Name: Γ セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質と細胞を用いたルシフェラーゼ レポーター アッセイ プラットフォーム ノッチ胸の谷間の定量的測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学ぶγ-セクレターゼ活性のルシフェラーゼレポーターアッセイ法。アミロイド前駆体タンパク質を用いた細胞ベースの定量測定で、アルツハイマー病治療薬のスクリーニングと基質選択性の解析に応用できます。

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著者は携帯研究所・生体生物学中央研究院、中核施設のテクニカル サポートをありがちましょう。本研究は、科学技術、台湾 (Y. f. で 103-2320-B-001-016-MY3 が最も省に支えられL.)、バイオ医薬開発-プラットフォームの軸を支える技術の橋渡しの革新のためのプログラム (Y. f. l. に NP7) 方式と中央研究院 (義-f. l.) に。

1. アプリ C99 または NΔE の γ セクレターゼ胸の谷間に対応するルシフェラーゼ レポーター信号の測定
注: は、CG と NG のセル20,21の世代の詳細な説明の前の出版物を参照してください。
<ol><li>
NG または CG のセルのシード (20, 000 細胞/ウェル) ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) プラス 10% ウシ胎児血清 (FBS)、5 μ g/mL ブラストサイジン 250 μ g/mL 抗生物質 (例えばで構成されている培地に 200 μ L/ウェルの最終巻で 96 ウェル マイクロ プレートに、zeocin)、および 200 μ g/mL hygromycin b.
	<ol>
<li>診断とセルをカウントします。</li>
		<li>加湿 CO2インキュベーターにプレートを転送し、37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>成長媒体の 100 μ L を各ウェルから削除します。</li>
	<li>成長の 100 μ L/ウェルを追加いずれか 0.2% ジメチルスルホキシド (DMSO)、2 μ M と 2 μ g/mL テトラサイクリンを含む中 CL 387,785、2 μ M N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t butylester (部)、またはその他関連 ErbB1/ErbB2 阻害剤。</li>
	<li>24 h の 37 ° C でマイクロ プレートに扱われた CG や NG セルを孵化させなさい。</li>
	<li>マイクロ プレートから 150 μ L/ウェル成長培地を削除します。</li>
	<li>50 μ L/ウェル ルシフェラーゼ アッセイ試薬を追加 (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>
発光マイクロ プレート リーダーにプレートを転送します。
	<ol>
<li>穏やかな攪拌を 5 分間室温でマイクロ プレートを維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ホタルのルシフェラーゼ (フロリダ州) を決定する-発光ルミネセンス マイクロ プレート リーダーに格納されている定義済みのプログラムを使用して出力されます。
	<ol>
<li>計測器制御ソフトウェアを開く (器械の細部の材料表を参照してください)。</li>
		<li>「ツール」メニューから 'Luminometry' を選択します。<ol>
<li>'パラメーター' 設定カウント時間の排出フィルター、排出絞りの目盛り '通常' を入力 '1' 'フィルターなし' を選択、ルミネセンス読み取りを設定するには、[ok] クリックします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>'計測器制御」タブの下アクティブなプロトコルのリストをスクロールし、発光を読み取るためあらかじめストアドのプロトコルを選択します。</li>
		<li>'ライブ表示' タブの下プルダウン ・ リストから尺度を定義し、型の '対数' または '線形' を選択します。</li>
		<li>'温度' タブの下には、プレート ヒーターの 'Off' を選択します。</li>
		<li>読んで発光を実行する「スタート」ボタンをクリックします。</li>
		<li>必要に応じて、制御ソフトウェアに埋め込まれた 'エクスプ ローラー' を使用してスプレッドシート形式に結果をエクスポートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 γ-セクレターゼ活性の定量化
<ol><li>
CG によって放出される発光信号または 100% の相対的な γ-セクレターゼ活性として単独で 1 μ g/mL テトラサイクリンを含む培地に 0.1 %dmso 処理 NG のセルを定義します。
	<ol>
<li>テトラサイクリンを含まない培地で細胞を処理することによってバック グラウンド CG や NG 細胞から発光を推定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ルシフェラーゼ 1 G/ml テトラサイクリンを含む培地で培養している CG や NG の細胞から信号を正常化し、細胞の DMSO 処理 CG や NG によって放出されるルシフェラーゼ信号部のいずれかの 1 μ M CL 387,785 または 1 μ (100% の相対的な γ-セクレターゼ活性として2.1 で定義)。</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J., Hardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease+at+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.</a> EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).</li>
<li>Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. <a target="_blank" href="http://jcs.biologists.org/content/120/18/3157">APP at a glance.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).</li>
<li>Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+cascade+hypothesis+for+Alzheimer%27s+disease%3A+an+appraisal+for+the+development+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).</li>
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<li>Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-secretase+enzyme+BACE+in+health+and+Alzheimer%27s+disease%3A+regulation%2C+cell+biology%2C+function%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential.</a> J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).</li>
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<li>Haapasalo, A., Kovacs, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+substrates+of+presenilin%2Fgamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">The many substrates of presenilin/gamma-secretase.</a> J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).</li>
<li>Gillman, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Evaluation+of+BMS-708163%2C+a+Potent%2C+Selective+and+Orally+Bioavailable+gamma-Secretase+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).</li>
<li>Hopkins, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACS+chemical+neuroscience+molecule+spotlight+on+Begacestat+%28GSI-953%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953).</a> ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).</li>
<li>Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gamma-secretase+modulation+differentiates+inhibitor+compound+selectivity+between+two+substrates+Notch+and+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein.</a> Mol Brain. 1, 15(2008).</li>
<li>McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cell-based+method+for+determining+the+gamma-secretase+enzyme+activity+against+both+Notch+and+APP+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates.</a> J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).</li>
<li>Basi, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+selective+gamma-secretase+inhibitors+for+treatment+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).</li>
<li>Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+small+molecular+%28D%29-leucinamides+as+potent%2C+Notch-sparing+gamma-secretase+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators.</a> Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).</li>
<li>Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha%2C+interleukin-1beta%2C+and+interferon-gamma+stimulate+gamma-secretase-mediated+cleavage+of+amyloid+precursor+protein+through+a+JNK-dependent+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway.</a> J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).</li>
<li>Wang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+regulates+autophagic+flux+to+modulate+the+proteostasis+of+APP-CTFs+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).</li>
<li>Sevigny, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibody+aducanumab+reduces+Abeta+plaques+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease.</a> Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).</li>
<li>Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Secretase+inhibitors+and+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">gamma-Secretase inhibitors and modulators.</a> Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).</li>
<li>Coric, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Prodromal+Alzheimer+Disease+With+Avagacestat%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial.</a> JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).</li>
<li>Mitani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+between+gamma-secretase+inhibitors+and+modulators+on+cognitive+function+in+amyloid+precursor+protein-transgenic+and+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice.</a> J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).</li>
<li>Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Agents+Targeting+gamma-Secretase+Increase+Risk+of+Cancer+and+Cognitive+Decline+in+Alzheimer%27s+Disease+Patients%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).</li>
</ol>

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広告 aducanumab 免疫療法のフェーズ 1 b 試験の有望な結果は広告22の病因における a β の重要な役割を定着させたし、抗 a β のアプローチがまだアンチ広告薬の開発のための実行可能な戦略であることを示唆しています。ここでは、アプリ C99 とホタル ルシフェラーゼ レポーター システムを使用して NΔE の γ セクレターゼ触媒分解を定量化するため細胞に基づく試金について述べる。アプリ C99 と NΔE 2 つの最もよく研究 γ セクレターゼ基板は、γ-セクレターゼ13の病原性および生理学的な活動を一緒に表します。我々 の調査結果分泌 β、γ-セクレターゼ本研究で説明の基質特異的細胞アッセイによって実証されてさらに、CL 387,785 によって ErbB2 のダウンレギュレーションは優先的にアプリ C99 の定常状態レベルを減らすことができます。現在のプロトコルは、したがって新規 γ-セクレターゼ変調器の発見のための効率化手法を提供します。
この γ-セクレターゼ特...

アミロイド β (a β) のオリゴマー フォーム1アルツハイマー病 (AD) 患者の脳の神経変性の主な原因と考えられています。Β-セクレターゼによって最初放置、γ-セクレターゼ2a β ペプチドがアミロイド前駆体タンパク質 (APP) の段階的な胸の谷間によって生成されます。過去 10 年間で AD の治療に対する治療のアプローチが a β の生産3の防止に焦点を当てた。研究の大半は、どちらかアプリの γ セクレターゼ胸の谷間を排除でき、a β の生産または β-及び/又は γ-セクレターゼ活動4の抑制により減少する α セクレターゼ活性の増強に焦点を当てています。残念ながら、β と γ セクレターゼ5,6の他の生理学的な基板の機能の干渉のため、やむを得ない副作用で β または γ セクレターゼ結果の非選択的阻害。Γ セクレターゼ阻害剤に関する最近の研究はノッチ7 の重要な γ セクレターゼによる処理にはほとんど影響を発揮しながら a β の生産を調節することができます化学および遺伝の変調器の数の発見を報告しています。 ,8,9,10、11,12, しかし、成功した治療法はまだ開発されていません。したがって、さらに体系的な画面が選択的に γ セクレターゼ仲介アプリ処理を調節する新規の遺伝物質と化学修飾子を発見する保証されます。
Γ-セクレターゼは、90 以上の異なる膜アンカー型蛋白質を裂くこと知られています。これらの基板間で切り込み、その活動は細胞の運命決定や分化開発13にとって重要です。ノッチに影響を及ぼす処理が γ セクレターゼ阻害剤の最小限に抑えるノッチ関連副作用のため不可欠になります γ セクレターゼ触媒のアプリがない場合は処理を選択的に調節することと、この選択性が主な要因と考えられています。広告の慢性の処置のための潜在的な γ セクレターゼ変調器の生物学的有効性を定めます。Arylsulfonamide 誘導体、GSI 953 (begacestat) や BMS-708163 (avagacestat)、γ-セクレターゼ14,15の強力かつ選択的な阻害が確認されたことなどの数がありました。以前の研究は、ゼブラフィッシュ16を使用して体内の検証との組み合わせで定量的な ELISA アッセイを使用してアプリやノッチの γ セクレターゼ胸の谷間の差分の抑制を観察できることを示しています。さらに、γ-セクレターゼ アプリとノッチの17,18への潜在的な基質選択性に対処するため細胞ベースのアッセイのパラダイムが確立されています。ここ、これらに類似のプロトコルを使用して、我々 は最近 (D) の新規クラスを発見した-leucinamides 強力ノッチ温存選択性19アプリの γ セクレターゼ胸の谷間を調節します。一緒に、研究のこのコレクションは、検証のための γ セクレターゼの基質選択性/可用性が化学変調と実験的検証の対象とすることができます概念をサポートを提供します。ただし、これらのアッセイのプラットフォームは、しばしば比較的低スループット リードアウトと創薬プログラムの産業基準を満たしていない可能性が労働集約的なアプローチに依存します。
最近、2 つの異なる基板、アプリ (アプリ C99) の 99 アミノ酸 C 末端フラグメントと、細胞外へ γ セクレターゼの活性を決定する定量的ルシフェラーゼの細胞を用いたレポータージーンアッセイを生成しました。ドメイン削除ノッチ ペプチド (NΔE)。アプリ C99 と NΔE の両方は、さまざまな試金で γ セクレターゼの直接基板として広く使用されています。アプリ C99 または NΔE の γ セクレターゼ胸の谷間に均一で一貫性のあるルシフェラーゼ レポータージーンアッセイを生成するには、恒常 Gal4 プロモーターに駆動されるホタルのルシフェラーゼ レポーター (を表す 1 つの安定 HEK 細胞ライン (CG) を生成しました。Gal4-Luc)、Gal4 VP16 タグ付きアプリ C99 融合蛋白質 (C99 GV)。さらに、我々 は恒常 Gal4 リュックと Gal4 VP16 タグ付き NΔE (NΔE-GV) を表現する別の安定した HEK 細胞ライン (NG) が生成されます。これらの新規基質特異的 γ-セクレターゼの試金を使用して、我々 は今を定量化し、異なる基板 (cg 基本セルでアプリ-C99) または NG 細胞における NΔE に向かって γ セクレターゼの活性を区別する方法を提供します。さらに、基質特異的 γ-セクレターゼの試金は高コンテンツ スクリーニング プラットフォームを助長すること設計されました。これらの新しく生成された γ-セクレターゼ試新規 γ-セクレターゼ変調器次世代治療のため望ましくないノッチ阻害を引き起こす事なく a β の生産を抑制することで認知機能を向上させることの発見の道を開くこと広告。

<table><tbody><tr><td>VictorLight 発光プレートリーダー</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0010</td><td></td></tr><tr><td>Class II, Type 2 生物学的安全キャビネット</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>CL-387,785</td><td>EMD Calbiochem</td><td>233100-1MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Merck</td><td>565770</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'サーモ</td>フィ<td>ッシャー</td><td>12100046</td><td>成長培地の主な成分</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>ブラストシジン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>ゼオシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>R25005</td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB</td><td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>血球計算量</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717805 Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルマイクロプレート</td><td>Nunc</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo ルシフェラーゼアッセイ試薬</td><td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>加湿 CO2インキュベーター</td><td>Revco</td><td>Ultima II</td><td></td></tr><tr><td>T-REx293細胞株</td><td>Invitrogen</td><td>R71007</td><td></td></tr><tr><td>Wallac 1420 ソフトウェアバージョン 3.0</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>発光マイクロプレートリーダーの装置制御ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

Γ セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質と細胞を用いたルシフェラーゼ レポーター アッセイ プラットフォーム ノッチ胸の谷間の定量的測定

Quantitative Measurement of &#947;-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms

異なる基板の γ セクレターゼ胸の谷間を定量化するセルベースのレポーター遺伝子アッセイのペアを開発しました。本稿では、アプリ C99 のノッチ、Gal4 プロモーターに駆動されるホタル ルシフェラーゼ レポーター システムを使用して γ セクレターゼによる胸の谷間を監視するために使用可能性があります手順について説明します。これらの試金は安定株 Gal4 駆動ルシフェラーゼ レポーター遺伝子とアプリ (アプリ C99; のいずれか Gal4/VP16 タグ C 末端フラグメント HEK293 細胞が共同で設立されました。Cg 基本セルの場合)、または、Gal4 VP16 タグ付けのノッチ-ΔE (NΔE;NG のセル)。並列でこれらのレポーターの試金を使用して、我々 はことを示している ErbB2 阻害剤、CL 387,785、優先的に cg 基本セルでアプリ C99 が NG の細胞でない NΔE γ-セクレターゼ胸の谷間を抑制できます。CL-387,785 で処理する CG と NG の細胞によって展示差動応答 γ セクレターゼ変調器の最寄りの特性を表し、これらの応答は、γ-セクレターゼ部による抑制パンとは対照的。私たちの研究は、携帯電話のコンテキストで異なる基板上に向けた γ セクレターゼ活動を鑑別できることの直接の証拠を提供します。これらの新しいアッセイしたがって改善の AD 治療の薬剤開発に便利なツールがあります。

ErbB2 抑制 CL 387,785 によって差動によってアプリ C99 の処理を促進することがΓノッチ胸の谷間を与えずセクレターゼ 特定の γ-セクレターゼ基板の蛋白質分解開裂を定量化することができます細胞ベースのアッセイを確立するには、テトラサイクリン誘導 C 末期 Gal4/VP16 タグ付きの安定の共トランスフェクションによる HEK293 派生 CG セルラインを生成アプリ C99 と Gal4 プロモーターに駆動されるホタルのルシフェラーゼ レポーター遺伝子。NG 細胞平行線は、NΔE の γ セクレターゼ胸の谷間の分析にも設立されました。NG 細胞におけるテトラサイクリン誘導 C ターミナル Gal4 VP16 タグ付き NΔE と Gal4 のプロモーターに駆動されるルシフェラーゼ レポーター遺伝子だった HEK293 細胞に安定 cotransfected。Cg 基本セルでアプリ C99 の γ セクレターゼ胸の谷間と NG 細胞における NΔE...

我々 は正常に 2 つの基質特異的 γ-セクレターゼ アッセイを生成されます。ここに提示両方のセルベースのアッセイは、ホタル ルシフェラーゼ レポーターのアウトプットを介して γ セクレターゼ酵素を定量化する設計されています。

We have developed a pair of cell-based reporter gene assays to quantitatively measure &#947;-secretase cleavage of distinct substrates. This manuscript ...

この定量的細胞ベースのγセクレターゼレポーター遺伝子アッセイの全体的な目標は、γセクレターゼ媒介性切断に対する推定γセクレターゼモジュレーターの異なる効果を調べることです。この方法は、アルツハイマー病の治療のための新規ガンマセクレターゼモジュレーターの同定など、アルツハイマー病領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の利点は、非常に効率的なアッセイシステムであり、ガンマセクレターゼモジュレーターを簡単に同定できることです。この技術の意味は、副作用を最小限に抑えた抗AD薬の潜在的な発見を通じて、アルツハイマー病の治療にまで及びます。この方法は、ガンマセクレターゼの基質選択性に関する洞察を提供します。また、神経芽細胞腫などの他の疾患の研究にも適用できます。この方法を初めて使用する個々の人は、乱れが多すぎると最終結果が複雑になる可能性があるため、細胞培養培地を慎重に除去して96マイクロプレートに添加するのに苦労する可能性があります。この手順は、テキストプロトコルで参照されているように、NG細胞とCG細胞の調製から開始します。血球計算盤でNG細胞またはCG細胞をカウントします。次に、ウェルあたり20,000個の細胞を、成長培地中のウェルあたり最終容量200マイクロリットルの96ウェルマイクロプレートに播種します。マイクロプレートを加湿した二酸化炭素インキュベーターに移し、摂氏37度で一晩インキュベートします。一晩インキュベートした後、各ウェルから100マイクロリットルの成長培地を取り出します。0.2%ジメチルスルホキシド、2マイクロモルCL-387、785、2マイクロモルDAPT、またはその他の関連するErbB1/ErbB2阻害剤を含むテトラサイクリン1ミリリットルあたり2マイクログラムを含む増殖培地のウェルあたり100マイクロリットルを追加します。処理した細胞とマイクロプレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、増殖培地のウェルあたり150マイクロリットルをマイクロプレートから取り出します。次に、ルシフェラーゼアッセイ試薬のウェルあたり50マイクロリットルを追加します。次に、マイクロプレートを発光マイクロプレートリーダーに移し、室温で5分間保持します。ホタルのルシフェラーゼが放出する発光を、発光マイクロプレートリーダーに保存されている事前定義されたプログラムを使用して測定します。まず、機器制御ソフトウェアを開きます。次に、[ツール]メニューから[ルミノメトリー]を選択します。[パラメーター]設定で、[発光フィルター]に[フィルターなし]を選択し、[発光絞り]に[ノーマル]にチェックマークを付け、時間をカウントするために1つを入力し、[OK]をクリックして発光読み取りを設定します。「Instrument control」タ

quantitative-measurement-secretase-mediated-amyloid-precursor-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、テトラサイクリン誘導システムを使用して、遺伝子組み換えヒト細胞のγ-セクレターゼ活性を測定する手順を示しています。このプロセスには、テトラサイクリンによるAPP遺伝子発現の誘導、アミロイドβペプチドの生成、およびルシフェラーゼ産生の活性化が含まれます。次に、ルシフェラーゼ-基質反応から生じる生物発光を測定し、γ-セクレターゼ活性を反映します。...

ヒト細胞におけるγ-セクレターゼ活性を測定するためのルシフェラーゼアッセイ

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

タンパク質凝集体の細胞間移動、またはプロテオパシーシードは、神経変性疾患の病理進行の根底にある可能性があります。ここでは、組換えサンプルまたは生物学的サンプルからの播種活性を特異的かつ高感度に検出することを可能にする新しいFRETフローサイトメトリーアッセイについて説明します。...

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

このレポートは、ウェスタンブロットまたは蛍光ベースのアッセイによって、誤って折り畳まれたタンパク質の分解速度を測定するためのプロトコルを説明しています。この方法は、他のミスフォールドタンパク質の分析やハイスループットスクリーニングに適用できます。...

細胞におけるミスフォールドタンパク質の分解のためのアッセイ

誤って折りたたまれたタンパク質の凝集を定量化する手法について述べる.レンチ ウイルスのプロトコルの詳細は、安定的な細胞ラインの生成、自動の共焦点レーザー顕微鏡、タンパク質凝集体の画像解析に誘導されます。説明アプリケーションとして SOD1...

Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

再現性の高い、高速、かつ効率的に薬理学的シャペロンと呼ばれる「オーファン」薬の新規クラスのテスト前臨床をする需要があります。新規の薬理学的シャペロン薬と同様に、対象となる患者の画面に、高度に標準化、シンプルで汎用性の高い細胞培養技術を用いた試験を行った。...

体外ファブリとポンペ病の薬理学的シャペロン応答性をテストする酵素測定

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化に基づくイメージング質量分析法 (MALDI 分子研) 分子イメージングは、生体試料中の複数検体の同時マッピングをことができます。ここでは、アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー サンプル MALDI IMS を使用しての脳組織のアミロイド β タンパク質の可視化と検出のためのプロトコルを提案する.

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化

このプロトコルは、携帯電話のコンテキストで本質的に低活動、シングル売り上げ高プロテアーゼの活性を評価する方法を示します。具体的には、このメソッドは、PCSK9...

シングル売り上げ高プロテアーゼ PCSK9 のタンパク質分解を評価する高スループット ルシフェラーゼ アッセイ

このプロトコルは、β細胞からのインスリン分泌のプロキシとしてインスリン連結ガウシアルシフェラーゼを使用して中程度のスループットで迅速な低コストルシフェラーゼアッセイを行う方法について説明する。アッセイは、ほとんどの発光プレートリーダーおよびマルチチャンネルピペットで行うことができる。...

共分泌ルシフェラーゼサロゲートを用いた相対インスリン分泌の測定

このプロトコルでは、組換えタンパク質精製とユビキチン鎖切断アッセイを組み合わせることにより、神経発達障害に関連する遺伝的変異が脱ユビキチン化酵素活性に及ぼす影響を測定する方法を説明しています。...

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

ここでは、ヒトγ-セクレターゼを再構成する酵母系について述べる。このシステムにより、活性に影響を与える突然変異の同定と研究、およびγ-セクレターゼ阻害剤(GSI)のスクリーニングが可能になります。家族性アルツハイマー病変異体の機能喪失特性を利用して、γ-セクレターゼモジュレーター(GSM)のスクリーニングが可能です。...

出芽酵母 γ-セクレターゼによるアミロイドベーターゼ産生に影響を与える遺伝子、突然変異、および化学物質をスクリーニングするためのアルツハイマー病のモデル

学ぶγ-セクレターゼ活性のルシフェラーゼレポーターアッセイ法。アミロイド前駆体タンパク質を用いた細胞ベースの定量測定で、アルツハイマー病治療薬のスクリーニングと基質選択性の解析に応用できます。

Γ セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質と細胞を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイプラットフォームノッチ胸の谷間の定量的測定

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