AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質

この方法では、精製されたAVワクチン力価と精製されていないAVワクチン力価の両方を測定し、AAV AAPが同族および異種のAV血清型カプシスの組み立てを促進する能力を評価できます。この手法の主な利点は、他のAAV滴定方法の欠点を回避する、簡単で安価な方法であることです。この方法は一般的にAAVベクター定量に使用されてきましたが、このプロトコルに示されているように、AAV生物学に関するさまざまな基本的な問題に対処するためにも適用できます。

0日目に、HEK 293細胞を90%の密度で培養した後、カルシウムまたはマグネシウムを含まない96マイクロリットルのPBSにプラスミドを混合し、無菌の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブでトランスフェクション試薬を調製します。この表に示されているように、DNAの総量はウェルあたり2マイクログラムです。PBSプラスミドDNAミックスに4マイクロリットルのPEI溶液を加えます。

最終容量は約100マイクロリットルまたは培地の5%容量です。チューブを短時間ボルテックスし、DNA PEI混合物を室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、マイクロ遠心分離機でチューブを短時間回転させ、液体を底に集めます。

そして、DNA PEI混合物をHEK 293培養プレートの各ウェルの培地に滴下します。その後、プレートを穏やかに攪拌し、5%CO2を入れた摂氏37度のインキュベーターに戻します。HEK 293細胞のトランスフェクションは、このプロトコルの高力価ウイルス産生のための重要な要素です。

健全で継代数が少ない細胞を使用し、細胞の単層を破壊しないように注意する必要があります。1日目と2日目は、倒立蛍光顕微鏡でPCMVGFPプラスミドをトランスフェクションした細胞を観察し、トランスフェクション効率を評価します。5日目に、細胞とウイルス含有培地を上下にピペットで動かすか、セルスクレーパーを使用してすべての細胞を掻き取ります。

次に、懸濁液を15ミリリットルのポリプロピレン円錐管に移します。サンプルは使用するまでマイナス80°Cで保管してください。ウイルス粒子を回収するには、凍結したチューブを摂氏37度の水浴ですばやく解凍します。

次に、チューブを1分間激しくボルテックスして、細胞からのAAVの回収を最大化します。細胞破片を3.700倍Gおよび摂氏4度で10分間遠心分離することによりペレット化します。次に、各チューブから200マイクロリットルの上清を、ドットブロットアッセイ用のスクリューキャップ付きの標識マイクロ遠心チューブに移します。

サンプルをSerratia marcescens endonucleaseで処理するには、ミックスA試薬とミックスB試薬を調製します。各試薬を10マイクロリットルずつ各サンプルチューブに加えます。サンプルを5秒間ボルテックスし、短時間回転させて液体をチューブの底に集めます。

次に、チューブを摂氏37度で少なくとも1時間インキュベートします。サンプルを短時間回転させた後、ミックスC試薬を調製し、各チューブに180マイクロリットルを添加してプロテイナーゼK処理を行います。次に、チューブをボルテックスし、再び短時間回転させた後、摂氏55度で1時間インキュベートします。

サンプルが室温に戻ったら、200マイクロリットルのフェノールクロロホルムを加え、チューブを1分間ボルテックスします。次に、Gの16倍、100倍、室温で少なくとも5分間、マイクロ遠心分離機でサンプルを回転させます。320マイクロリットルの水層または80%の水溶液を新しい標準的なマイクロ遠心チューブに移します。

AAV定量の精度を維持するためには、サンプルから同じ量を採取する必要があるため、この移管ステップは非常に重要です。水層を除去する際に有機相を避けるように注意する必要があります。ミックスD試薬を調製し、各サンプルチューブに833マイクロリットルを加えます。

チューブをボルテックスした後、マイナス80°Cで少なくとも20分間インキュベートします。遠心分離後、上清を注ぎ、清潔なペーパータオルでチューブを一度拭き取ります。約500マイクロリットルの70%エタノールを各チューブにピペットで入れ、チューブを5秒間ボルテックスします。

サンプルを再度回転させた後、上清を注ぎ、清潔なペーパータオルでチューブを一度吸い取ります。次に、ペレットを摂氏65度で乾燥させてから、TEバッファーに再懸濁します。ドットブロットアッセイを実施するには、AAVベクターゲノムプラスミドDNAを水またはTris-HCLバッファーで1マイクロリットルあたり10ナノグラムに希釈することにより、プラスミドDNA標準液を調製します。

希釈したプラスミドDNAの25マイクロリットルアリコートを新しいチューブに移し、50マイクロリットルの反応容量で適切な制限酵素で1時間直鎖化します。消化されたプラスミドDNA標準液が入ったチューブに450マイクロリットルの水またはTEを加え、十分に混合します。次に、この混合物の70マイクロリットルを、1,330マイクロリットルの水またはTEを備えた新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移して、希釈プラスミド標準液を調製します。

ドットブロット装置をセットするには、ハサミを使用して、ブロッティングメンブレンをサンプル数と標準試料の数に適したサイズにカットします。メンブレンを水で10分間浸してから、ドットブロット装置に置きます。次に、未使用の井戸を覆います。

サンプルがロードされる井戸に水を追加します。掃除機をかけ、井戸から水を引っ張り、エラーがないか確認してから、ネジを締め直します。必要に応じて再テストします。

希釈したプラスミドDNA標準試料を各ウェルに400マイクロリットルずつ適用し、標準希釈液を4レーン実行します。標準ダイジェストの2つの別々のアリコートを使用し、それぞれを重複してロードします。次に、各ウイルスDNAサンプルのウェルあたり200マイクロリットルを適用します。

穏やかな真空を適用して、DNA溶液をウェルに引き込みます。次に、すべてのウェルが空になったら、三方弁を調整して真空を解除します。各ウェルに400マイクロリットルのXアルカリ溶液1個を加えます。

次に、5分間待ってから、バキュームを再適用してウェルを空にします。バキュームを再度塗布し、ドットブロット装置を分解します。次に、メンブレンをはがし、2つのX SSCですすいでください。

DNA結合面を上にして、清潔なペーパータオルの上にメンブレンを置き、余分なバッファーを取り除きます。適切なUVクロスリンカーを使用して、ブロットしたDNAをメンブレンにUVクロスリンクします。これで、メンブレンはハイブリダイゼーションの準備が整いました。

DNA結合面を上にして、メンブレンをハイブリダイゼーションボトルに入れます。5〜10ミリリットルの予め加温したハイブリダイゼーションバッファーでメンブレンをすすぎ、バッファーを廃棄します。次に、10ミリリットルの予め温めたハイブリダイゼーションバッファーを加え、ボトルを摂氏65度に設定された回転ハイブリダイゼーションオーブンに入れます。

ボトルを少なくとも5分間回転させます。変性した精子DNAと放射性プローブをボトル内のハイブリダイゼーションバッファーにすばやく加え、10秒間振とうして混合します。ボトルを摂氏65度のオーブンに戻し、摂氏65度の回転で少なくとも4時間インキュベートします。

ハイブリダイゼーションが完了したら、回転を停止します。ハイブリダイゼーションボトルを取り外し、漏れ防止プラグシールキャップ付きの50ミリリットルの円錐管に放射性プローブ溶液を注ぎます。メンブレンを洗浄するには、20〜30マイクロリットルの予め温めた洗浄バッファーをハイブリダイゼーションボトルに加え、5分間回転させます。

この洗浄をさらに2回繰り返します。3回目の洗浄後、ハイブリダイゼーションボトルからメンブレンを取り出し、ペーパータオルでメンブレンから余分な緩衝液を取り除きます。次に、メンブレンを透明なプラスチックペーパーホルダーに入れます。

ガイガーカウンターを使用して、メンブレン上の放射性信号を確認します。消去した蛍光体イメージングスクリーンをメンブレンに露光した後、蛍光体イメージングスキャンシステムを使用してスクリーンをスキャンし、各ドットの信号強度に関するデータを取得します。テキストプロトコルに従ってデータ分析を実行します。

このAAV 2G9ベクター滴定用の定量的ドットブロットには、2セットの標準と、0.3、0.1、0.03マイクロリットルの重複を含む3つの異なる量のAAVベクター調製が含まれています。ブロットでアッセイされる量は、経験的に、または予備的なアッセイに基づいて決定されます。補間により、AAV 2G9ベクターの0.3、0.1、0.03マイクロリットルの力価は平均5.16、0.27ナノグラム相当のマイクロリットルであることが決定されました。

AAV5、AAV9、およびスネークAAV由来のVP3 cas-pidおよびAAPタンパク質の可能な同族および異種血清型の組み合わせをすべて、定量的ドットブロットアッセイによりカプシドアセンブリについて評価しました。このグラフの結果は、AAPがトランスで提供されたかどうかに関係なく、AAV5 VP3がアセンブルすることを示しています。さらに、AAP5およびAAP9は、AAP9 VP3キャプシドアセンブリを促進することができますが、AAP5はAAP9よりも効果的に機能しません。

AAP5もAAP9もヘビAAV VP3のアッセンブリー促進活性は示さず、ヘビAAPはヘビAAV VP3のアッセンブリーを促進するだけです。ドットブロット分析を、細胞および培地由来の不純物を含む最適化されていない条件下で、市販の3つのヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を評価するために適用しました。酵素Aは他の2つの酵素ほど活性がないことが判明し、ヌクレアーゼの選択がドットブロットアッセイの読み出しに大きく影響する可能性があることが示されました。

この手法は、AAVベクターの定量に容易であり、同族および異種血清型に由来するAAVカプシドのアセンブルを促進するAAPの役割を評価するのに役立ちます。この手法は、一度習得すれば、細胞培養実験でアッセイサンプルが得られれば、1日で行うことができます。この手順を試行する際は、定量精度を確保するために、正しい液体量を慎重にピペットでピペットすることを覚えておくことが重要です。

開発後、AAPの研究に定量的ドットブロットアッセイを適用することで、AAV生物学の研究者がAAVキャプシドアセンブリのメカニズムをさらに理解する道が開かれました。ヒト細胞、ウイルス剤、フェノールクロロホルム、放射性物質の取り扱いは、非常に危険であることを忘れないでください。また、曝露を制限するために、白衣、手袋、ゴーグルの使用が必要です。

これらの材料は、承認されたエリアでのみ取り扱う必要があります。このビデオを見れば、AAV定量用のドットブロットサンプルの調製方法、ドットブロット装置のセットアップ方法、AAV力価の測定方法、およびAAV生物学の研究への適用方法について十分に理解できるはずです。この手順に続いて、培養細胞におけるAAVベクター形質導入アッセイなどの他のアッセイを実施して、ドットブロットアッセイによって決定される物理粒子力価と比較したベクター化の機能力価などの追加の質問に答えることができます。