Name: ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶラットの両側膝蓋腱損傷モデルを用いた幹細胞療法の評価方法。臍帯由来間葉系幹細胞スフェロイドによる腱治癒の効果を検証し、個体差を最小化して治療効果を正確に評価する手法を解説します。

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著者は、データの統計的分析のため博士 Su 博士を認めたいと思います。著者もありがとう博士 McClure、DVM、博士 DACLAM、麻酔に関する彼女のアドバイスと痛み管理プロトコルが研究に使用します。このプロジェクトは、研究 (12678v) および米国農務省セクション 1433 資金 (2090) 副社長の西保健大学理学部学務係からの補助金によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ウエスタン大学の保健学科によって承認されています。
1. 分離とウマ臍帯行列から MSCs の拡大
<ol><li>観察 foaling 後大人の牝馬 (妊娠している) から胎盤を入手して無菌胎盤から臍帯を分離します。おいて臍帯リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) の 4 ° C での転送中に処理まで。</li>
	<li>1% と室温 PBS で 2 回臍帯を洗う P/S 50 mL のチューブに。セクション 2 インチ長さ 150 mm の板と P/S 50 mL のチューブの 2 つのまたは 3 回まで血液のほとんどをすすいだ 1% 室温 PBS で洗浄断章に臍帯。</li>
	<li>船を公開する縦へその緒を切る。2 動脈、静脈、鉗子、はさみを使用してコードから尿の茎などの血管を削除します。メスで削って 150 mm の板の上にゼリーのようなマトリックスの周囲血管臍帯マトリックス (Wharton のゼリー) を収集し、細かい部分にゼリーをみじん切り。</li>
	<li>場所ワルトン 15 ml の PBS の 0.1% (w/v) コラゲナーゼ タイプ IA ソリューションの 50 mL チューブに 2-3 臍帯断片 (約 12-15 g) から。3-4 時間溶解するまで穏やかな揺れで 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>15 分間 300 x g で消化組織を遠心し、上清を吸引します。室温 PBS 1% の 15 mL で消化組織を再懸濁します P/S、ピペッティングで混ぜる、5 分間 150 × g で遠心、上清 (洗浄) を吸引します。二回以上洗濯を繰り返します。</li>
	<li>室温 PBS 1% の 15 mL のセルを洗浄再懸濁します P/S、ピペッティングで混ぜる、100 μ m セル ストレーナー付け, 150 x g で 5 分間遠心によるひずみ、上清を吸引します。</li>
	<li>低血糖ダルベッコを混合することによって培養液 (CM) を準備変更イーグル培地 (LG DMEM) ウシ胎児血清 (FBS) と 1 %p/s. 濾過により培地を滅菌します。</li>
	<li>37 ° C に加温 CM の 10 mL で緊張した細胞を再懸濁します、ピペッティングで混ぜる、25 cm2培養フラスコに移す、5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい変更 CM 文化文化、継代時に 70-80% の合流点に達するまで 3 日おき。</li>
	<li>文化を通路にフラスコから CM を吸引、室温 PBS の 5 mL で 2 回洗浄、3 ml の 5 分の 37 ° C で 0.25% トリプシン/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) のデタッチします。</li>
	<li>トリプシン/EDTA 37.0 ° C に加温 CM の 6 ml を中和する、ピペッティングで混ぜる、150 x g で 5 分間遠心 15 mL チューブに移す、上清を吸引します。CM の 1 mL 中の剥離細胞を再懸濁します、ピペッティングで混ぜます。トリパン ブルーと検定を使用して実行可能なセルを数えます。5,000 セル/cm2で 25 cm2培養フラスコに再シードし、5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい</li>
</ol>2. UCM mscs キトサン膜上で培養した回転楕円体の準備
<ol><li>1% (w/v) キトサン溶液の 100 mL を準備するには、キトサンの 1 g を加えて 99 mL の蒸留水 (dH2O)、および磁性攪拌器でよく混ぜます。</li>
	<li>氷酢酸の 670 μ L を追加し、キトサンを溶解して粘性になるまで混合を続行します。これは通常 3-4 時間がかかります。</li>
	<li>12 ウェル培養プレートの各ウェルにキトサン溶液 500 μ L を追加し、キトサン ソリューションを均等に分散し、すべて底面のカバー プレートを旋回します。</li>
	<li>キトサン コーティング ソリューション平板層流 24 時間一晩カバーなしキャビネットを乾燥させます。一度乾燥、薄膜を形成・ プレートに付着されます。</li>
	<li>各ウェルに 0.5 N 水酸化ナトリウム (NaOH) 溶液の 1 mL を追加してキトサン フィルムを中和し、室温で 2 時間インキュベートします。各ウェルから NaOH を吸引し、それぞれを洗ってよく dH2O の 1 mL で 3 回。それぞれを洗って一度 70% エタノール (エタノール) 1 mL でも。</li>
	<li>キトサン フィルムを殺菌するには、層流れのキャビネットで一晩 70 %etoh それぞれによく、インキュベートの 1 mL を追加します。次の日に各ウェルから残りのエタノールを吸引します。それぞれを洗っても 1 ml 滅菌 PBS の 3 回。キトサン フィルム流カバーなし一晩キャビネットの下紫外光を滅菌します。</li>
	<li>フォームは UCM MSCs の回転楕円体に種子を拡大し 5,000 セル/cm2、各ウェルに、細胞を継代そして 5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい 注: セルは、低酸素症又は治験責任医師の関心に応じて常孵化することができます。</li>
</ol>3 フローサイトメトリー分析表面マーカーの発現
<ol><li>
単一細胞懸濁液の準備
	<ol>
<li>標準プレート<ol>
<li>各ウェルからメディアを削除し、室温 PBS で 2 回洗います。</li>
			<li>室温で 5-10 分の 12 ウェル プレートの各ウェルに、細胞解離試薬の 500 μ L でセルをデタッチします。</li>
			<li>インキュベーション後、染色バッファー (0.5 %bsa を含む PBS) 1 ml を各ウェルに、細胞をデタッチするピペッティングで混ぜます。</li>
			<li>15 mL の円錐管 150 x g で 5 分間遠心し、細胞懸濁液を転送します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>キトサン プレート<ol>
<li>先端が 1,000 μ L ピペットを使用して吸引媒体によってすべての回転楕円体を収集します。15 mL の円錐管に集められた媒体。媒体を収集した後、PBS の 1 mL を追加してよく洗うし、同じ 15 mL の円錐管に洗浄 PBS を転送します。</li>
			<li>5 分間 150 x g で回転楕円体を遠心し、上清を除去します。</li>
			<li>細胞解離試薬 (例えばaccutase) を 500 μ l 添加し、室温で 5-10 分の間孵化させなさい。ミックスによるピペット 1 mL 先端まで回転楕円体を切り離して考えるし、表示されなくなります。</li>
			<li>単一細胞懸濁液や 150 x g で 5 分間遠心に染色バッファーの 1 つの mL を追加します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
洗浄のセル
	<ol>
<li>円錐管から上澄みを除去し、再バッファーを染色冷 3 mL のセルを中断します。このステップから氷上実験を通して細胞を保ちます。</li>
		<li>5 分 (洗濯) 300 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>2 回洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
セルを汚す
	<ol>
<li>5 分間 300 × g で遠心し、上清を除去します。</li>
		<li>トリパン ブルーと検定を使用して実行可能なセルを数えます。50 μ L ブロックで 1 x 10 の6セルを再停止 (PBS 含む 10% 馬血清) をバッファーし、氷の上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>10 μ L フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) 共役抗体 (CD44、CD90, CD105、CD34、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) クラス II、または各抗体アイソタイプ コントロール) とバッファーを染色の 40 μ L を追加し、氷の上の 1 h の光から保護します。</li>
		<li>染色バッファー冷 3 mL を加えるとミックス、5 分 300 × g で遠心、上清 (洗浄) を吸引します。</li>
		<li>二回洗濯を繰り返します。</li>
		<li>再バッファーを染色の 0.5 mL の細胞ペレットを中断します。</li>
		<li>7 AAD (生存率色素) の 5 μ L を追加し、氷の上で 30 分間インキュベート</li>
		<li>フローサイト メーターによる細胞染色サンプルを分析します。小さく SSC と FSC によって破片を除外し、7 AAD の吸収性の低い実行可能なセルを識別します。プロット FL1 と FL2 に、y 軸と x 軸、それぞれ。アイソタイプ コントロールを使用すると、対角線上のゲートを作成できます。地域で積極的に陽性細胞の割合を測定します。少なくとも 20,000 イベント/サンプル (補足図 1) をカウントします。</li>
		<li>ゲーティング生菌と自動蛍光抗体染色細胞の割合を測定し、染色のアイソタイプ コントロールのセルの割合を減算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 両側膝蓋腱欠損モデル ラットの
<ol><li>ラット (成人男性、4-5 ヶ月、体重 350-375 g) を選択します。このモデルに使用されるラットの比較的大きいサイズに注意してください。</li>
	<li>麻酔し、誘導室でピンチからつま先まで反射の消失までマスクを介して配信される 2 L/分 100% 酸素を 8% セボフルラン ラット人工眼の潤滑剤を適用します。</li>
	<li>先制鎮痛としてメロキシカム (1 mg/kg の筋肉内注射を管理します。</li>
	<li>暖かい水で満たされ、皮膚傷害を防ぎながら体の温度と位置を維持するために布で覆われた 2 つの 0.5 L 水ボトル間ネズミを配置します。テーブルにそれぞれの端をテープします。低体温症のリスクを減らすためには、バブルラップ (図 1) と体をカバーします。</li>
	<li>5% セボフルラン 1 L 100% 酸素混合背臥床水加熱パッドの上に動物の鼻の円錐形の連続的な流れで麻酔を維持します。</li>
	<li>皮膚外傷を避けるためには、施術部位を切てはいけない。代わりに、両方の抑圧に除去クリームを適用します。舌圧子を使用して、クリームや髪を削除します。</li>
	<li>クロルヘキシジン酸スクラブで手術部位をスクラブし、3 回を 70% エタノールでリンスします。</li>
	<li>抑圧の craniomedial の側面に、遠位、近位方向に滅菌 #15 メス刃で皮膚を切開します。膝蓋骨のレベルに近位部に約 1 cm の切開を開始し、約 5 mm 脛骨結節の遠位はそれを拡張します。</li>
	<li>#15 メス刃を持つ基になる皮下組織の解放によって膝蓋腱を公開するスキンが反映されます。</li>
	<li>
#15 メス刃を使用して、脛骨粗面に膝蓋骨の遠位面から各膝蓋腱 (1 mm) の中央 3 分の 1 を切除します。
	<ol>
<li>各肢 (図 2) の欠陥のサイズを標準化するためのテンプレートとして腱に対して 0.99 mm 径 Kirschner 金網を合わせます。</li>
		<li>(図 3) の腱の中央部分を分離する #15 メス刃を Kirschner 線の各側に 2 全層切開を作る。近位および遠位罰金アイリスはさみ (図 4) で中央部を切除します。</li>
		<li>膝関節の筋膜を閉じる前に 5.5 で説明したように、適切な治療グループの血栓 (混合細胞懸濁液および ACP) を挿入します。十字パターンと筋膜と皮膚 5-0 polyglactin 910 縫合糸 (図 5) を使って皮のパターンを閉じます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>対側の抑圧に手順を繰り返します。 注: 1 つの欠陥は無作為に治療 (キトサン エアコンまたは標準プレート上で培養した幹細胞)。対側の欠陥が内部統制として機能する、空のまま。</li>
	<li>手術後管理エンロフロキサシンの 4 錠 (2 mg/錠、経口投与、1 日 1 回) とメロキシカム錠 (2 mg/錠経口投与、1 日 1 回) を 7 日間。これらの用量は実験動物の獣医師が推奨され、IACUC プロトコルで承認します。</li>
</ol>5. 膝蓋腱欠損内の MSCs の配信
<ol><li>2 L/分 100% 酸素マスクを届け誘導室でピンチからつま先まで反射の消失までに 8% セボフルランを膝蓋腱欠損を作成使用されていない健康なラットを麻酔します。</li>
	<li>収集する 5 mL の血液心臓穿刺によって麻酔 Sprague-dawley ラット (成人男性、4-5 ヶ月、体重 350-375 g)、5 mL シリンジで酸-クエン酸-ブドウ糖 (5:1 v/v) 1 mL を含む 20 G 針で。</li>
	<li>ペントバルビ タール (100 mg/kg)、同じ麻酔中の intracardial 注入による心臓穿刺・採血後のラットを安楽死させます。</li>
	<li>室温で 15 分間 350 x g でサンプルを遠心します。上清を転送し、使用するまで-20 ° C で因数 (各 120 μ L) を格納します。</li>
	<li>体内注入の直前に上記の因数を解凍しミックス 0.5 x 10 と 20 μ L6 MSCs (1.9 または 3.1.2.1) からトリプシン/EDTA を用いた標準的な板から分離または (PBS/中) とフラッシュしてキトサン プレートから収集します。</li>
	<li>解凍プラズマ プラズマをアクティブにし、血栓の形成を誘導する 96 ウェル プレートのウェル内の残りの 100 μ L に 10% 塩化カルシウム (CaCl2) の 6 μ L を追加 (エアコン プラズマをアクティブ化: ACP)。</li>
	<li>細胞懸濁液 (20 μ L) をミックスし、ACP (100 μ L) (図 6) 血栓を形成します。膝関節の筋膜を閉じる前に作成した膝蓋腱欠損内血栓を配置 (4.10.3 の手順を参照してください)。</li>
</ol>6. 機能的予後
<ol><li>ラットのラット顔をしかめるスケール (RGS)37,38に基づいて、着床に腫れ、痛みの兆候を 1 日 2 回を監視します。 注: スコアリング システム (0-6) (0-3) サポート前肢と後肢の時間立っているを含む 3 の活動に基づく歩行の機能を評価するため開発された、時間自力で後肢に立って (0-2) と 17 cm プラスチック製ケージの壁 (0-1) (を登る能力表 1)。</li>
	<li>朝と夕方には平均スコアを計算する各時点のラットの 2 つの後肢に立って活動を評価します。</li>
	<li>ラット正常に登頂両後肢と 17 cm プラスチック製ケージの壁を登る能力を評価します。</li>
</ol>7. 総外観と膝蓋腱の病理組織学
<ol><li>(炎症の評価) に 7 日目にラットを安楽死させるか (組織の治癒を評価) に 28 日の投稿 (100 mg/kg) ペントバルビ タール麻酔 8% セボフルランと 2 L 100% 酸素マスクを介して配信の intracardial 注射治療。</li>
	<li>安楽死した後膝蓋腱-脛骨結節台メスとはさみを収穫します。軟部組織や靭帯膝蓋腱を除いて、抑圧の周りを削除します。</li>
	<li>外見と (図 7) 腱の肥厚のため検体を調べる。</li>
	<li>腱の近位部と外側面に 5.0 Polydioxanone の外科医の結び目を置くことによって試料に合わせます。10% 中性緩衝ホルマリン液で検体を修正し、各腱の中間部分から横断 (5 μ m) を取得します。</li>
	<li>ヘマトキシリンとエオシン、次の標準的なプロトコルを染色、マッソンの Trichrome を使用してセクションを染色します。</li>
	<li>炎症などの病理学的変化と同様、欠陥、内血腫の存在を検出するセクションを確認します。</li>
	<li>コラーゲン生、血管新生、および軟骨形成 (表 2)39度に基づいて、以前に発行されたスコアリング システムを使用してセクションの組織学的スコアを評価します。</li>
</ol>

著者はある利益相反を開示します。

馬のセルは、最終的に馬の自然な伸張の管理の候補者のアプローチをテストしていきますのでこのプロジェクトに選ばれました。確かに、馬の腱損傷は浅指屈筋と人間41アキレス腱の生物学的類似性のため男で寛解の自然なモデルとして訴えています。細胞表面マーカー CD44、CD90, CD105、CD34 と MHC II は、細胞、細胞療法42国際社会によって推薦の基準に従って診療に選ばれました。最近の調査で eqUCM MSCs され、CD44 のために肯定的な培養条件に関係なく CD34 と MHC II の負。CD90 の CD105、表面マーカーの発現の点で MSCs の基準を満たすことにより標準的な条件下で培養した細胞も陽性。さらに、本研究は、eqUCM MSCs は、ヒト MSCs19,20の以前のレポートを確認するキトサン フィルム上培養スフェロイドの形成の最初のレポートです。3 D 細胞培養の技術は何十年も生理学的ニッチに似た...

腱損傷は、種1にわたって大幅に痛みや筋肉萎縮の最も一般的な原因の 1 つです。獣医学で腱と靱帯損傷は、馬に特別な関心の競走馬のすべての傷害の 82% を含む筋骨格系とそれらの 46% の腱や靭帯の2,3に影響を与えます。瘢痕形成が癒される腱の力学的特性に影響を与えるし、屈筋腱の傷害後運動の使用へのリターンに守られた予後を説明します再傷害は最大で 2 年以内発生パワードップラーを馬の 67%4。再生医療は、伝統的な治療法に挑戦する条件に新しい選択肢を提供します。自家幹細胞療法はいくつかの励みになる結果5,6を生産しているが、組織の採取、細胞の処理/リプログラミングによる遅延管理の影響に関連する罹患率によって制限されます、幹の特性に (年齢) などの患者さんの健康状態は、7、8 を細胞します。これらの制限は、既製の代替として同種幹細胞を調査するための理論的根拠を提供します。胎児の付属器由来の細胞は、倫理的な問題および胚性幹細胞に関連する奇形腫形成の危険性を回避するために魅力的な候補です。胎児の付属器の中で臍帯マトリックス (UCM)、Wharton のゼリーとも呼ばれますが豊富、集めやすいです。
細胞ソースに関係なく幹細胞性を高めることは同種の再生医療細胞バンクの確立に不可欠です。機能的観点から自己複製と多系統分化9の可能性として幹細胞性を定義できます。幹細胞性の証拠は、アッセイ、遺伝子マーカー Oct4、 Sox2, Nanog9の式と一緒に増殖と分化に依存します。幹細胞性を強化する方法の 1 つは、void のフィラーと UCM MSCs の増殖・分化を高めるキャリアとして機能する生体材料の使用に依存します。このアプローチは、多能性細胞に成熟した細胞を再プログラムする転写因子の操作に関する懸念を排除できます。生体幹細胞の潜在的なキャリアとして考慮される間、キトサンは生体適合性と分解性10魅力的です。この天然アミノ多糖類は、主に上位製貝10品として得られる 2 番目の最も豊富な天然多糖類キチン質のアルカリ脱アセチル化によって形成されます。以前 MSCs とキトサン足場間の相互作用を調査して回転楕円体11,12,13,14,15,の形成の観察16. 我々 はまたキトサン行列12,13,14,15,16,17、軟骨分化の優位性を報告 18。最近では、2 つの独立した研究は、脂肪組織によってスフェロイド形成を説明および胎盤組織由来キトサン フィルム19,20上で培養した MSCs。回転楕円体のこの形成だけでなく、幹細胞性を強化、また生体内注入20後幹細胞の保存を改善しました。
有病率と罹患率の種にわたって寛解の伸張の病態を検討して幹細胞注射など新しい治療法をテストする実験モデルの開発を求めています。馬、コラゲナーゼによる腱鞘炎は腱修復21で MSCs を使用して有効性を発揮する一般的なモデルです。注射は急性炎症性変化を引き起こすので、このアプローチの妥当性は限られている、臨床の伸張は通常慢性の結果に対し22,23ストレスを掛けすぎています。さらに、腱の疾患の化学的誘導は治癒反応を誘発して症例22,23に障害の治癒過程をレプリケートしません。浅指屈筋腱の部分の切除は、馬24で腱鞘炎の手術モデルとして記載されています。最近では、低侵襲アプローチは、浅指屈筋腱25の中核への外傷性の損傷を制限する使用されました。手術モデルは自然な腱の病気につながる可能性があります、25を作成された損傷の範囲内の再現性に欠けがち疲労機構をシミュレートしません。モデル, 罹患率と腱の馬のモデルに関連付けられているコストに関係なく病気は体内の新規治療法の評価のための最初のステップとして齧歯動物モデルに関心を正当化するための制限です。
齧歯動物の実験モデルの主な利点の 1 つは、費用と個体間変動を制御する能力で構成されています。齧歯動物は、その急速な成長率により様々 な生理的要因に関して標準化することができますおよび短い寿命のスパンの変化の源を制限して、その違いを検出するために必要な動物の数を減らします。齧歯動物の腱疾患を誘導する戦略は、化学的誘導部分の腱欠陥21の外科的創造にもに依存しています。手術モデルの化学モデルをより自然な伸張をシミュレートすることが、高い罹患率と損傷した腱の壊滅的な障害につながることができます。その点、ラットだこれらのモデルのマウスよりもより良い候補者のサイズは、組織の治癒の評価を促進することにより、大規模な欠陥を作成できます。ラットは、4 つの主要な腱グループの伸張の実験的研究で使用されている: 腱、屈筋、アキレス、膝蓋腱26。これらのうち、膝蓋腱を含むモデルは、この腱の大きなサイズと27それへのアクセスの容易さのため特に魅力的です。膝蓋腱が脛骨粗面に大腿四頭筋をアタッチします。この伸筋機構内膝蓋骨は、大腿四頭筋の操作を指示し、膝蓋腱の近位の範囲を区別する種子骨です。膝蓋腱の近位と遠位の範囲で骨アンカーの存在生体力学的テストが容易になります。通常膝蓋腱を含むモデルは、コントロール28,29として対側そのまま腱の片側手術の欠陥に依存します。最も一般的な膝蓋腱欠損モデルは、対側の膝蓋腱がそのまままま、脛骨粗面の挿入に膝蓋骨の遠位の頂点から膝蓋腱の中央部分 (幅 1 mm) を切除します。組織、非破壊力学的試験や生体力学的障害、超音波画像診断、 ex vivo蛍光イメージング、肉眼観察および機能テスト28,30 をテスト結果の措置が含まれています。 ,31。一方的なモデルは提案された治療と同じ動物内で同様の負傷の保守的な管理とを比較できないようにします。同様に、いくつかの治療の比較では、別の動物が必要です。二国間のモデルは個体間変動を取り除き、32の研究に必要な動物の数を減らすでしょう。しかし、二国間の傷害の罹患率を高める可能性があり、二国間跛行の治療評価を妨げる可能性が。簡単にいくつかの研究のレポート モデル33,34の罹患率・周術期管理ではなく、治療の効果に関する両側膝蓋腱欠損ラットがフォーカスの使用。
この研究の長期的な目標は、UCM MSCs 宛ての同種移植の幹細胞性と生体内での生存率を改善するための戦略を開発することです。この目標を達成するために最近キトサン フィルムと35低酸素環境下での培養でスフェロイドの形成による UCM MSCs の改良された幹細胞性を報告した.これらの体外プロパティ エアコン UCM と扱われる膝蓋腱欠損の改善された生体力学的特性と関連していた-MSCs これらの結果に基づいて、ラット両側膝蓋腱欠損モデルが候補者をテストするには適しているようだ。腱の傷害の36のトリートメント。研究の目的は、分離とキャラクタリゼーション UCM MSCs の幹細胞、作成と両側膝蓋骨腱障害、手術後の治療のための生物学的デリバリー システムの準備のための詳しいプロトコルを提供するためにはここで報告回復と組織欠陥の中に癒しの評価。

<table><tbody><tr><td>PBS 10x</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IA型</td><td>Worthington</td><td>LS004197</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>DMEM 低グルコース</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.FS</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ハイクロン</td><td>SH30910.03</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン 100x</td><td>ハイクロン</td><td>SV30010</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>トリプシン 0.25%</td><td>ハイクロン</td><td>SH30042.01</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>革新的な細胞技術</td><td>AT104</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>ハイクロン</td><td>SV30084.01</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td></td><td>Σ D2650</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>キトサン</td><td>Σ</td><td>C3646</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S8045</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ウシ血清 アルブミン</td><td>ハイクロン</td><td>SH30574.01</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>丸底ポリスチレンチューブ</td><td>コーニング</td><td>149591A</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>マウス抗ウマ CD44 (FITC)</td><td>AbD セロテック</td><td>MCA1082F</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>マウス 抗ラット CD90 (FITC)</td><td>AbD セロテック</td><td>MCA47FT</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>マウス 抗ウマ MHC-II (FITC)</td><td>AbD セロテック</td><td>MCA1085F</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>マウス IgG1 (FITC) - アイソタイプコントロール</td><td>AbD セロテック</td><td>MCA928F</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル [SN6] から CD105 (FITC)</td><td>abcam</td><td>ab11415</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>マウス IgG1 (FITC) - アイソタイプ制御</td><td>abcam</td><td>ab91356</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>マウス 抗ヒト CD34 (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB560942</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>マウス IdG1 κ (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB555748</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD</td><td>BDB559925</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>Vacutainer 5 mL</td><td>Med Vet International</td><td>RED5.0</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>酸-クエン酸-デキストロース</td><td>Σ</td><td>C3821</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td></td><td>Σ C5670</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>セボフルラン</td><td>JD Medical</td><td>60307-320-25</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ラット</td><td>チャールズ川</td><td>ひずみコード:400</td><td>実験動物</td></tr><tr><td>ラット手術キット</td><td>ハーバード</td><td>728942</td><td>装置</td></tr><tr><td>外科用ブレード #15</td><td>MEDLINE</td><td>MDS15115</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ラット MD のバイトリル (2 mg/錠剤)、 リマジル (2 mg/錠剤)</td><td>バイオサーブ</td><td>F06801</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ポリグラクチン 910、5-0</td><td>エチコン</td><td>J436G</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>エオシン アルコール シャンドン</td><td>サーモ科学</td><td>6766007</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Thermo scientific</td><td>143907</td><td>消耗品</td></tr></tbody></table>

ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

再生医療は、伝統的な治療法に挑戦する条件に新しい選択肢を提供します。有病率と罹患率、生物種間の寛解のこの組織の限られた癒しのプロパティと組み合わせて細胞療法に関する検索を求め、その有効性を検討するための実験モデルの開発を推進します。臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞 (UCM MSC) は、豊富な簡単に収集、倫理的な問題と奇形腫形成の危険性回避まだ原始胚性幹細胞をもっと密接に類似している魅力的な候補者よりも大人の組織由来の MSCs。 重要な関心は、スフェロイドの形成を通じて MSCs のプロパティを強化する戦略としてキトサンを重視しています。UCM-MSCs を分離するこの紙詳細テクニックはキトサン フィルムの回転楕円体を準備し、表面マーカー式回転楕円体形成の効果を分析します。その結果、キトサン膜上に形成した UCM MSC 回転楕円体の体内注入のラットの両側膝蓋腱損傷モデルの作成を説明します。合併症を認めなかった罹患率に関して研究、ストレス上昇の効果、または組織感染症。7 日手術群の合計機能スコアは正常ラットよりも低かったが、手術後 28 日以内に正常に返されます。組織の治癒の組織学的スコアは、異物反応と 28 日で治癒の進行がないこと 7 日間に評価処理の欠陥で血栓の存在を確認しました。この両側膝蓋腱欠損モデルが許容可能な罹患率に関連付けられているは、未処理の腱とトリートメントの違いの検出を許可各ラットにおける内部統制の作成による個体間変動を制御します。

現在の研究では、平均 ± SD (標準偏差) に結果が表示されます。セルは 6 馬のへその緒から隔離され標準またはキトサンのエアコンの下で各細胞の表面マーカーを表現する分離細胞の割合を比較したフリードマン検定との非パラメトリック解析の分散として繰り返し対策。腱欠損モデル作成用 7 日術後評価 8 ラットを用い、12 ラット 28 日間評価のため使用されました。機能結果の結果は ± SEM (平均値の標準誤差) を意味するように表示されます、t 検定を用いて比較しました。UCM は、その豊富なコレクション、およびその他胎児ソルーション ソース40を基準にして優れた拡散性により細胞ソースとして選ばれました。UCM 標準プレート上で培養した細胞には、拡大中の線維芽細胞のような形が維持されます。セルは、キトサン プレート (図 8) で培養したときの回転楕円体を形成しました。
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準備とラットの両側膝蓋腱欠損モデル臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞スフェロイドの評価について述べる。このモデルは、未処理と処理の腱との間の違いを検出する発見だったし、2 処置間テスト許容罹患率に関連付けられていた。

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

この両側ラットモデルの全体的な目標は、動物の使用を最適化し、腱欠損の治療候補を評価することです。この方法は、整形外科分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。腱鞘炎に対する細胞療法の評価など。このモデルの主な利点は、個体間変動を制御することで、治療間の違いを検出するために必要な動物の数を減らすことです。ラットの両側標準化された膝蓋腱欠損の作成を学ぶのが難しいため、モデルの視覚的なデモンストレーションは重要です。このモデルには、局所的な解剖学に関する十分な知識、強力な基本的な手術スキル、および小さな構造物に取り組む際の精度が必要です。まず、採取したウマの臍帯を、抗生物質を含む室温のPBSを使用して、50ミリリットルのチューブで2回洗浄します。次に、組織を150ミリメートルのプレートに移し、2インチの長さの断片に切片化します。次に、断片を50ミリリットルのチューブに移し、抗生物質を含むPBSで洗浄して血液を取り除きます。これを室温で2〜3回行います。次に、臍帯の断片化された部分を縦方向に切断して、その長さを走る血管を露出させます。鉗子とハサミを使用して、2つの動脈と静脈を含むこれらの血管を取り除きます。次に、2つまたは3つのフラグメントから、血管を囲むゼリー状のマトリックスを収集します。メスで削り取ります。次に、ウォートンのジェリーとしても知られるゼリー状のマトリックスを細かく刻みます。次に、ゼリーをPBS中の0.1%コラゲナーゼ1A型1Aを15ミリリットル含んだ50ミリリットルのチューブに移し、組織を完全に溶解するまで3〜4時間穏やかに振とうしながら摂氏37度で組織をインキュベートします。次に、消化された組織を遠心分離し、上清を吸引します。次に、消化した組織を15ミリリットルのPBSに懸濁し、ピペッティングで混合します。次に、この洗浄をPBSで3回繰り返し、低速の遠心分離を行います。最後の洗浄後、細胞を15ミリリットルのPBSに再懸濁し、100ミクロンの細胞ストレーナーを使用して細胞をろ過し、150 gで5分間遠心分離して細胞を収集します。37°Cの10ミリリットルの新しくできた培養培地に細胞を再懸濁します。懸濁液を25平方センチメートルの培養フラスコに移し、細胞をインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、それらを継代し、培地を吸引し、抗生物質を含まない室温PBSで細胞を2回洗浄します。次に、3ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを使用して細胞を分離します。6ミリリットルの温かい培地を加えて反応を終了します。懸濁した細胞を採取し、ペレット化します。上清を捨て、ペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁します。継代を完了するには、1平方センチメートルあたり5, 000個の細胞を含む組織培養フラスコを再播種し、培養を続けます。まず、新鮮なキトサン溶液を準備します。次に、12ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルの溶液をロードします。プレートを渦巻き状にして、溶液をすべての表面に分散させます。次に、層流キャビネットの下でプレートを乾燥させます。16〜24時間後、プレートウェルにキトサンの薄膜が形成されます。各ウェルに0.5の通常の水酸化ナトリウム1ミリリットルを追加して、このフィルムを中和します。その後、プレートを室温で2時間インキュベートします。その後、各ウェルから水酸化ナトリウムを吸引し、次に各ウェルを1ミリリットルの蒸留水で洗浄します。3回の水洗浄を行い、その後、各ウェルを1ミリリットルの70%エタノールで1回洗浄します。エタノール洗浄液を取り除いた後、別のミリリットルの70%エタノールと交換し、プレートを層流キャビネットで一晩インキュベートしてキトサンフィルムを滅菌します。その後、翌日、各ウェルから残りのエタノールを吸引し、各ウェルをPBSで3回洗浄します。PBSを取り外し、蓋なしで紫外線に直接一晩さらしてキトサンフィルムをさらに滅菌します。今度は、臍帯によって導かれる間葉系幹細胞のスフェロイドを形作るために、20, 000の細胞を井戸に播種し、正常なか低酸素の条件下で版を孵化させます。麻酔をかけたラットを温水で満たされた2つの0.5リットルのボトルの間に置き、ボトルを布で覆って、皮膚の損傷を引き起こさずにラットを暖かく保ちます。低体温症のリスクを減らすために、プチプチで体を覆います。次に、皮膚の外傷を避けるために、両方の窒息物に脱毛クリームを塗り、舌圧子を使用してクリームと髪を取り除きます。次に、各手足をテーブルにテープで固定します。次に、手術部位をジグルコン酸クロルヘキシジンでこすり洗いし、70%エタノールですすいでください。これを3回繰り返して、手術を進めます。滅菌番号15メスを使用して、窒息物の頭蓋内側の近位方向から遠位方向に皮膚を切開します。膝蓋骨のレベルから近位約1センチメートルの切開を開始し、脛骨結節まで遠位に約5ミリメートル伸ばします。次に、メスで下にある皮下組織を解放し、皮膚を反射させて膝蓋腱を露出させます。次に、直径0.99ミリメートルのキルシュナーワイヤーを膝蓋骨の遠位面と脛骨結節の間の膝蓋腱に位置合わせします。次に、ワイヤーを安定させたまま、メスを使ってワイヤーの両側を切開し、腱の幅を約1mm幅に解放します。次に、細い虹彩はさみを使用して中央部分を近位および遠位に切除します。並行して、アシスタントに血栓を準備してもらいます。これを行うには、血漿サンプルを解凍し、20マイクロリットルを50万個の間葉系幹細胞と混合します。次に、微量遠心チューブ内で、6マイクロリットルの10%塩化カルシウムと100マイクロリットルの融解プラズマを混合すると、そのプラズマが活性化されます。次に、細胞懸濁液を活性化血漿に混合すると、血漿が凝固します。次に、準備した血栓を膝蓋腱欠損内に配置します。血栓からの体液放出を最小限に抑えるために、血栓の操作を制限します。次に、5 o ポリグラクチン9 10縫合糸を使用して、血栓を妨げることなく十字靭帯パターンで筋膜を慎重に閉じます。皮内パターンで皮膚を閉じて仕上げます。細胞を6頭の牝馬の臍帯から単離し、標準条件下でまたはキトサンフィルム上で培養した。キトサンで培養した細胞はスフェロイドを形成しました。膝蓋腱欠損モデルは多くのラットでテストされ、一連の行動テストを使用して回復を推定しました。術後 28 日までに、ラットは、術後 7 日目に測定された最初の筋力の低下の後、ベースラインの筋力に戻りました。マッソントリクローム染色による組織学的検査では、中等度の動脈および毛細血管浸潤が認められ、中等度から広範なコラーゲン形成が認められましたが、軟骨形成は支持されませんでした。全体として、両側膝蓋腱欠損モデルは、有意な罹患率なしに個人間変動を制限します。したがって、試験に必要な動物の数を減らすことができます。このビデオを見た後、ラットの両側膝蓋腱窓欠損モデルを作成する方法と、ラットがこの手術からどのように回復するかについて十分に理解しているはずです。習得すれば、3人の研究者で30分以内に手順を行うことができます。最初の研究者は細胞を準備し、2番目の研究者は手術を行い、3番目の研究者は手術を支援し、麻酔を監視します。この手順に続いて、生体力学的試験、組織学、免疫組織化学などの方法を使用して、腱の治癒に対する治療の効果を比較することができます。

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学ぶラットの両側膝蓋腱損傷モデルを用いた幹細胞療法の評価方法。臍帯由来間葉系幹細胞スフェロイドによる腱治癒の効果を検証し、個体差を最小化して治療効果を正確に評価する手法を解説します。

ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

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