ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

この両側ラットモデルの全体的な目標は、動物の使用を最適化し、腱欠損の治療候補を評価することです。この方法は、整形外科分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。腱鞘炎に対する細胞療法の評価など。

このモデルの主な利点は、個体間変動を制御することで、治療間の違いを検出するために必要な動物の数を減らすことです。ラットの両側標準化された膝蓋腱欠損の作成を学ぶのが難しいため、モデルの視覚的なデモンストレーションは重要です。このモデルには、局所的な解剖学に関する十分な知識、強力な基本的な手術スキル、および小さな構造物に取り組む際の精度が必要です。

まず、採取したウマの臍帯を、抗生物質を含む室温のPBSを使用して、50ミリリットルのチューブで2回洗浄します。次に、組織を150ミリメートルのプレートに移し、2インチの長さの断片に切片化します。次に、断片を50ミリリットルのチューブに移し、抗生物質を含むPBSで洗浄して血液を取り除きます。

これを室温で2〜3回行います。次に、臍帯の断片化された部分を縦方向に切断して、その長さを走る血管を露出させます。鉗子とハサミを使用して、2つの動脈と静脈を含むこれらの血管を取り除きます。

次に、2つまたは3つのフラグメントから、血管を囲むゼリー状のマトリックスを収集します。メスで削り取ります。次に、ウォートンのジェリーとしても知られるゼリー状のマトリックスを細かく刻みます。

次に、ゼリーをPBS中の0.1%コラゲナーゼ1A型1Aを15ミリリットル含んだ50ミリリットルのチューブに移し、組織を完全に溶解するまで3〜4時間穏やかに振とうしながら摂氏37度で組織をインキュベートします。次に、消化された組織を遠心分離し、上清を吸引します。次に、消化した組織を15ミリリットルのPBSに懸濁し、ピペッティングで混合します。

次に、この洗浄をPBSで3回繰り返し、低速の遠心分離を行います。最後の洗浄後、細胞を15ミリリットルのPBSに再懸濁し、100ミクロンの細胞ストレーナーを使用して細胞をろ過し、150 gで5分間遠心分離して細胞を収集します。37°Cの10ミリリットルの新しくできた培養培地に細胞を再懸濁します。

懸濁液を25平方センチメートルの培養フラスコに移し、細胞をインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、それらを継代し、培地を吸引し、抗生物質を含まない室温PBSで細胞を2回洗浄します。次に、3ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを使用して細胞を分離します。

6ミリリットルの温かい培地を加えて反応を終了します。懸濁した細胞を採取し、ペレット化します。上清を捨て、ペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁します。

継代を完了するには、1平方センチメートルあたり5, 000個の細胞を含む組織培養フラスコを再播種し、培養を続けます。まず、新鮮なキトサン溶液を準備します。次に、12ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルの溶液をロードします。

プレートを渦巻き状にして、溶液をすべての表面に分散させます。次に、層流キャビネットの下でプレートを乾燥させます。16〜24時間後、プレートウェルにキトサンの薄膜が形成されます。

各ウェルに0.5の通常の水酸化ナトリウム1ミリリットルを追加して、このフィルムを中和します。その後、プレートを室温で2時間インキュベートします。その後、各ウェルから水酸化ナトリウムを吸引し、次に各ウェルを1ミリリットルの蒸留水で洗浄します。

3回の水洗浄を行い、その後、各ウェルを1ミリリットルの70%エタノールで1回洗浄します。エタノール洗浄液を取り除いた後、別のミリリットルの70%エタノールと交換し、プレートを層流キャビネットで一晩インキュベートしてキトサンフィルムを滅菌します。その後、翌日、各ウェルから残りのエタノールを吸引し、各ウェルをPBSで3回洗浄します。

PBSを取り外し、蓋なしで紫外線に直接一晩さらしてキトサンフィルムをさらに滅菌します。今度は、臍帯によって導かれる間葉系幹細胞のスフェロイドを形作るために、20, 000の細胞を井戸に播種し、正常なか低酸素の条件下で版を孵化させます。麻酔をかけたラットを温水で満たされた2つの0.5リットルのボトルの間に置き、ボトルを布で覆って、皮膚の損傷を引き起こさずにラットを暖かく保

低体温症のリスクを減らすために、プチプチで体を覆います。次に、皮膚の外傷を避けるために、両方の窒息物に脱毛クリームを塗り、舌圧子を使用してクリームと髪を取り除きます。次に、各手足をテーブルにテープで固定します。

次に、手術部位をジグルコン酸クロルヘキシジンでこすり洗いし、70%エタノールですすいでください。これを3回繰り返して、手術を進めます。滅菌番号15メスを使用して、窒息物の頭蓋内側の近位方向から遠位方向に皮膚を切開します。

膝蓋骨のレベルから近位約1センチメートルの切開を開始し、脛骨結節まで遠位に約5ミリメートル伸ばします。次に、メスで下にある皮下組織を解放し、皮膚を反射させて膝蓋腱を露出させます。次に、直径0.99ミリメートルのキルシュナーワイヤーを膝蓋骨の遠位面と脛骨結節の間の膝蓋腱に位置合わせします。

次に、ワイヤーを安定させたまま、メスを使ってワイヤーの両側を切開し、腱の幅を約1mm幅に解放します。次に、細い虹彩はさみを使用して中央部分を近位および遠位に切除します。並行して、アシスタントに血栓を準備してもらいます。

これを行うには、血漿サンプルを解凍し、20マイクロリットルを50万個の間葉系幹細胞と混合します。次に、微量遠心チューブ内で、6マイクロリットルの10%塩化カルシウムと100マイクロリットルの融解プラズマを混合すると、そのプラズマが活性化されます。次に、細胞懸濁液を活性化血漿に混合すると、血漿が凝固します。

次に、準備した血栓を膝蓋腱欠損内に配置します。血栓からの体液放出を最小限に抑えるために、血栓の操作を制限します。次に、5 o ポリグラクチン9 10縫合糸を使用して、血栓を妨げることなく十字靭帯パターンで筋膜を慎重に閉じます。

皮内パターンで皮膚を閉じて仕上げます。細胞を6頭の牝馬の臍帯から単離し、標準条件下でまたはキトサンフィルム上で培養した。キトサンで培養した細胞はスフェロイドを形成しました。

膝蓋腱欠損モデルは多くのラットでテストされ、一連の行動テストを使用して回復を推定しました。術後 28 日までに、ラットは、術後 7 日目に測定された最初の筋力の低下の後、ベースラインの筋力に戻りました。マッソントリクローム染色による組織学的検査では、中等度の動脈および毛細血管浸潤が認められ、中等度から広範なコラーゲン形成が認められましたが、軟骨形成は支持されませんでした。

全体として、両側膝蓋腱欠損モデルは、有意な罹患率なしに個人間変動を制限します。したがって、試験に必要な動物の数を減らすことができます。このビデオを見た後、ラットの両側膝蓋腱窓欠損モデルを作成する方法と、ラットがこの手術からどのように回復するかについて十分に理解しているはずです。

習得すれば、3人の研究者で30分以内に手順を行うことができます。最初の研究者は細胞を準備し、2番目の研究者は手術を行い、3番目の研究者は手術を支援し、麻酔を監視します。この手順に続いて、生体力学的試験、組織学、免疫組織化学などの方法を使用して、腱の治癒に対する治療の効果を比較することができます。