベクターの定量に容易であり、同族および異種血清型に由来するAAVカプシドのアセンブルを促進するAAPの役割を評価するのに役立ちます。この手法は、一度習得すれば、細胞培養実験でアッセイサンプルが得られれば、1日で行うことができます。この手順を試行する際は、定量精度を確保するために、正しい液体量を慎重にピペットでピペットすることを覚えておくことが重要です。開発後、AAPの研究に定量的ドットブロットアッセイを適用することで、AAV生物学の研究者がAAVキャプシドアセンブリのメカニズムをさらに理解する道が開かれました。ヒト細胞、ウイルス剤、フェノールクロロホルム、放射性物質の取り扱いは、非常に危険であることを忘れないでください。また、曝露を制限するために、白衣、手袋、ゴーグルの使用が必要です。これらの材料は、承認されたエリアでのみ取り扱う必要があります。このビデオを見れば、AAV定量用のドットブロットサンプルの調製方法、ドットブロット装置のセットアップ方法、AAV力価の測定方法、およびAAV生物学の研究への適用方法について十分に理解できるはずです。この手順に続いて、培養細胞におけるAAVベクター形質導入アッセイなどの他のアッセイを実施して、ドットブロットアッセイによって決定される物理粒子力価と比較したベクター化の機能力価などの追加の質問に答えることができます。

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Research

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Biology

生物学

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AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質

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