Γ セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質と細胞を用いたルシフェラーゼ レポーター アッセイ プラットフォーム ノッチ胸の谷間の定量的測定
2018年1月25日
我々 は正常に 2 つの基質特異的 γ-セクレターゼ アッセイを生成されます。ここに提示両方のセルベースのアッセイは、ホタル ルシフェラーゼ レポーターのアウトプットを介して γ セクレターゼ酵素を定量化する設計されています。
この定量的細胞ベースのγセクレターゼレポーター遺伝子アッセイの全体的な目標は、γセクレターゼ媒介性切断に対する推定γセクレターゼモジュレーターの異なる効果を調べることです。この方法は、アルツハイマー病の治療のための新規ガンマセクレターゼモジュレーターの同定など、アルツハイマー病領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の利点は、非常に効率的なアッセイシステムであり、ガンマセクレターゼモジュレーターを簡単に同定できることです。
この技術の意味は、副作用を最小限に抑えた抗AD薬の潜在的な発見を通じて、アルツハイマー病の治療にまで及びます。この方法は、ガンマセクレターゼの基質選択性に関する洞察を提供します。また、神経芽細胞腫などの他の疾患の研究にも適用できます。
この方法を初めて使用する個々の人は、乱れが多すぎると最終結果が複雑になる可能性があるため、細胞培養培地を慎重に除去して96マイクロプレートに添加するのに苦労する可能性があります。この手順は、テキストプロトコルで参照されているように、NG細胞とCG細胞の調製から開始します。血球計算盤でNG細胞またはCG細胞をカウントします。
次に、ウェルあたり20,000個の細胞を、成長培地中のウェルあたり最終容量200マイクロリットルの96ウェルマイクロプレートに播種します。マイクロプレートを加湿した二酸化炭素インキュベーターに移し、摂氏37度で一晩インキュベートします。一晩インキュベートした後、各ウェルから100マイクロリットルの成長培地を取り出します。
0.2%ジメチルスルホキシド、2マイクロモルCL-387、785、2マイクロモルDAPT、またはその他の関連するErbB1/ErbB2阻害剤を含むテトラサイクリン1ミリリットルあたり2マイクログラムを含む増殖培地のウェルあたり100マイクロリットルを追加します。処理した細胞とマイクロプレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、増殖培地のウェルあたり150マイクロリットルをマイクロプレートから取り出します。
次に、ルシフェラーゼアッセイ試薬のウェルあたり50マイクロリットルを追加します。次に、マイクロプレートを発光マイクロプレートリーダーに移し、室温で5分間保持します。ホタルのルシフェラーゼが放出する発光を、発光マイクロプレートリーダーに保存されている事前定義されたプログラムを使用して測定します。
まず、機器制御ソフトウェアを開きます。次に、[ツール]メニューから[ルミノメトリー]を選択します。[パラメーター]設定で、[発光フィルター]に[フィルターなし]を選択し、[発光絞り]に[ノーマル]にチェックマークを付け、時間をカウントするために1つを入力し、[OK]をクリックして発光読み取りを設定します。
「Instrument control」タブで、アクティブなプロトコルのリストをスクロールし、発光を読み取るために事前に保存されたプロトコルを選択します。[ライブ表示]タブで、プルダウンメニューからスケールを定義し、タイプとして[対数]または[線形]を選択します。[温度]タブで、[プレート加熱]の[オフ]を選択します。
最後に、[開始]ボタンをクリックして発光読み取りを実行します。制御ソフトウェアに組み込まれたExplorerを使用して、結果をスプレッドシート形式にエクスポートします。テトラサイクリンを含まない増殖培地で処理したCGまたはNG細胞からのバックグラウンド発光を推定します。
100%相対γ-セクレターゼ活性として1ミリリットルあたり1マイクログラムのテトラサイクリンのみを含む増殖培地で0.1%DMSOで処理したCG細胞またはNG細胞によって放出される発光シグナルを定義します。最後に、テトラサイクリンおよびCL-387、785、またはDAPTのいずれかを含む増殖培地で培養したCGまたはNG細胞からのルシフェラーゼシグナルを、DMSO処理したCGまたはNG細胞が放出するルシフェラーゼシグナルに正常化します。ここでは、CG細胞におけるAPP-C99のγ-セクレターゼ切断の定量的測定を示す代表的な結果を示します。
細胞を、1ミリリットルあたり1マイクログラムのテトラサイクリンの存在下で、摂氏37度で24時間、CL−387、785またはDAPTの1マイクロモルで処理した。C99-GVのγセクレターゼ媒介タンパク質分解に由来する発光は、ルシフェラーゼアッセイ試薬のウェルあたり100マイクロリットルを添加した後に定量されました。ビヒクルのみで処理した細胞が放出するルシフェラーゼシグナルを、相対発光100%と設定した。
NG細胞におけるN-δ-Eのγ-セクレターゼ切断の定量的測定を示す代表的な結果を以下に示します。同様に、細胞をCL−387、785またはDAPTの1マイクロモルで、1ミリリットルのテトラサイクリンの存在下で摂氏37度で24時間処理した。N-デルタ-E-GVのγ-セクレターゼ媒介性タンパク質分解に由来する発光は、ルシフェラーゼアッセイ試薬のウェルあたり100マイクロリットルを添加した後に定量されました。
ビヒクルのみで処理した細胞が放出するルシフェラーゼシグナルを、相対発光100%と設定した。この手法を習得すると、検査する化合物の数が決まるまで、1〜2時間の実践的な時間しか必要としません。その開発後、この技術は、アルツハイマー病の分野の研究者がアルツハイマー病の新規治療法を追求するためにガンマセクレターゼの遺伝的および化学的修飾因子を探求する道を開きました。
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概要
本研究では、ホタルルシフェラーゼレポーターを用いてγ-セクレターゼの酵素活性を定量化するための、細胞ベースのアプローチを利用した2つの基質特異的γ-セクレターゼアッセイの開発について概説します。これらのアッセイは、潜在的なγ-セクレターゼモジュレーターの分化的な効果に焦点を当てており、アルツハイマー病およびその他の関連疾患の研究を推進することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- アルツハイマー病研究
背景
- γ-Secretaseはアミロイド前駆体タンパク質（APP）の切断に不可欠です。
- γ-secretaseモジュレーターの理解は、アルツハイマー病の治療における画期的な進展につながる可能性があります。
- これらのアッセイでは、酵素活性の読み取り値としてルシフェラーゼを利用します。
- アッセイの開発には細胞培養技術が導入されています。
研究目的
- アルツハイマー病治療のための新規γ-セクレターゼ調節剤を同定すること。
- γ-セクレターゼの基質選択性を探究すること。
- 信頼性が高く効率的なアッセイシステムを開発すること。
使用した手法
- 主要なプラットフォームとして、96ウェルマイクロプレートを用いた細胞培養を行う。
- 主要な生物学的モデルには、NG細胞およびCG細胞が含まれる。
- アッセイでは、各種化合物での処理後のルミネッセンスをモニタリングする。
- 重要な手順には、細胞の播種、薬剤処理、およびルシフェラーゼアッセイ試薬の添加が含まれる。
- 酵素活性を定量化するために、詳細なルミネッセンス測定プロトコルを採用する。
主な結果
- 発光出力によるγ-セクレターゼ活性の定量的評価に成功。
- 結果により、APPの切断測定および化合物の潜在的な調節効果が示される。
- データは、アルツハイマー病に対する治療薬を特定するための経路を示唆している。
- 処理済み細胞からの発光測定値により、結果の妥当性が確認されている。
結論
- 本研究では、基質特異的なγ-セクレターゼアッセイを評価する方法を実証しています。
- アルツハイマー病治療における治療上の進展の可能性が強調されています。
- これらの知見により、関連疾患における分子メカニズムのさらなる探索が可能になります。
よくある質問
産業界における重要性
このアッセイプラットフォームは、γ-セクレターゼ活性の基質選択的な測定を可能にし、アルツハイマー病治療において副作用プロファイルが軽減されたモジュレーターの同定を支援します。APP-C99の切断をNotch基質から区別することで、標的バリデーションおよびリード化合物同定キャンペーンにおけるメカニズム的なリスク低減を実現します。本システムは、疾患に関連する細胞環境下で化合物の異なる影響を定量化することにより、初期探索段階における予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： γ-セクレターゼの基質選択性を検証することで、治療仮説を明確にし、ターゲットメカニズムのリスクを低減させることができる。
- 運用上の価値： APPとNotchの切断に対する差分的な影響を定量化することにより、ターゲットとしてのγ-セクレターゼの機能的な妥当性確認をサポートする。
- 予測的価値： Notchシグナルを維持しつつ、病原性APP処理を選択的に調節する化合物を特定することで、ポートフォリオの優先順位付けを促進する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：96ウェル形式でγ-セクレターゼ調節剤の高スループットスクリーニングを行うための、安定したルシフェラーゼベースの読み取りを提供します。
- 定量的出力：用量反応分析および化合物のランキングを可能にする、正規化された発光信号を生成します。
- 再現性：等遺伝子細胞株（CGおよびNG）を利用することで、変動を最小限に抑え、アッセイ間の比較をサポートします。
翻訳・前臨床研究
- 疾患との関連性：HEK293細胞におけるAPP-C99切断をモデル化しており、アルツハイマー病の病理に沿った還元的な系を提供します。
- メカニズムによるリスク低減：γ-セクレターゼモジュレーターをDAPTなどのパンインヒビターと区別することで、メカニズムに基づく毒性のリスクを低減します。
- トランスレーショナルな継続性：基質特異的な活性リードアウトを提供することで、ヒット化合物の同定からリード最適化への移行を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、基質特異的なγ-secretase活性の定量データを提供することで、ヒット化合物の同定からリード化合物の同定までを可能にし、創薬初期段階のプロセスに適合します。
- 探索生物学： APP経路に対するγ-セクレターゼモジュレーターの効果とNotch経路への影響に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 化合物ライブラリーのスクリーニングに適した、再現性のあるアッセイ完結型のルミネッセンス出力を提供します。
- 分析： ルシフェラーゼ信号の正規化と比較を可能にし、さまざまな条件下での相対的なγ-セクレターゼ活性を定量化します。
- トランスレーショナルリサーチ： 基質選択性のメカニズム的バイオマーカーを提供することで、前臨床研究へと繋げます。
- 企業での再利用： 複数のターゲットクラスや疾患領域にわたる反復的なスクリーニングキャンペーンのための、拡張可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 基質選択的な活性測定による、ターゲットバリデーションにおける予測信頼度の向上。
- 運用上の価値： 安定細胞株とルシフェラーゼ読み取りによる標準化により、試験間の再現性を確保。
- 戦略的価値： 好ましい選択性プロファイルを持つモジュレーターを特定することで、go/no-go判断の根拠を提供。
- ポートフォリオへの影響： Notch介在性シグナル伝達を回避する化合物の、リスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 哺乳類細胞培養およびルシフェラーゼベースのアッセイ操作に関する専門知識が必要です。
- データ取得には、ルミネッセンスマイクロプレートリーダーおよび関連する制御ソフトウェアが必要です。
- ウェル全体でテトラサイクリン誘導および化合物処理のタイミングを標準化する必要があります。
- 他のγ-secretase基質に適応させるには、Gal4/VP16タグ付きレポーター構築物の再設計が必要です。
- 不均一な細胞播種や培地の乱れによる変動の可能性があるため、標準化されたプロトコルを用いて制御する必要があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
6:05
Conclusion
4:40
Results: Treatments with CL-387, 785 can Differentially Promote the Processing of APP-C99 by γ-Secretase without Affecting Notch Cleavage
1:17
Measurement of Luciferase Reporter Signals, which Correspond to γ-Secretase Cleavage of APP-C99 (CG cells) or NΔE (NG cells)
3:42
Quantification of γ-Secretase Activity
0:05
Title
