郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの蛹の卵巣を解剖して染色することです。この方法は、モデル生物ショウジョウバエの幹細胞分化や組織発生に関連する問題など、生物学の発展における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、カスタマイズ可能なツールを使用して、他の方法では分離が困難な蛹の卵巣の小型で半透明の性質に対応することです。

私たちは、彼の方法を使用して、蛹のショウジョウバエの発生中に卵巣の幹細胞分裂を追跡するために、タイムコース実験を行うというアイデアを持っていました。プロトコルを開始するには、酵母を補給した通常の豊富なフライフードのバイアルに、10匹のオスと15匹のメスの成虫ショウジョウバエを組み合わせます。卵が室温で3〜4日間幼虫に成長するのを待ちます。

3〜4日後、柔らかい毛の湿った細いブラシを使用して、バイアルの壁に沿ってブラシで転がる動きをし、さまよう3番目の幼虫をバイアルからガラスウェルに移し、1Xリン酸緩衝生理食塩水またはPBSで縁まで満たします。幼虫から食物の残骸を洗い流し、1X PBSで満たされた別の井戸に移します。鉗子でオスとメスの幼虫を分離します。

オスの幼虫は、前端から3分の2下の外側の脂肪体に埋め込まれた大きな丸くて半透明の精巣のペアによって識別されます。次に、井戸から少なくとも10匹の雌を集め、雌の幼虫を1X PBSで満たされた別の井戸に入れます。鉗子を使用して、雌の幼虫を酵母を補給した新鮮なフライフードの新しいバイアルに優しく移します。

雌の幼虫が入ったバイアルを暗い場所に置いて、蛹化を促進します。一日中、幼虫の蛹化を監視します。各幼虫が葉化して前蛹に成長するにつれて、前蛹をバイアルに対して円で囲み、最初に前蛹に形成されるおおよその時間を記録します。

ペスターピペットのガラス先端をブンゼンバーナーで溶かします。ガラスが溶けたら、鉗子を使用してチップをピペットの他の部分から水平に引き離し、より細いチップを形成します。冷却後、ピペットの先端の小さな部分を折って、きちんとした円形の開口部を形成します。

ピペットのもう一方の端に電球を取り付け、ピペットに1X PBSをロードします。バイアルの壁に接着された蛹を収穫するには、蛹とバイアルの間の接触ゾーンに沿って少量の水滴を塗布します。タンパク質接着剤を1〜2分間溶かした後、湿らせた細いブラシで蛹を壁からそっと持ち上げます。

1X PBSで満たされたウェルごとに1匹の蛹を移します。1対の鉗子で蛹の後端をつかみながら、もう1対の雌羊ケースの前部を蛹の頭が見えるまで慎重に引き裂きます。蛹の頭の最前端を鉗子でつかみ、蛹を蛹ケースからそっと引き出します。

次に、蛹の前半分を後半分から分離して捨て、腹部嚢だけが残るまで捨てます。片手で鉗子で腹部嚢をウェルの底につかみ、もう片方の手で1X PBSを充填した薄いガラスピペットを持ちます。細いピペットの先端を嚢の開口部に向け、1X PBSを腹部にゆっくりとピペットで注入して、蛹の卵巣を取り巻く脂肪体細胞を洗い流します。

脂肪体の少なくとも3分の2がなくなるまで、または腹部嚢の開口部の近くに卵巣が見えるまで、脂肪体細胞を洗い流します。卵巣が井戸の内側に見えない場合は、腹部に残っているはずです。卵巣が出てきた場合は、新しい蛹を井戸に入れ、この手順を繰り返します。

固定緩衝液で満たされた透明な蓋付きガラスチャンバーに腹部を移し、蓋を上に置きます。染色およびマウントプロセスで十分な数の卵巣が立つように、必要以上に卵巣を解剖します。染色プロセス全体を通して、鉗子を使用して浮遊卵巣を蓋付きのガラスウェルの底にそっと押し下げ、卵巣が抗体溶液に完全に浸されていることを確認します。

新しい力価の平らな面に両面テープのストリップを貼り、次に卵巣と固定緩衝液を含むチャンバーカバーガラスを接着面に置きます。卵巣を固定緩衝液中で室温で15分間インキュベートします。次に、1%Triton X-100または1%PBSTを使用して1X PBSで卵巣を3回、10分、45分間すすぎ、完全な透過化を行います。

卵巣を0.5%PBSTの10%正常ヤギ血清に30分間ロックします。.次に、卵巣を600マイクロリットルの一次抗体(0.5%PBST、摂氏4%)で一晩インキュベートします。翌日、0.5%PBSTで卵巣を3回、5分間それぞれすすぎます。

室温で0.5%PBSTに希釈した600μLの二次抗体で卵巣を2時間インキュベートします。インキュベーション後、卵巣を0.5%PBSTで5分間2回、1X PBSで5分間1回すすぎます。顕微鏡スライドに1X PBSを少量滴下します。

鉗子を使用して、腹部嚢をチャンバーカバーガラスから1x PBSで十分に充填されたガラスに移します。鉗子で腹部嚢と残りの脂肪体を引き裂きます。鉗子の先端の間の卵巣の中心をつかむことにより、顕微鏡スライド上の1x PBSの滴にウェルから卵巣を移します。

溶液が乾いたら、スライドに1X PBSを数滴加えます。すべての卵巣を解剖し、顕微鏡スライドに移したら、40マイクロリットルの封入剤を22 x 22 mmのカバースリップにピペットで移し、カバースリップを卵巣の上にそっと置きます。最後に、イメージングする前にスライドを一晩乾かします。

リン酸化ヒストンH3染色など、細胞増殖に特異的な免疫組織化学は、幹細胞やその他の有糸分裂活性細胞タイプの細胞分裂パターンの研究に使用できます。群細胞に由来する蛹茎細胞は、Fasciclin III染色で輪郭を描くことができます。この手順を試みている間は、脂肪体抽出または免疫組織化学プロセス中にいくつかの卵巣が失われる可能性があることを考慮して、実験に必要な量よりも多くのPBを採取して解剖するのが最善です。

ご覧いただきありがとうございます、そして実験の頑張りを祈ります。