Name: 脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶ マウス海馬スライスにおける神経樹状突起の2光子カルシウムイメージングとパッチクランプ記録を組み合わせた手法。シナプス入力統合時のカルシウム動態を高時空間分解能で観察し、樹状突起のコンパートメント化されたシグナリングを解析する。

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この作品は、健康の研究のカナダの協会、自然科学工学研究協議会 (レベル検出グラント)、サヴォイ財団によって支えられました。OC は、レベルから博士フェローシップによって支えられました。

動物保護委員会のラヴァル大学とカナダ評議会は、動物愛護の家畜福祉ガイドラインに従ってすべての実験を行った。
1. 事前準備 (オプション: 1 日を前もって準備)
<ol><li>人工髄液 (アプライド) ソリューション (各ノーマル、ショ糖と復旧ソリューション、1 L;テーブル 1を参照) の 3 種類を準備します。300 ± 10 mOsm25に溶液の浸透圧を調整し、氷点下に近いポイントにアプライド ショ糖をクール (0-4 ° C)。 注: 低ナトリウム切削ソリューション (アプライド ショ糖) の使用は、急性スライス26の表面的な層のニューロンの生存を保持できます。</li>
	<li>赤蛍光体 (例えば、Alexa 594) を含む修正プログラム ソリューションの 0.75 ml と緑の合成カルシウム インジケーター (例えば、オレゴン グリーンこれら 1;テーブル 1を参照)。Biocytin は、(表 1参照) 修正プログラム ソリューションの記録された細胞の形態学的同定をアドホックの記事が必要な場合に。</li>
	<li>280 ± 5 mOsm の解決策と pH 7.35 ± 0.5 の浸透圧を調整します。すべての回で冷蔵庫や氷の上のソリューションを保持します。 注: ダイナミック レンジと調査 Ca2 +イベントの性質は、カルシウム インジケーターの選択を前提する必要があります。</li>
	<li>≈ 2 μ m チップ (3-5 MΩ のピペット抵抗) と刺激ピペット ホウケイ酸シータ ガラス管 (のテーブルを参照からパッチ ピペット ホウケイ酸ガラス管 (材料の表を参照してください) からマイクロ ピペットの引き手を使用して、準備します。材料) 2-5 μ m の先端で。 注: 引き手フィラメント タイプとガラスの特定の種類のテスト結果がランプによって特定の直径と形状のピペットの引き手設定が異なります。</li>
</ol>2. 海馬スライス標本
<ol><li>マウスの麻酔 (P13 20; ひずみとマウスのセックスは対処されて実験的質問によって決まりますが) 1 ml のイソフルレン吸入麻酔室内紙タオルの上に置かれました。動物は麻酔深く動き、遅い呼吸の欠如によって証明されるよう、麻酔室からそれを削除し、ギロチンを使用しての首をはねます。</li>
	<li>鼻に頭蓋の後部からはさみの小さなペアで皮膚を切断することによって頭蓋骨を公開します。前レベルで穴を作るためのミニ骨 rongeurs の小さなペアを使用します。尾側吻側矢状縫合線に沿ってカットするはさみを使用しています。Rongeurs 各半球を覆う頭蓋骨を削除する各頭蓋骨フラップ、エレベーター方向および水平方向の背面を把握します。</li>
	<li>脳が完全に公開されている後は、小さいヘラを使って視神経を弱めます。頭蓋骨から脳を外し、酸素、冷たいアプライド ショ糖を含む継続的にシャーレに入れて (ショ糖濃度は表 1を参照)。<ol>
<li>古いマウスから組織が必要な場合は、脳抽出の前に冷えたアプライド ショ糖の 20 ml シリンジ (25 G) を使用して質の良いスライスを取得する心腔内灌流を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>抽出した動物の脳から海馬スライスを準備します。<ol>
<li>約 2 分氷でいっぱいのシャーレに濾紙片を配置、フィルター紙の上に脳を転送のための脳チルをしましょう。2 つの半球を解剖します。</li>
		<li>Vibratome テーブルの上に (方向、コロナ、横、または水平方向のスライスを取得する実験の目標によって決まります) 切り裂かれた半球を接着し、冷えた酸素アプライド ショ糖で満たされた vibratome トレイに没頭します。Vibratome クーラーを使用してまたは vibratome トレイの周りの氷を置くことによって 300 μ m 約 1 ° C の温度で厚さのスライスを作る。</li>
		<li>37 ° C に加熱酸素アプライド回復を含むバースの海馬 (半球あたり最大 6 スライス) が含まれているスライスを蓄積フラット ペイント ブラシを使用して、</li>
		<li>少なくとも 45 分アプライド回復風呂にスライスを残します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 細胞のホールセルパッチク ランプ記録
<ol><li>目的の下に風呂の場所で海馬スライスの設定 (倍率: 40 倍、開口数: 0.8) 二光子励起レーザ走査顕微鏡の。継続的にお風呂を灌流、酸素アプライド通常 2.5 〜 3 mL/分の速度で 30-32 ° C で加熱します。</li>
	<li>赤外線微分干渉コントラスト (IR DIC) または Dodt SGC 顕微鏡を使用して、そのサイズ、形状、および位置を使用して興味のセルを探します。 注: 対象となるニューロンの人口に応じてトランスジェニック マウス モデルは興味のセルを簡単に検索する使用できます。この場合、この手順は、蛍光光源の使用と代替可能します。</li>
	<li>(例えば、Alexa 594) 赤の蛍光体を含むアプライド標準溶液で刺激ピペットを入力します。</li>
	<li>先端が興味のセルと同じ地域にあるので、スライスの上に (電気刺激装置に接続) 刺激ピペットを設定します。</li>
	<li>修正プログラム ソリューションとパッチ ピペットを充填し、ヘッド ステージに貼り付けて後、興味のセルのすぐ上の先端は、スライスを設定します。</li>
	<li>三方活栓のシリンジの収まるし、プラスチック製のチューブを介してパッチ ピペットに接続します。パッチ ピペットに一定の陽圧を注入 (≈ 0.1 mL) 注射器を使用しています。活栓を「閉じる」位置にしてください。</li>
	<li>増幅器制御ソフトウェア モジュールをアクティブにし、「VC」ボタンをクリックしてして電圧クランプ モードに切り替えます。電気生理学的信号の取得の電気生理学データ集録ソフトウェア (例えばclampex) を開き、それを継続的に監視する必要のある正方形電圧パルス (5 mV、10 ms) を送信して「膜テスト」アイコンをクリックピペット抵抗の変化。</li>
	<li>対象のセルの右上までパッチ ピペットを下げます。作る時に細胞膜との接触、活栓を「開く」の位置に回すことによって、圧力を削除します。 注: 細胞膜との接触が検出されるときピペット抵抗わずかな増加 (≒ 0.2 MΩ) が、セルに小さなくぼみが肯定的な圧力によって引き起こされます。</li>
	<li>ピペット抵抗のソフトウェアによって提供される 1 GΩ に達するまで、コックに装着空の注射器を使用してパッチ ピペットにわずかな否定的な圧力を適用されます。データ集録ソフトウェアの ' 膜テスト ウィンドウでクランプ-60 でセル mV。</li>
	<li>セルを開けて全体セル構成を達成するまで否定的な圧力を適用することを続行します。このセルの状態の検出は (介在ニューロンの種類に応じて 70 500 MΩ に 1 GΩ) からピペット抵抗と ' 膜テスト ウィンドウで大きな静電容量過渡の外観の急激な変化に基づいています。</li>
</ol>4. 二光子励起 Ca2 +イメージング
<ol><li>興奮性のシナプス応答に興味がある場合、GABAAの受容体ブロッカー gabazine (10 μ M) と GABAB受容体拮抗薬 CGP55845 追加 (2 μ M) アプライドお風呂に。</li>
	<li>増幅器制御ソフトウェア モジュールの「CC」ボタンをクリックしてして現在のクランプにパッチを設定および脱分極電流体注射に応答細胞の発火パターンを記録 (0.8 〜 1.0 nA, 1 s)。修正プログラム ソリューションのインジケーターを格納するセルの少なくとも 30 分を待ちます。 注: セルの発火パターンとアクティブなプロパティ使用できます。 セルのサブタイプを識別するために例えば細胞の高速スパイクします。レコード猫 (トラブルシューティングの表 2を参照) を始める前に拡散を安定させるために指標濃度が重要です。</li>
	<li>AP 誘発猫<ol>
<li>画像集録ソフトウェアを使用して画像を取得を開始します。赤い蛍光性信号を使用して興味の樹状突起を探します。表示される応答を確保するため、AP 誤差逆伝搬効率が大幅低下する gaba 作動性介在ニューロン22で距離をまず、近位樹状突起 (≤ 50 μ m) を選択します。</li>
		<li>画像集録ソフトウェアの「長方形ツール」を使用して、対象となる領域拡大し、を切り替える、「xt" (ライン スキャン) モード。目的の樹状突起の分岐間でスキャンの位置。集録ソフトウェアのレーザー強度コント ローラー、2 光子レーザー ベースライン緑蛍光は光毒性を避けるために、少しだけ目に見える最小の電力レベルで設定します。</li>
		<li>電気生理学データ集録ソフトウェア プロトコル] ウィンドウ、画像集録ソフトウェアで必要な振幅の体細胞電流注入を含む希望の期間の記録試みを作成します。<ol>
<li>画像集録ソフトウェアを使用すると、「記録開始」ボタンをクリックし、、3-10 回 1-2 s. 繰り返し継続的に蛍光画像の取得を取得。光損傷を避けるために単一スキャンの間待機、少なくとも 30 秒。デンドライトの複数のポイントでエネルギーを集録する場合は、順序効果を避けるためにランダムな順序でそれらを取る。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>シナプス誘発猫<ol>
<li>赤い蛍光性信号を使用して興味の樹状突起を探します。</li>
		<li>興味の樹状突起上のスライスの表面に刺激ピペットを設定します。刺激ピペットは全体構成を脅かさないよう動きを最小限に抑え、所定の位置にゆっくりと下ろします。位置、樹状突起から 10-15 μ m でピペット。</li>
		<li>画像集録ソフトウェアの aspiny の樹状突起でシナプス ミクロ相分離構造の場所を視覚化するに切り替えて、'xt' (ライン スキャン) モードに沿って目的の樹状突起分岐線の位置。</li>
		<li>(電気生理学データ集録ソフトウェア) の [プロトコル] ウィンドウ、画像集録ソフトウェア試用開始後刺激ユニットをトリガー記録試用版を作成します。</li>
		<li>30 を待っている 3-5 回、1-2 s. リピート獲得のために継続的に樹状突起に沿ってスキャンする「記録開始」ボタンをクリックして取得ソフトウェアを使用して光損傷を防ぐためにスキャンの間 s。 注: スキャンの長さは、誘発イベントの速度によって調整することができますが、光損傷を防ぐために最小限に抑える必要があります (トラブルシューティングの表 2を参照)。</li>
		<li>さまざまな条件 (例えば刺激の強度/長さが異なる、薬理学的ブロッカー等の導入) で取り上げられている特定の質問に応じて、4.5.5 手順を繰り返します。</li>
		<li>集録を停止するとき、セルは、健康悪化の兆候を示しています:-45 下脱分極 mV、ベースライン (例えばブレブ、断片化; 参照表 2は樹状突起の形態学的劣化の Ca2 +レベルの増加トラブルシューティング)。</li>
		<li>細胞の形態に関する予備的な情報を入手して刺激ピペットの場所の記録を保持するには、赤のチャンネルにセルのz-スタックを取得します。取得ソフトウェアを使用して 'xyz'モードが含まれているすべてのプロセスとセル全体を画像に上下スタック制限を設定します。1 μ m で 'のステップのサイズを設定し、「記録開始」ボタンを使用してスタック取得を開始します。</li>
		<li>ときZ-スタックの取得が完了したら、ソフトウェアの「最大投射」オプションを使用して、スタックのすべての焦点の計画を重ね合わせるし、、買収の品質を確認します。その後、スライスからパッチ ピペットをゆっくりと上げます。</li>
		<li>アドホックの記事の形態学的同定のためのスライスを修正するには、すぐにフラット ペイント ブラシを使用して風呂からスライスを削除し、アプライドで満たされたシャーレ内の 2 つのフィルター ペーパー間に配置。4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューション、アプライドに置き換える、4 ° C の部屋や冷蔵庫では、料理を一晩置いておきます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.ポストアド ホック記録された細胞の形態学的同定のための免疫組織化学
注: PFA の固定 1 泊後スライスに格納できるリン酸バッファー (PB) アジ化ナトリウム (0.5%) と 1 ヶ月。
<ol><li>トリス緩衝生理食塩水液 (TBS) トリトン X-100 (0.3%) とのスライスを入れて、4 洗浄 (5-10 分ごと) を実行します。</li>
	<li>TBS トリトンのスライスを入れて 1 時間 10% ヤギ血清 (NGS) の 0.3%。</li>
	<li>0.3 %tbs トリトンのスライスを入れて 1% により、NGS とストレプトアビジン共役のため蛍光 (例えば、Alexa Fluor 546 共役ストレプトアビジン、1: 200) 一晩培養します。</li>
	<li>4 を洗う時間 TBS で (5-10 分)</li>
	<li>顕微鏡のスライドと共焦点顕微鏡を用いたイメージ スライスをマウントします。完全な細胞再構成をしてZを取得-スタック (ステップ サイズ: 1 μ m) 20 × 対物を使用します。Alexa-546 共役ラベルをイメージング、543 nm レーザーと 515 560 nm 検出フィルターの使用を設定します。</li>
</ol>6. 猫の解析
<ol><li>赤と緑のチャンネルからライン スキャン画像に関心 (ROIs) の地域から蛍光値を抽出し、ノイズを低減する条件ごとに複数の繰り返しの値の平均します。 注: 樹状突起上ライン スキャン取得が実行されると、それは樹枝状ミクロ相分離構造 (2-5 μ m) に対応して可能性があります、複数 Roi からデータを抽出することが可能と Ca2 +シグナル区画の研究。</li>
	<li>各 roi として Ca2 +振幅の変化を表します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> 注: ここで G はグリーン チャンネルから蛍光値G0はグリーン チャンネルからベースライン蛍光値で前刺激期間中R は赤のチャンネル18から蛍光値です。2 光子励起は非常にローカライズされた重要な背景を生成しません、背景の蛍光性の加減は必要ありません。</li>
</ol>

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著者ない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係があります。

ここに示すメソッドでは、勉強して樹状 Ca2 +急性脳スライスにおける神経樹状突起におけるシグナル伝達のための 2 光子励起 Ca2 +イメージングとパッチ ・ クランプ電気生理学の組み合わせの使用方法を示します。このメソッドは両方ローカル Ca2 +標高樹枝状のセグメントと細胞の体細胞応答に電気刺激や逆伝搬 AP により誘発されるを監視することができます。樹状ツリーのさまざまな部分の入力を統合し、相馬と通信を勉強する優れたツールとなります。実験の長さを考えると、特に注意は細胞の健康に樹状突起の光損傷を避けるためにイメージングのためのレーザー パワーの使用を制限することによって支払われる必要しますが、あります。これは、ズーム レベルを減少させる、スキャンの期間を短縮、画像集録時にスキャンの速度を増加しても達成できます。介在ニューロンの樹状突起を画像追加の問題が生じます。これらの細胞の樹状突起に棘があるないように、樹状突起に沿ってスキャン シナプス Ca2 +ミクロ相分離構造のローカリゼーションを促進する推奨します。さらに、高い内因性 Ca2...

ニューロン ネットワーク活動への貢献はそれが受け取るシナプス入力の動的な性質によって決まります。伝統的に、シナプス電流通路の軸索の電気刺激による誘発の体全体セル ホールセル記録するニューロンのシナプスの特性の優勢な方法に依存。ただし、近位に位置するシナプスの唯一の活動は正直このケース1で報告されます。さらに、シナプス固有のメカニズムを評価するためにニューロンのペアから、特定の場所に樹状突起からの録音はそれぞれ関心のシナプスと樹状突起の統合のメカニズムをターゲットに使用されています。画期的シナプスの生理学の分野では、光学的および電気生理学的手法の結婚によって達成されました。2 光子励起レーザ走査型顕微鏡 (2PLSM) Ca2 +イメージングと光遺伝学的ツールとの組み合わせでシナプスで脳スライスで特定の神経接続でのダイナミックな組織の途方もない詳細が明らかに体外とin vivo。
複数の主利点を作った 2PLSM、従来の 1 光子励起顕微鏡2から目立つ: (1) 二光子励起の非線形性質のため、蛍光が焦点のボリュームでのみ生成され、すべて放出される光子を表す有用な信号 (ピンホールのない必要);(2) より長い波長、2PLSM で使用される浸透散乱組織より効率的に;さらに、光子、2 光子励起とバック グラウンド蛍光; あまりにも希薄(3) 生成や毒性また焦点平面に制限されます。したがって、従来の共焦点顕微鏡と比較すると 2 光子システムの高コストは、にもかかわらず、2PLSM 太い生体組織における神経細胞の構造と機能の高解像度の調査のための選択の方法のまま。
散乱体内の 2PLSM の最初のアプリケーションは、樹状突起スパイン3の機能と構造のイメージをだった。Ca2 +イメージングとの組み合わせで 2PLSM として分離された生化学的なコンパートメントで棘関数を明らかにしました。以来、さまざまな神経棘と個々 のシナプス4の間の一対一の対応がある、二光子励起 Ca2 +イメージングすぐになった便利なツールそのまま組織5、個々 のシナプスの活動報告 6,7,8。さらに、2PLSM ベースの Ca2 +イメージングがうまく使われた単一カルシウム チャネルおよび組み込みとシナプスのコンダクタンスの非線形相互作用の活動を監視するし、状態とアクティビティに依存を評価するにはCa2 +シグナル神経樹状突起5,6,7,8,9,10,11の規則。
ユビキタス細胞内二次メッセンジャーであり、その細胞内の時空間的構成イオンの調節するシナプス強度の変化からの生理学的反応の方向を決定するカルシウム チャネル、デンドライトと背骨の成長としてなく、細胞死、生存。複数経路の活性化を介して樹状 Ca2 +上昇が発生します。活動電位 (Ap)、樹状突起を逆伝搬は、電位依存性カルシウム チャネル12を開き、樹状突起と棘13で比較的大域的な Ca2 +トランジェント (猫) を生成します。シナプス伝達はシナプス後 Ca2 +活性化に関連付けられて-透水性受容体 (NMDA、Ca2 +-透水性 AMPA とカイニン酸)、6、14,15猫シナプスのトリガーします。最後に、特定の条件11,12,13,16の下で樹状突起で超直線性 Ca2 +イベントを生成できます。
パッチ ・ クランプ記録との組み合わせで二光子励起 Ca2 +イメージングを採用しています合成 Ca2 +-通常は全細胞記録中にパッチ電極経由で配信される機密の蛍光インジケーター.Ca2 +動態の定量化のための標準的な方法は、デュアル表示法17,18に基づいています。よく分離発光スペクトルと 2 つの同時を使用して (例えば、赤い Ca2 +の組み合わせ-緑の Ca2 +インジケーター オレゴン グリーンこれら 1、蛍光色 4 などと区別しない染料) に比べていくつかの利点があり、単一指示薬法。最初に、Ca2 +-に依存しない染料を使用、Ca2 +イメージングを実行する (樹枝状の枝、棘) 興味の小さい構造を検索します。第二に、緑と赤の蛍光 (ΔG/R) の変化比が大きく変動する [Ca2 +]017ベースライン蛍光の変化に敏感である [Ca2 +]、メジャーとして計算されます。,18します。 さらに、蛍光変化は絶対 Ca 2 +濃度19面でキャリブレーションできます。
急性スライスで二光子励起 Ca2 +イメージング実験を実行する場合の一般的な心配は細胞の健康と高レーザー出力の通常使用による画像取得の安定性。さらに、Ca2 +イメージング実験である摂動法と細胞内 Ca2 +動態の実質的な過大評価懸念 Ca2 +インジケーターとして高度なモバイル外因性 Ca2 +という事実のためにバッファー。したがって、Ca2 +インジケーターとその濃度の選択は、神経型、猫の予想される振幅と実験の質問によって異なります。
我々 は樹状突起における gaba 作動性介在ニューロン9,10、11,20,21 Ca2 +変動の調査の 2 光子励起 Ca2 +イメージング法を適応,22. 抑制介在ショーケース多種多様な錐体細胞20のそれらとは異なる機能性の Ca2 +メカニズムの初期 Ca2 +イメージング研究の大部分は、主ニューロンで行われた中、,23,24. これらの介在ニューロン固有のメカニズム (例えばCa2 +透過性 AMPA 受容体) は、細胞活性の調節に特定の役割を果たすことがあります。二光子励起 Ca2 +イメージングでこれらの細胞の樹状突起が薄く直径樹状突起と棘の欠如から、追加の課題を提示樹状 Ca2 +シグナル介在ニューロンは詳しい調査のための魅力的なターゲットが、特に内因性 Ca2 +結合能力が高い。私たち研究の海馬介在の研究の焦点、次のプロトコル間異なる神経細胞の集団に適用したこれらの課題に対処する適応
このプロトコルは、2 つの外部の非 descanned 探知機 (NDDs)、電気光学変調器 (EOM) とグラデーション コントラスト (SGC) をスキャン Dodt を装備され、光学テーブルにインストールされて商業共焦点 2 光子顕微鏡、実行されました。顕微鏡 800 モード同期チタンサファイアレーザー多光子と結合されていました (> 3 W、140 の fs パルス、80 Hz の繰り返し率) の nm。イメージング システムは、温度制御、2 つのマニピュレーターを持つ翻訳プラットフォーム、コンピューター制御電極アンプ、デジタイザー、刺激と灌流チェンバを含む標準的な電気生理学のリグが装備されていた単位、およびデータ集録ソフトウェア。

<table><tbody><tr><td>動物系統:マウスCD1</td>チャー<td>ルズ</td><td>リバー022</td><td></td></tr>イ<tr><td>ソフルラン</td><td>アッヴィコーポレーション</td><td>0B506-099</td><td></td></tr><tr><td>CGP55845塩酸塩</td><td>Abcamab120337</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末、95%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>グルコン酸カリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>トリズマベース&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 塩酸塩&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム二塩基性二水和物&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td> リン酸ナトリウム一塩基性 一水和物&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10438</td><td></td></tr><tr><td>SR95531 (Gabazine)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120042</td><td></td></tr><tr><td> アデノシン三リン酸 (ATP)-トリス</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td> グアノシン (GTP)-Na+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td> オレゴングリーン BAPTA-1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>O6812</td><td></td></tr><tr><td> ホスホクレアチンジ(トリス)塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td></td></tr><tr><td> ストレプタビジン結合 Alexa-546</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S11225</td><td></td></tr><tr><td> パッチホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>ワールド精密機器</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td> シータホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>サッター機器</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td> P-97 フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TCS SP5 共焦点多光子顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chameleon Ultra II Ti:Sapphire 多光子レーザー&nbsp;</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF イメージング取得ソフトウェア</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 温度コントローラー TC-324B</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MultiClamp 700B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1440A Digitizer</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Confocal翻訳者</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> マイクロマニピュレーター</td><td>Siskiyou</td><td></td><td></td></tr><tr><td> pClamp データ収集ソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> A365 定電流刺激アイソレーター</td><td>ワールド精密機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 振動機 光学テーブル</td><td>キネティックシステム</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

カルシウム (Ca2 +) 画像は、神経樹状突起における細胞内 Ca2 +シグナルの時空間ダイナミクスを調べるための強力なツールです。Ca2 +変動は様々 な膜と細胞内メカニズムを介して発生するでき、樹状の興奮性のシナプス可塑性の誘導と制御に重要な役割を果たします。したがって、樹状突起の分岐で Ca2 +シグナルの種類を記録する機能は樹状突起が情報を統合する方法を研究するグループの貴重です。2 光子顕微鏡の出現は、症状や光散乱などの生体の画像に固有の問題を解くことによって、このような研究を大幅に簡略化は。また、2 光子 Ca2 +イメージングと従来の電気生理学的手法の組み合わせによるローカル Ca2 +変動録音と並行して神経細胞の樹状突起でのシナプスを調査することが可能です。相馬。ここでは、gaba 作動性抑制性介在神経細胞の樹状突起にローカル Ca2 +トランジェント (猫) のダイナミクスを研究するこのメソッドを使用する方法について述べる。メソッドは、樹状 Ca2 +急性脳スライスに異なる神経型シグナルの勉強にも適用できます。

ここで提示されたプロトコルを使用して、体の電流注入によると海馬の CA1 野オリエンス/alveus 介在ニューロンの樹状突起に電気刺激による誘発猫を得られます。複数のポイントで近位樹状突起全体エネルギーを培ってニューロンは、特定のパッチの形状と位置に基づく後で相馬 (図 1 a) から距離が与えられます。相馬の増加 (減少の AP 振幅またはカルシウム チャネル流通、図 1 bの距離依存性低下を示す) からの距離の逆伝搬 Ap による猫の振幅の減少を見ました。免疫組織化学 (Alexa Fluor 546 のストレプトアビジン共役を使用) 後、セルの biocytin ラベルを取得し、占領オリエンス地層と地層結腸寄生虫 (図軸索と解像セルとして記録されたニューロンを識別することができました1 C). 2 番目の実験では、刺激のピペットは遠位樹状サイトにもたらされました。樹状突起上をスキャンする...

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2 光子イメージングを組み合わせた手法を提案します。

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

この実験の全体的な目標は、樹状突起の2光子カルシウムイメージングと並行して、ニューロン体細胞の全細胞パッチクランプ記録を使用して、さまざまな刺激パラダイムに応答したニューロン樹状突起のカルシウム上昇を研究することです。この方法は、小さな樹状突起コンパートメントのカルシウムシグナル伝達をモニターするために採用することができ、シナプス入力の統合中に樹状突起枝で発生するプロセスを綿密に観察することができます。この手法の主な利点は、カルシウムシグナル伝達パターンを高い時空間分解能と特異性で観察できることです。マウスの脳を、連続的に酸素化された冷たいACSF-スクロースが入ったシャーレの上に置きます。抽出した脳から海馬スライスを準備するには、脳を約2分間冷やします。その後、氷で固めたペトリ皿に濾紙を置き、脳を濾紙に移します。次に、脳を2つの半球に分解します。解剖した半球をビブラトーム切片作成プラットフォームに接着し、氷冷酸素化ACSFスクロースで満たされた切片トレイに浸します。続いて、ビブラトームクーラーを使用して厚さ300マイクロメートルのスライスを摂氏1度で切片にするか、ビブラトームトレイの周りに氷を置きます。ペイントブラシを使用して、海馬を含むスライスを摂氏37度に加熱した酸素化ACSF回復槽に移します。このステップでは、レーザー走査型2光子顕微鏡の対物レンズの下で海馬スライスを浴に移します。酸素化されたACSFでバスを継続的に灌流します-正常。次に、赤外線微分干渉コントラスト顕微鏡を使用して、そのサイズ、形状、および位置を使用して目的のセルを見つけます。その後、刺激ピペットに赤い蛍光色素を含むACSFノーマル溶液を入れます。スライスの上に下げて、先端が目的のセルと同じ領域にくるようにします。その後、パッチピペットにパッチ溶液を充填し、ヘッドステージに取り付けます。その先端が目的のセルの真上にくるように、スライスの上に置きます。次に、注射器を三方活栓に取り付け、プラスチックチューブを介してパッチピペットに接続します。パッチピペットに一定の正圧を注入し、ストップコックを近い位置に保ちます。次に、MultiClamp amplifier制御ソフトウェアモジュールを開き、VCボタンをクリックして電圧Clampモードに切り替えます。電気生理学的信号を記録するための電気生理学Clampexデータ収集ソフトウェアを開き、メンブレンテストアイコンをクリックして、ピペット抵抗の変化を監視するための一定の方形電圧パルスを送信します。次に、パッチピペットを標的細胞の真上に来るまで下げます。細胞膜に接触したら、ストップコックを開位置に回して圧力を取り除きます。次に、ストップコックに取り付けた空のシリンジを使用して、ピペットの抵抗が1ギガオームに達するまで、パッチピペットにわずかな負圧を加えます。データ集録ソフトウェアのMembrane Testウィンドウで、セルをマイナス60ミリボルトでクランプします。ピペットの抵抗が下がり、細胞全体の構成が達成されるまで、負圧を印加し続けます。MultiClampアンプ制御ソフトウェアモジュールでは、ICボタンをクリックしてパッチ構成を電流クランプに設定し、過分極電流と脱分極電流の体細胞注入に応じたメンブレン特性を記録します。パッチ溶液に存在するインジケーターがセルに入力されるまで、少なくとも 30 分待ちます。画像を取得するには、赤色蛍光シグナルを使用して目的の樹状突起を特定します。APの逆伝播効率はGABA作動性介在ニューロンの距離とともに大幅に低下する可能性があるため、50マイクロメートル未満の近位樹状突起を選択することで目に見える応答を確保し、xtモードに切り替えます。レーザー強度コントローラーを使用して、2光子レーザーをベースラインの緑色蛍光がわずかに見える最小出力レベルに設定し、光毒性を回避します。続いて、Clampex電気生理学データ収集ソフトウェアプロトコルウィンドウおよび画像取得ソフトウェアで、所望の振幅の体細胞電流注入を含む所望の持続時間の記録試行を作成する。その後、 レコードを開始 ボタンをクリックし、蛍光を1〜2秒間連続して取得します。画像取得を3〜10回繰り返します。光による損傷を避けるために、1回のスキャンの間に少なくとも30秒待ちます。電気刺激によって誘発される樹状突起カルシウム過渡現象を記録するには、赤色蛍光シグナルを使用して目的の樹状突起を特定します。刺激ピペットを目的の樹状突起の上のスライスの表面にセットします。刺激ピペットを樹状突起から10〜15マイクロメートルゆっくりと下げ、動きを最小限に抑えて細胞全体の構成を乱さないようにします。棘状ニューロンのシナプス微小ドメインの位置を視覚化するには、画像取得ソフトウェアでxtモードに切り替え、目的の樹状突起枝に沿って線を配置します。「プロトコル」ウィンドウで、刺激をトリガーする記録試行を作成します。取得ソフトウェアを使用して、樹状突起に沿って1〜2秒間連続してスキャンします。撮影を3〜5回繰り返し、スキャンの合間に30秒空けて光ダメージを防ぎます。細胞の形態に関する予備情報を取得し、刺激ピペットの位置を記録するには、赤チャネルの細胞のZスタックを取得します。xyzモードで取得ソフトウェアを使用して、スタックの上限と下限を設定し、すべてのプロセスを含むセル全体をイメージングします。次に、ステップサイズを1マイクロメートルに設定し、[Start Record]ボタンを使用してスタック取得を開始します。Zスタックの集録が完了したら、ソフトウェアの[最大投影]オプションを使用して、スタックのすべてのフォーカルプランを重ね合わせ、集録の品質を確認します。次に、パッチピペットをゆっくりとスライスから引っ込めます。事後形態学的同定のためにスライスを固定するには、ペイントブラシを使用してスライスをバスからすばやく取り出し、ACSFを充填したペトリ皿の2つの濾紙の間に置きます。ACSFを4%パラホルムアルデヒド溶液に交換し、皿を摂氏4度で一晩放置します。この図では、2光子Zスタックの最大投影は、Alexa-594で満たされたパッチ化された介在ニューロンを示しています。白い矢印は、錐体層内の軸索終末の位置を指しており、介在ニューロンがバスケット細胞であることを示唆しています。この図は、刺激電極が近くに配置された樹枝状突起を示しています。破線は、スキャンしたラインの位置を示しています。次の図は、赤と緑のチャネルでのラインスキャンの結果を示しています。刺激時の緑色蛍光の上昇は、その領域のカルシウム濃度の上昇を示しています。画像は小さなセグメントにビン化できるため、応答の広がりを分析できます。ここで見られる痕跡は、イメージング試験中に体細胞レベルで記録された電気刺激に応答して、さまざまなセグメントで誘発されるカルシウム過渡現象を示しています。カルシウム過渡現象の振幅は、中心ホットスポットからの距離とともに減少し、応答が空間的に局在していることを示しています。この手順に続いて、電位感受性色素イメージングやオプトジェネティクスなどの他の方法を実行して、樹状突起枝内のメモリ電位の局所的な変化や特定の入力の統合などの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、光生理学的手法を組み合わせてニューロン樹状突起の活動依存性カルシウム変動をモニタリングする方法を十分に理解できるはずです。これは、樹状突起入力の統合と可塑性の複雑さを探るのに役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

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学ぶ マウス海馬スライスにおける神経樹状突起の2光子カルシウムイメージングとパッチクランプ記録を組み合わせた手法。シナプス入力統合時のカルシウム動態を高時空間分解能で観察し、樹状突起のコンパートメント化されたシグナリングを解析する。

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング

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