Name: Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: 学ぶFISH法によるショウジョウバエ卵母細胞の減数分裂腕凝集状態の可視化手法。プロメタフェーズと中期の凝集状態を評価し、染色体分配メカニズムと母親年齢効果の理解に貢献します。

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この作品は、NIH グラント GM59354 シャロン E. Bickel に授与によって支えられました。Q. ウイ グエンにアン Lavanway 共焦点顕微鏡のヘルプとテクニカル サポートに J. エミリアーノ リード蛍光腕プローブの生成のためのプロトコルの開発に支援ありがちましょう。また、有用な議論やアドバイスのためのショウジョウバエのコミュニティで多くの同僚らを感謝いたします。

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</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

私と中期 prometaphase の腕の結束の状態を評価するプローブの魚の使用私のショウジョウバエの卵母細胞はショウジョウバエの減数分裂の分野の重要な進歩。歴史的に、ショウジョウバエ研究者は成熟卵11,18,19腕結束の早期喪失を推論するための遺伝子検査に限られています。今、紹介した方法で腕の結束の状態ことができます試金する魚を使用して直接。大きく腕結束の早期喪失の物理的な証拠を取得する機能は、ショウジョウバエの卵母細胞腕凝集度と染色体紡錘の早期喪失につながるメカニズムを研究に利用可能なアプローチのレパートリーを展開します。
重要なステップ 成熟したショウジョウバエの卵母細胞における染色体腕に沿ってシングル コピー シーケンスに交配する蛍光プローブの成功した可視化のた...

有糸分裂と減数分裂時の染色体の分離が適切な必要とその姉妹染色分け体の凝集性の確立、維持、・連携1,2のリリースします。凝集度は S 期の間に確立され、姉妹を保持する物理の連携を形成するコヒーシン複雑、により媒介される染色分け体一緒に。減数分裂、クロス オーバーの遠位結束も組換え同族体を一緒に保持する機能し、この物理的な関連付けにより、適切な方向 (図 1)3,4、減数分裂に 2価の紡錘 5。リリース アームの後期で結束対極スピンドルに分離する同族体が可能します。ただし、腕結束がある場合途中で失われた組換え同族体の物理的な接続を失う、異数性配偶子 (図 1) につながることができます、ランダムに分離します。
人間の卵子の染色体分配のエラー6、ダウン症候群などの先天異常と流産の原因、その発生率は、母体年齢7とともに指数関数的に増加します。胎児卵母細胞で姉妹染色分け体の凝集が確立され、出生前に減数分裂組み換えが完了しました。卵母細胞、中期前期私排卵までと逮捕この逮捕中に、組換え同族体の継続的な物理的な連合の依存姉妹染色分け体結束。したがって、減数分裂と正常妊娠の転帰の間に正確な分離は、最大 5 年間の凝集力がそのまま残ること必要があります。
人間の卵子の減数分裂長期逮捕時に結束の早期喪失は母親年齢の効果に貢献する提案されているし、証拠の複数のラインは、この仮説8,9をサポートします。ただし、ヒトの卵母細胞の減数分裂の結束を研究の課題を考えると、この現象の私達の理解の多くは、モデル生物5,10、11,12,の使うことで13,14,15。
ショウジョウバエの卵母細胞は減数分裂の結束と染色体の偏析の研究のための多数の利点を提供しています。単純な遺伝的アッセイ異数性配偶子から子孫を回復し、 Xの忠実度を測定することができます-大規模な11,16,17染色体分離。さらに、1 つも減数分裂期組換え同族体 missegregate アーム結束11,18,の早期喪失と一貫性のある表現型、私ために染色体分離エラーが発生するかどうかを決定可能性があります19. 直接ショウジョウバエの卵母細胞の減数分裂の結束の状態の観察が可能な蛍光現場の交配 (魚) を使用しても。反復的な衛星シーケンスに交配する蛍光のオリゴヌクレオチドが使用されているため 10 年以上 pericentromeric 結束の成熟したショウジョウバエ卵4、20アームの分析を監視するには凝集度は、はるかに困難されています。腕の結束の状態の可視化には、シングル コピーの大規模な地域にわたるプローブ シーケンスし、アーム結合が存在しないときに個々 の妹のため目に見えるシグナル染色分け体が発生するには十分に明るいですが必要です。さらに、卵母細胞固定条件と分類された Dna のサイズは大きな成熟したショウジョウバエ卵母細胞 (200 μ m 幅 500 μ m 長で) に浸透21を促進する必要があります。最近、腕プローブが正常に利用いる prometaphase で信号の検出できませんでした述べたけど、著者、後期中ショウジョウバエ卵母細胞染色分け体を可視化するまたは中期卵22を逮捕しました。ここでは、 Xの生成のための詳しいプロトコルを提供-私と中期染色分け体結束 prometaphase の妹の早期喪失の試金する私たちを許可している卵母細胞調製条件と魚プローブ染色体腕私卵。減数分裂の結束の維持に必要な遺伝子の製品を識別するために私たちを有効に、これらのテクニックになります他の姉妹のために試金する染色分け体結束異なった遺伝子型の成熟のショウジョウバエ卵の欠陥します。

<table><tbody><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi Prep kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Prep BAC clone DNA</td></tr><tr><td>GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit</td><td>Sigma</td><td>WGA2</td><td>Amplify BAC clone DNA</td></tr><tr><td>ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit</td><td>Invitrogen</td><td>A21676</td><td>Label BAC clone DNA</td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>BACクローンDNAの標識後の非標識</td></tr>色素<tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>化学薬品&ソリューション</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>注:</ストロング>すべての溶液は滅菌超純水を使用して調製され、オートクレーブ滅菌またはフィルター滅菌のいずれかで滅菌する必要があります。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>10% stock 凍結アリコート</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td><強い>有毒:</強い>適切な保護具を着用してください。100&microを準備します。100%エタノールにg / mlストックし、-20°Cでアリコートに保管します。使用前に2X SSCTのg / ml溶液。</td></tr><tr><td>デキストラン硫酸塩</td><td>Sigma</td><td>D-8906</td><td></td></tr><tr><td>Drierite</td><td>Drierite Company</td><td>23001</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td>10 mM stock</td></tr><tr><td>dTTP (10 &micro;mol、100 &micro;l)</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>1277049</td><td>1 mM ストック</td></tr><tr><td>EDTA (エチレンジアミン二ナトリウム四酢酸)</td> を調製します <td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>250 mM ストック</td></tr><tr><td>100% エタノール (分子グレード、200 プルーフ)</td> を調製します <td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Tris (Ultra Pure)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (エチレンビス(オキシエチレンジニトリロ)四酢酸)</td><td>シグマ</td><td>E-3889</td><td></td></tr><tr><td>16% ホルムアルデヒド</td><td>テッド・ペラ社</td><td>18505</td><td>Toxic:適切な保護具を着用</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td>Toxic:適切な保護を着用</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>737-151</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>H350-4</td><td>Toxic:適切な保護具を着用してください。</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>ミリポア</td><td>HX0603-4</td><td><強い>有毒:</強い>適切な保護を着用してください。</td></tr><tr><td>ヒドロキシルアミン</td><td>Σ</td><td>438227</td><td>調製 3 M ストック</td></tr><tr><td>4.9 M 塩化マグネシウム</td><td>Σ</td><td>104-20</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 &Yuml; 7H2O</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &Yuml; 2H2O</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン (0.1mg/ml)</td><td>シグマ</td><td>P8920-100</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S209-500</td><td>3Mストックカ</td></tr><tr><td>コジル酸ナトリウム</td>を調製 <td>ポリサイエンス社</td><td>1131</td><td>Toxic:適切な保護具を着用してください。400mMストックを調製</td></tr><tr>ク<td>エン酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td>塩化ナトリウム フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>サーファクタアンプ</td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>28314</td><td>サーファクタアンプ</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注:すべての溶液は滅菌超純水を使用して調製され、オートクレーブ滅菌またはフィルター滅菌のいずれかで滅菌する必要があります。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE バッファー</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris、1 mM EDTA、pH = 8.0</td></tr><tr><td>20X SSC (生理食塩水クエン酸ナトリウム)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl、300 mM クエン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>2X カコジル酸固定液</td><td></td><td></td><td><強>毒性:</強力> 適切な保護具を着用してください。 200 mM カコジル酸ナトリウム、200 mM スクロース、80 mM 酢酸ナトリウム、20 mM EGTA</td></tr><tr><td>1.1X ハイブリダイゼーションバッファー</td><td></td><td></td><td>3.3X SSC、55% ホルムアミド、11% デキストラン硫酸塩</td></tr><tr><td>固定液</td><td></td><td></td><td><強>毒性: </強>適切な保護具を着用してください。 4% ホルムアルデヒド、1X カコジル酸固定液</td></tr><tr><td>PBSBTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS、0.5% BSA、0.1% Trition X-100</td></tr><tr><td>PBSTx</td><td></td><td></td><td>1X PBS、1% Trition X-100</td></tr> 抽出<tr><td>バッファー (PBSTx + Rnase)</td><td></td><td></td><td>1X PBS、1% Trition X-100、100 &マイクロ;g/mL RNase</td></tr><tr><td>2X SSCT</td><td></td><td></td><td>2X SSC, 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>2X SSCT + 20% ホルムアミド</td><td></td><td></td><td><ストロング>毒性:</ストロング> 適切な保護具を着用してください。 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% ホルムアミド</td></tr><tr><td>2X SSCT + 40% ホルムアミド</td><td></td><td></td><td><ストロング> Toxic:</ストロング> 適切な保護具を着用してください。 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% ホルムアミド</td></tr><tr><td>2X SSCT + 50% ホルムアミド</td><td></td><td></td><td><強い>有毒:</強い>適切な保護具を着用してください。2X SSC、0.1%Tween 20、50%ホルムアミド</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号<</td><td>strong>コメント</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AluI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0137S</td><td></td></tr><tr><td>ヘIII</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0108S</td><td></td></tr><tr><td>MseI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0525S</td><td></td></tr><tr><td>MspI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0106S</td><td></td></tr><tr><td>RsaI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0167S</td><td></td></tr><tr><td>BfuCI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0636S</td><td></td></tr><tr><td>100X BSA</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td></td><td>NEB酵素</td></tr><tr><td>10X NEBバッファー #2</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td></td><td>が付属しています制限酵素消化バッファー。NEB酵素</td></tr><tr><td>ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)400 U/&microが付属しています。l</td><td>ロシュ/シグマ</td><td>3333566001</td><td></td></tr><tr><td>TdTバッファー</td><td>ロシュ/シグマ</td><td></td><td>TdT酵素</td></tr>塩化<tr><td>コバルト</td><td>ロシュ/シグマ</td><td></td><td><ストロング>毒性:</ストロング>適切な保護具を着用してください。TdT酵素</td></tr><tr><td>RNase A(10 mg / mL)</td><td>Sarmo-Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Cytologyツールなど</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>#5 INOX、バイオロジー</td></tr><tr><td>9インチ使い捨てガラスパスツールピペットフィ</td><td></td><td>ッシャー13-678-20C</td>浅いガラス解剖皿<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>を</td></tr>滅菌するためのオートクレーブカスタムメイド<tr><td>ディープウェルディッシュ(3ウェル)</td><td>パイレックス</td><td>7223-34</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーファイネストプレミアム顕微鏡スライドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>22-038-104</td>深い<td>井戸皿を覆うために使用されます</td></tr><tr><td>すりガラススライド、25 x 75 mm</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>48312-002</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス、3 x 1 インチ、厚さ 1 mm</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ、10 x 10 mm、No. 1.5</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3405</td><td></td></tr><tr><td>タングステン針</td><td></td><td></td><td>自家製</td></tr><tr><td>Prolong GOLD 封入剤</td><td>分子プローブ</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>缶入り圧縮空気</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号<</td><td>strong>コメント</td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCRマシン</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000、分光光度計</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td>microvolume spectrophotometer</td></tr><tr><td>ボルテクサー</td><td>室温での各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テーブルトップマイクロフュージ</td><td></td> 4°Cの各種<td></td><td></td></tr><tr><td>テーブルトップマイクロフュージ。C</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td></td> ローテーター付き各種<td></td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブンまたはインキュベーター</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニュータ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1RSiレーザースキャンコンフォアル</td><td>ニコン</td><td></td><td>40Xオイルプラン フローDIC(NA 1.3)</td></tr><tr><td>名前</strong</td><td><>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>消耗品など</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mLコニカルチューブ各種</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15mLコニカルチューブ各種</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mLマイクロチューブ各種</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500&micro;l マイクロチューブ</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;l PCRチューブ</td><td></td> ぴったりとフィットする蓋付きの各種<td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック容器</td><td>ドライ</td><td></td><td>エライト</td></tr><tr><td>キムワイプ</td>を保持するために <td>各種</td><td></td>使い捨て<td>ワイプ</td></tr><tr><td>パラフィルム パラフィルム</td><td>各種</td><td></td><td>パラフィンフィルム</td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>その他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC精製5'標識オリゴヌクレオチド</td><td>統合されたDNAテクノロジー</td><td></td><td>X染色体の359 bpサテライトリピートを認識するCy3標識プローブ</td></tr><tr><td>Volocity 3D画像解析ソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>バージョン6.3</td></tr></tbody></table>

prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光in situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

ヒトでは、卵母細胞における染色体分離エラーが流産や先天性欠損症の大半を担当です。さらに、女性の年齢、妊娠 aneuploid 胎児が大幅に増加、このような現象のリスクは母体年齢効果と呼ばれます。減数分裂の分裂時の正確な染色体分離の要件の 1 つは妹のメンテナンス卵母細胞が発生する拡張前期期間中に染色分け体結束。人間のモデル生物細胞学的証拠では、老化の過程減数分裂凝集度を劣化させることを示唆しています。人間の卵子に偏析エラーは減数分裂の間に最も普及している、さらに、私は、腕の結束の早期喪失と一貫性のあります。モデル有機体の使用は、凝集度の年齢依存性損失の根底にあるメカニズムの解明にとって重要です。キイロショウジョウバエでは、卵母細胞の減数分裂の凝集の制御を勉強するためのいくつかの利点を提供しています。しかし、最近まで、遺伝テストのみでした腕結束異なった遺伝子型の異なる実験条件下で卵母細胞の損失の分析に利用できます。ここでは、詳細なプロトコルで、私は、ショウジョウバエの卵母細胞を逮捕された中期の腕 prometaphase の結束の交配 (魚) を直接可視化する蛍光その場で使用するため欠陥を提供。X染色体の遠位腕に交配魚プローブを生成および共焦点 Z スタックを収集、研究者が 3 つの次元での個々 の魚信号数を視覚化して姉妹かどうかを決定する染色分け体腕区切られました。手順では、ショウジョウバエの卵母細胞の何百もの arm 結束欠陥を定量化可能です。そのため、このメソッドは、結束のメンテナンスだけでなく、老化プロセスの間に死につながる要因に寄与するメカニズムを調査するため重要なツールを提供します。

X染色体の細胞学的地域 6E 7B に交配腕プローブで得られた画像を図 5に示します。共同の DAPI、ローカライズ信号でこの検出結果の例は、背景から識別しやすいと正常に異なった遺伝子型19腕結束の欠陥を定量化するために使用されています。結束性欠陥の定量化は制限された prometaphase に私と中期私段階;核膜崩壊前に卵母細胞は、解析19から除外しました。卵母細胞の染色体に囲まれて離散円形領域は周囲の細胞より暗いので DAPI チャンネルでスキャンする場合、そのまま核封筒は明らかです。
図 5Bは、デコンボリューションとコントラスト強化後個々 の Z シリーズの最大輝度投影相関を示しています。結束性欠陥の定量化は、各...

この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase とを逮捕した中期ショウジョウバエ卵。このプロトコルは、減数分裂の腕の結合はそのままか、異なった遺伝子型の崩壊かどうかを決定するのに適しています。

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

この手順の全体的な目標は、FISHプローブを生成し、前中期1および中期1中のショウジョウバエ卵子の減数分裂腕凝集状態を視覚化することです。この技術の主な利点は、前中期および中期1の停止したショウジョウバエ卵母細胞における腕の凝集状態をアッセイできることです。この方法は、ショウジョウバエの減数分裂の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。たとえば、腕の結束が早期に失われる条件は何ですか?この手法は、卵子の老化に伴って減数分裂の凝集が悪化するために、少なくとも部分的にはヒトにおける母体の年齢影響についての理解を深める可能性を秘めています。このプロトコルは、FISH用のアームプローブの生成、およびテキストプロトコルに詳述されている卵子の解剖と固定から開始します。後期卵子を分離するには、まず浅い解剖皿にPBSBTXを1ミリリットル加えます。次に、先端がBSAコーティングされたP-200を使用して、固定卵巣を浅い皿に移します。BSAコーティングされたピペットチップで卵巣を上下にピペットで動かし、成熟した卵子を成熟していない卵子から取り除きます。後期卵子が十分に分離されたら、すべての組織を500ミリリットルのマイクロチューブに移します。チューブに約150〜200マイクロリットルを残して、引っ張ったパスツールピペットで余分な液体を取り除きます。卵子のローリングに備えるには、200マイクロリットルのPBSBTXでディープウェルディッシュを事前に湿らせます。皿に蓋をして脇に置きます。すりガラスのスライドを3つ用意し、スライドを3つ脇に置きます。次に、スライド1とスライド2のすりガラス領域をそっとこすります。脱イオン水ですすいでガラスの破片を取り除き、使い捨てワイプで乾かします。スライド1と2のつや消し領域をPBSBTXでコーティングするには、1つのスライドに50マイクロリットルのPBSBTXを追加し、この領域を他のスライドでこすります。液体を使い捨てワイプで取り除き、スライドを解剖顕微鏡の下に置きます。スライド 1 とスライド 2 のつや消し領域を接触させ、スライド 3 がスライド 2 を支えます。卵子を転がすには、まずP-200ピペットチップをPBSBTXで事前に濡らし、ピペッティングを上下させて卵子をマイクロチューブに分散させます。卵子を含む50マイクロリットルの液体をスライド1のすりガラス部分の中央に移します。これを行うには、スライド2を持ち上げます。液体の表面張力が2つのすりガラス領域の間にシールを作成するまで、スライド2をゆっくりと下げます。つや消しの領域を覆うのに十分な液体があるはずですが、染み出しているものはあってはなりません。次に、片手で下部スライド1を所定の位置に保持し、もう一方の手で上部スライド2を水平に保ち、スライド3で支えたまま、上部スライド2を

using-fluorescence-situ-hybridization-fish-to-monitor-state-arm

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin...

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

SACは、姉妹染色分体の有糸分裂分離を監視し、その信号を開始する場所を動原体である。方法は、染色体の動きと動原体タンパク質とその調整のいずれかの採用と離職率を可視化するために記述されている...

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

成熟したショウジョウバエ卵子の収集、調製、イメージングのためのプロトコールを提示します。これらの方法により、減数分裂中の染色体の挙動と紡錘体の組み立てと機能の視覚化が可能になります。...

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ...

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA...

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

再現性をもって RNA の単一分子蛍光 in-situ 個々 卵母細胞における Mrna の数字をカウントするには、交配 (RNA 魚) 非付着性のセルの最適化を行った。卵子採取、トラン...

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

このプロトコルは、ショウジョウバエのメラノガスター幼虫視葉におけるハイブリダイゼーション連鎖反応蛍光性交配(HCR-FISH)を行うために必要な手順を説明しています。プローブ設計、ハイブリダイゼーション、増幅、組織マウントの手順が詳細に記載され、発達中の視葉の可視化を容易にします。...

発達中の ショウジョウバエ の視葉におけるハイブリダイゼーション連鎖反応FISHの

学ぶFISH法によるショウジョウバエ卵母細胞の減数分裂腕凝集状態の可視化手法。プロメタフェーズと中期の凝集状態を評価し、染色体分配メカニズムと母親年齢効果の理解に貢献します。

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

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