麻酔下のマウスから脳脊髄液のコレクションのための改良法
2018年3月19日
このプロトコルではない汚染血液から脳脊髄液 (CSF) の豊富なコレクションのための改善された技術について説明します。大きいサンプル コレクションと純度で、脳や脊髄に影響を与える病気の私達の理解を促進するため CSF を使用してより分析を実行できます。
この手順の全体的な目標は、血液による汚染なしにマウスからの脳脊髄液の収集を改善することです。この方法は、神経疾患のバイオマーカーをモニタリングするためのCSFを収集するための簡単で信頼性の高い方法を提供します。この技術の主な利点は、マウスからのCSF収集を支援するマイクロマニピュレータを添加することで、収集中の血液の汚染が減少することです。
まず、引っ張ったガラスキャピラリーを、マイクロマニピュレーターにしっかりと取り付けられたキャピラリーホルダーに入れます。次に、解剖顕微鏡で見ながら、鋭利になった毛細血管の先端をまっすぐな鉗子で折れ、折れた先端の内径が10〜20ミクロン程度になるようにします。次に、キャピラリーホルダーのもう一方の端に細いチューブとシリンジを取り付け、細いチューブとシリンジを三方弁で接続し、三方弁を開位置に移動します。
次に、シリンジを突っ込んで汚染物質を排出し、毛細管に陽圧を作り出します。シリンジを三方弁に切断して再接続することにより、これを数回繰り返します。次に、シリンジを三方弁に最終的に再接続する前に、空気を100〜200マイクロリットルに吸い込みます。
ガラスキャピラリー付きのマイクロマニピュレーターを横に動かして、手術中の損傷を防ぎます。手術を開始する前に、マウスが4本の手足すべてをつまんで反応がないことを確認して、マウスが完全に麻酔されていることを確認してください。次に、解剖ハサミを使用して、マウスの頭の後ろの毛を目の上から耳の間から首の下までカットしてトリミングします。
マウスの頭部を固定装置用フレームマウスアダプターで固定します。マウスのヘッドをそっと押し下げて、ヘッドが動かず、アダプターにしっかりと固定されていることを確認します。はさみと湾曲した鉗子を使用して、首の後ろを横切ってマウスの皮膚を切り取り、次にマウスの耳と目の間の頭蓋骨の中央を下ります。
皮膚と組織を引き離し、大槽の上の領域から引き出します。解剖顕微鏡で観察しながら、鉗子を使用して頭蓋骨の基部上の最後の薄い筋肉の層を慎重に解剖し、これらの筋肉の層を側面に移動して関心領域から外します。大槽の上の硬膜が露出したら、濡れた綿棒を使用して膜をきれいに拭き、次に乾いた綿棒を使用してその領域を乾かします。
大槽は三角形に見え、1〜2本の大きな血管がその領域を通っています。血管の両側または血管間は、毛細血管の挿入とCSFの収集に最適です。大槽が露出したら、マイクロマニピュレーターを使用してガラスキャピラリーをマウスの頭の後ろに合わせ、鋭利な点が30〜45度の角度で膜のすぐ後ろになるようにします。
次に、シリンジを1回または数回突っ込み、プランジャーを100〜200マイクロリットル戻して、汚染物質がなく、ガラスキャピラリーに負圧があることを確認します。次に、抵抗が見えるまで、しかし膜に穴を開けずに、毛細血管の先端を膜に近づけます。マイクロマニピュレーターのコントロールをノックして、キャピラリーチューブをメンブレンを通して優しく叩きます。
CSFは、開口部に穴が開けられると、自動的にキャピラリーチューブに引き込まれます。キャピラリーをそのままにして、CSFをゆっくりと収集します。CSFの流れが止まった場合は、シリンジをゆっくりと約50マイクロリットルまで引き上げて、キャピラリーにさらに負圧を作り出します。.
10〜15マイクロリットルのCSFが10〜30分で収集されます。必要な量のCSFが収集されたら、三方弁を動かしてチューブを閉じ、チューブに接続されているシリンジを取り外してチューブを閉じます。チューブを開閉して、キャピラリー、チューブ、およびキャピラリーの外側の領域に均等な圧力を作り出します。
次に、シリンジを再接続し、マイクロマニピュレータを使用してマウスからガラスキャピラリーを静かに取り外します。次に、1マイクロリットルの20Xプロテアーゼ阻害剤を含む収集チューブをガラスキャピラリーの鋭利な点の下に置きます。チューブを開き、シリンジを静かに突っ込みます。
CSFはキャピラリーから収集チューブに流れ込む必要があります。収集後、CSFをパルス遠心分離機にかけ、サンプルを収集チューブの底にあるプロテアーゼ阻害剤と混合します。CSFサンプルは分注し、マイナス80°Cでさらに分析するために保存できます。
APP / PS1マウスから収集されたCSFは、生後12か月でヒトAベータ42のレベルが有意に増加したことを示しました。野生型マウスでは、ヒトAベータ42は検出されませんでした。この手順をマスターすると、適切に実行すれば1時間で完了します。
この手順を試みる際には、毛細血管を挿入するときに血管を避け、血液による汚染を避けるために、CSF収集中にマイクロマニピュレーターで微調整を行うだけであることを覚えておくことが重要です。
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概要
このプロトコルでは、血液混入を最小限に抑えてマウスから脳脊髄液（CSF）を採取するための改善された手法について解説します。マイクロマニピュレーターを用いることで、サンプルの純度と採取量を向上させ、神経疾患におけるバイオマーカーのより精緻な分析を可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 脳脊髄液分析
- 神経疾患研究
背景
- CSFは、脳および脊髄に影響を及ぼす疾患を理解する上で極めて重要です。
- 採取時の血液混入は、研究結果に悪影響を及ぼす可能性があります。
- 採取方法を改善することで、バイオマーカー分析のためのサンプルの完全性を高めることができます。
- 本手法は、神経変性疾患の研究を促進することを目的としています。
研究目的
- マウスから脳脊髄液（CSF）を回収するための信頼性の高い手法を確立すること。
- 回収プロセスにおける血液混入を最小限に抑えること。
- 神経疾患バイオマーカーのより正確なモニタリングを可能にすること。
使用した手法
- 本手法では、大槽（cisterna magna）から脳脊髄液（CSF）を精密に採取するために、ガラスキャピラリーを備えたマイクロマニピュレーターを使用します。
- マウスに適切に麻酔を施し、外科的手技を用いて大槽を露出させ、キャピラリーを挿入します。
- マルチオミクスワークフローへの言及はなく、CSFの採取に焦点を当てています。
- 習熟すれば、この手順は約1時間で完了させることができます。
- 採取後のCSFは、保存のためにプロテアーゼ阻害剤と混合します。
主要な結果
- この手法により、10分から30分の間に10から15 µLのCSFを採取することが可能です。
- APP/PS1マウスから採取したCSFでは、12ヶ月時点でヒトA beta 42レベルの有意な上昇が認められました。
- 野生型マウスのサンプルからは、A beta 42は検出されませんでした。
- 本手順の効率性と、血液混入を回避できる能力が実証されました。
結論
- 本研究では、汚染を最小限に抑えつつマウスからCSFを採取するための効果的な手法を提示します。
- 回収したCSFの純度と量が高まることで、神経疾患研究におけるバイオマーカー解析の精度を向上させることができます。
- これにより、神経疾患における脳脊髄液のダイナミクスへの理解を深めることに寄与します。
よくある質問
産業上の重要性
信頼性の高い脳脊髄液（CSF）の採取は、神経変性疾患研究におけるバイオマーカー探索において不可欠であり、サンプルの純度はデータの質および標的バリデーションの信頼性に直接影響します。本手法は、より高収量で低汚染なCSF抽出を可能にすることで、マウスを用いた神経科学のワークフローにおける重大なボトルネックを解消し、治療仮説のより堅牢なメカニズム的リスク低減を支援します。CSFの採取効率が向上することで、標的の同定から前臨床バイオマーカーモニタリングまでのトランスレーショナルな連続性が強化されます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値：メカニズム的な曖昧さを軽減した疾患関連システムにおけるバイオマーカー分析を通じて、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：ターゲットエンゲージメントおよびパスウェイ変調の経時的モニタリングのため、再現可能なCSF（脳脊髄液）へのアクセスを提供する。
- 予測的価値：ターゲットに関連する分子変化への信頼性を高めることで、バイオマーカーに基づくgo/no-go判断を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 定量的なバイオマーカーアッセイに適した精製CSFサンプルを提供し、スクリーニングの信頼性を向上させる。
- 運用的価値： サンプルの調製を標準化し、ダウンストリームの分析ワークフローにおけるばらつきを低減する。
- 拡張性： コホート全体で一貫したCSF回収を可能にし、アッセイのバリデーションと再現性をサポートする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳的な連続性：疾患に関連するモデルを用いて、発見から前臨床検証までの一貫したバイオマーカーの整合性をサポートします。
- メカニズム的なリスク低減：APP/PS1マウスにおけるヒトA beta 42などの標的バイオマーカーのモニタリングを可能にし、予測の信頼性を高めます。
- リスク調整後の前進：神経疾患モデルにおける検出可能なバイオマーカーの変化に基づいた、データ駆動型の進行決定を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、バイオマーカー解析のための信頼性の高い上流サンプル源を提供することで、ターゲットバリデーションとリード最適化の段階を橋渡しし、初期の創薬ワークフローに統合されます。
- 探索生物学：CSF中のバイオマーカー測定を通じて、仮説検証およびパスウェイの解明をサポートします。
- スクリーニング：化合物評価のため、一定の容量と純度を持つアッセイ可能なサンプルの生成を可能にします。
- 分析学：定量的バイオマーカー読取値（例：ヒト A beta 42）を提供し、条件間の比較分析を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ：CSFバイオマーカーの動態を、遺伝学的モデルにおける前臨床の疾患進行と結びつけます。
- エンタープライズ再利用：神経科学の探索プログラム全体で、CSF採取のための標準化された再利用可能な能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：よりクリーンで大量のバイオマーカーデータを通じて、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させます。
- 運用的価値：研究施設や研究間におけるCSF回収の再現性と標準化を強化します。
- 戦略的価値：汚染または不十分なサンプルによる実験の失敗を減らし、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：前臨床モデルにおける信頼性の高いバイオマーカー変動に基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にします。
実施上の留意点
- 毛細管を正確に配置するため、顕微外科およびマイクロマニピュレーター操作の専門知識が必要です。
- 解剖顕微鏡、立体定位固定装置、および液体操作器具への依存度が高くなります。
- 再現性を確保するため、外科的手技および回収プロトコルのチーム間での標準化が不可欠です。
- 他のモデルに適応させる場合、大後頭槽への到達性の違いにより、解剖学的な調整が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、操作者の習熟度への依存や、CSF回収量における生理学的な個体差が考えられます。
