低線量の毒性に萌芽期の露出の長期的な行動および生殖の影響

これらの手順の全体的な目標は、初期胚形成における低用量BPA曝露の長期的な影響を調査することです。C.elegansの胚は、限られた期間BPAに曝露され、成人期に達したときに繁殖力と学習行動についてテストされます。この方法は、ビスフェノールやその他の内分泌かく乱化合物などの毒物への曝露の長期的な発生への影響に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、使いやすい無脊椎動物ラボモデルでの定量的行動アッセイを通じて、毒物の発生に対する長期的かつ微妙な影響をテストできることです。この技術の意味するところは、低用量であっても毒物への曝露による健康への悪影響の発達的および神経的基盤の理解にまで及びます。これらの実験のアイデアを最初に思いついたのは、多くの複雑性または多因子性の障害が何らかの発達要素を持っているように見えることに気付いたときでした。

これは、重要な遺伝子の異常な発現を通じて部分的に影響を及ぼしている可能性があります。この方法を視覚的に示示することは、テキストベースの指示だけでは室内の触覚の慣れのステップを学ぶのが難しい場合があるため、非常に重要です。同期の前日に、N2線虫をNGM培地を含む100mmプレートに移し、大腸菌OP50で広げます。

約1センチ四方のスラブをチャンキングします。ワームを摂氏20度で3日間成長させます。3日後、プレートに目に見える胚を含む十分に栄養を与えられた成熟した成体が充填されたら、まず各プレートを5ミリメートルのM9バッファーで洗浄し、液体を滅菌済みの15ミリリットルの円錐形遠心チューブに移すことで同期を開始します。

室温で4分間、重力の3、000倍で遠心分離します。certrifugationに続いて、10ミリリットルのピペットを使用して、成虫の各緩いペレットから上清を慎重に取り除きます。次に、調製したばかりの次亜塩素酸塩溶液をワームの各ペレットに加え、穏やかに混合します。

室温で重力の3, 000倍で4分間遠心分離します。同期した母集団を取得することが重要です。新鮮な次亜塩素酸塩溶液を調製すると、汚染や非同期の動物を避けるのに役立ちます。

次に、10ミリリットルのピペットを使用して上清を取り除き、7ミリリットルのM9バッファーを洗浄します。この手順を 2 回繰り返します。最後の洗浄後、卵に約100マイクロリットルのM9バッファーを追加します。

次に、約50マイクロリットルの卵を、Sバッファーで希釈したBPAを含む2ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。表に示すように、チューブあたりのBPAの正しい最終濃度を確保するために、Sバッファーの量を調整します。チューブをロッキングシェーカーまたはロータリーシェーカーに置き、毎分25チルト、または摂氏20度で4時間25RPMで移動します。

4時間後、チューブをチューブホルダーに入れ、ワームが落ち着くまで待ちます。上清を捨て、OP50 E.coliを播種したNGMプレートに寄生します。ワームを摂氏20度で60時間成長させます。

プレートに汚染がないか毎日検査してください。汚染されたNGMプレートは通常、変色し、個々のコロニーを伴います。顕微鏡でワームが過密状態になっていないか確認してください。

まず、火で滅菌した30ゲージのプラチナワイヤーピックを使用して、約10匹の同期した若成虫を新しい播種されていないNGMプレートに移します。ワームを5分間邪魔せずに放置し、新しいプレートに順応する時間を確保します。次に、木製の串またはつまようじの端に付着した眉毛を70%エタノールに浸して滅菌します。

清潔で糸くずの出ないティッシュで拭き、エタノールが蒸発するまで1分間待ちます。眉毛を使って頭の上のワームにそっと触れます。タッチを繰り返し、タッチの間に10秒を空けて、ワームが回復するのを待ちます。

触れ続け、ワームが後方に動かなくなるまで10秒のインタースティミュラル間隔を空けます。この慣れが発生するために必要なタッチ数を記録します。タッチの間隔を10秒にすることは、動物の回復時間を確保し、一貫した慣れ行動アッセイを得るのに役立つため、重要です。

1マイクロモル以上の濃度のBPAに胚芽的に曝露された成体動物は、水平線で表される対照と比較して、産卵数が有意に少なかった。0.1マイクロモルという低いBPA濃度に曝露された胚に由来する成体動物は、慣れるために必要な前方接触の数の増加に基づいて非結合性欠損を示します。BPA曝露のための胚を準備する際には、十分なサンプルサイズを得るために、十分に栄養を与えられたC.elegansの成虫と解剖顕微鏡で見える成熟卵を持つプレートを選択することが重要です。

この技術は、環境毒性学の分野の研究者が、毒素やその他の内分泌かく乱化合物が行動に及ぼす影響を評価し、メカニズム実験を設計するための道を開きます。このビデオを見れば、初期段階のC.elegans胚をBPAに曝露する方法と、BPAに曝露した胚から得られた成体における馴化行動をテストする方法について十分に理解できるはずです。