Name: バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 DNA 磁性粒子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶ動的光散乱と電気泳動光散乱を用いたDNA磁性粒子の結合解析法。粒子サイズ、ゼータ電位、ポリ分散性の変化を可視化し、バイオテクノロジー研究や分子診断への応用可能性を評価します。

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チェコ科学財団 (プロジェクト GA CR 17 12816S) と CEITEC 2020 (LQ1601) による金融支援は大きく認められています。

1 磁気ナノ粒子合成 <ol>クエン酸 (MNPs) で安定した磁性ナノ粒子の合成 <ol><li>した FeCl 3 の追加 20 モル <li>&#8729; 6 H 2 O (5.406 g) とした FeCl の 10 m モル。2 &#8729; 4 H 2 O (1.988 g) 20 mL の脱酸素化二重蒸留水 (ddd 水) で。透過的なソリューションが得られるまで機械的撹拌機を使用して N 2 雰囲気下でビーカーに積極的に解決策を得た攪拌します</li>。
		<li>急速な機械的攪拌下 1 M NH 4 ああ、一滴ずつ滴下漏斗 (取る 1 時間またはそれ以上必要な場合) を使用して 150 mL を加えます。すべて NH 4 OH が追加された後は、雄ねじの容器にソリューションを転送します。75 ° C、30 分で容器および熱ソリューションをねじ 
		注意: NH 4 OH は分類される腐食性と環境のために危ない 。
		注: 高級 28% NH 4 脱酸素水を用いた水中の OH から NH 4 ああソリューションの準備します</li>。
		<li>は、磁石と洗浄を使用して ddd 水 100 mL を使用して黒い沈殿物を収集します。3 回繰り返します。0.5 M 三ナトリウム クエン酸二水和物を沈殿させるの 50 mL を追加します。容器をネジします 。
		注: 三ナトリウム クエン酸水和物の脱酸素化のソリューションを使用します</li>。
		<li>は再 (35 kHz、100% の振幅) は超音波処理と 1 h. 80 ° C で熱槽で沈殿物を分散 
		注: 十分な力の超音波発生装置が必要です</li>。
		<li>では、部屋の温度のソリューションを冷ます。磁石を用いた沈殿物を収集し、上清を除去します。超音波発生装置 (35 kHz、100% の振幅) を使用して ddd 水 50 mL の黒泥を再分散します</li>。
		<li>は、50 mL の遠心管に因数 (〜 25 mL) を転送し、アセトン 20 mL を加えます。10 分間 2400 x g で遠心し、上清を削除します</li>。
		<li>再沈殿物を分散し、適切な音量の低分子量カットオフ透析装置 (500-1,000 Da) を用いた 24 時間水に対するソリューションを dialyze 
		注: は、メーカーによると透析デバイスを準備 &#39; s 要件</li>。
	</ol></li> <li>分岐ポリエチレンイミン (MNPs_PEI) に変更された磁性ナノ粒子の合成 <ol><li>ガラス ビーカーに得られた MNPs ソリューション (~0.1 g/mL) 2 mL を加えます。38 mL の ddd 水を追加し、超音波 (35 kHz、100% の振幅) 懸濁液 (10 分) です</li>。
		<li>急速な機械的攪拌下 10 %10 mL 分岐ポリエチレンイミン (平均 25 kDa) に追加します。その後 3 h のためのソリューションをかき混ぜる</li>
		<li>収集は、磁石を使用して沈殿し、上清を除去します。Ddd 水 20 mL で沈殿物を再分散します。最終的な懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射を 5 回繰り返します</li>。
	</ol></li> <li>磁性ナノ粒子の合成修飾シリカ (MNPs_TEOS) <ol><li>ガラス ビーカーに得られた MNPs 溶液 (~0.1 g/mL) 10 mL を追加。水とエタノールの 130 mL 60 mL を追加します。超音波ソリューションおよび 28% NH 4 オハイオ州の 6 mL を追加します</li>。
		<li>急速な機械的攪拌下オルトケイ酸テトラエチルの 1 mL を追加します。その後 12 h. のためのソリューションをかき混ぜる</li>
		<li>磁石を用いた黒い沈殿物を収集し、それを洗ってエタノール 50 mL (3 回) を使用して、水 50 mL (3 回)。Ddd の 10 mL に再分散粒子が水し、懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波</li>。
	</ol></li> <li>(MNPs_APTES) のアミノ基修飾磁性ナノ粒子の合成 <ol><li>ガラス ビーカーに得られた MNPs_TEOS 溶液 (~0.1 g/mL) 5 mL を追加。45 mL の水、エタノール 50 mL を追加します。超音波ソリューション (35 kHz、100% の振幅).</li>
		<li>急速な機械的攪拌下で 0.5 mL (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシランを追加。その後 3 h のためのソリューションをかき混ぜる</li>
		<li>磁石を用いた黒い沈殿物を収集し、それを洗ってエタノール 50 mL (3 回) を使用して、水 50 mL (3 回)。Ddd の 5 mL 中の粒子の再分散水し、懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射します</li>。
	</ol></li></ol> 2。磁気微粒子合成 <ol><li><ol><li>2 M 自演 3、1 M 島の 12.5 mL 205.875 mL の雄ねじの容器に ddd 水の追加 25 mL を クエン酸 (Mmp) と安定化磁気微粒子の合成 します。磁気攪拌中 1 M FeSO 4 6.675 mL を追加します。予熱した水浴 (90 ° C) 2 のためにすぐに転送容器 
		注: が自演 3 と ddd では水酸化カリウム水溶液が水を準備します</li>。
		<li>では、部屋の温度のソリューションを冷ます。磁石と洗浄を使用して ddd 水 50 mL (5 回) を使用して黒い沈殿物を収集します。0.5 M 三ナトリウム クエン酸二水和物を沈殿させるの 50 mL を追加します。容器をネジします</li>。
		<li>(35 kHz、100% の振幅) は超音波処理と磁石と洗浄 (10 回) ddd 水 50 mL を使用して使用して 1 h. 収集黒い沈殿物の 80 ° C で熱槽で沈殿物を redisperse.</li>
		<li>変更 Mmp 分岐ポリエチレンイミン (MMPs_PEI) とシリカ (MMPs_TEOS)、アミノ基 (MMPs_APTES) MNPs プロトコルに似ています。詳細については、それぞれのセクション 2.2、2.3、2.4 を参照してください</li>。
	</ol></li> <li>分岐ポリエチレンイミン (MMPs_PEI) を使用して変更磁気微粒子の合成 <ol><li>ガラス ビーカーに Mmp 溶液 (~0.1 g/mL) 5 mL を追加。38 mL の ddd 水を追加し、ソリューション (35 kHz、100%、10 の最小の振幅) を超音波照射します。急速な機械攪拌下で 10% の 10 mL 分岐ポリエチレンイミン (平均 25 kDa) を追加します。その後 3 h のためのソリューションをかき混ぜる</li>
		<li>は、磁石を使用して沈殿物を収集し、上清を除去します。二重蒸留水 20 mL に沈殿物を redisperse します。最終的な解決 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射を 5 回繰り返します</li>。
	</ol></li> <li>磁気微粒子シリカ (MMPs_TEOS) を使用して変更の合成 <ol><li>ガラス ビーカーに Mmp 溶液 (~0.1 g/mL) 5 mL を追加。水とエタノールの 130 mL 60 mL を追加します。懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波し、28% NH 4 オハイオ州の 6 mL を追加します</li>。
		<li>急速な機械的攪拌下オルトケイ酸テトラエチルの 1 mL を追加します。その後 12 h. のためのソリューションをかき混ぜる</li>
		<li>磁石を用いた黒い沈殿物を収集し、それを洗ってエタノール 50 mL (3 回) を使用して、水 50 mL (3 回)。Redisperse 5 mL の ddd 水の粒子と懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射します</li>。
	</ol></li> <li>(MMPs_APTES) のアミノ基修飾磁性微粒子の合成 <ol><li>ガラス ビーカーに 3 mL の MMPs_TEOS 溶液 (~0.1 g/mL) を追加。45 mL の水、エタノール 50 mL を追加します。懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射します</li>。
		<li>急速な機械的攪拌下で 0.5 mL (3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシランを追加。その後 3 h のためのソリューションをかき混ぜる</li>
		<li>磁石を用いた黒い沈殿物を収集し、それを洗ってエタノール 50 mL (3 回) を使用して、50 mL の水 (3 時間)。Redisperse 3 mL の ddd 水の粒子と懸濁液 (35 kHz、100% の振幅) を超音波照射します</li>。
	</ol></li></ol> 3。磁気粒子サイズ解析を使用して DL 後方散乱検出器角度 (173 °) と 633 のビームの波長に適用されます <ol><li>水粒子径 <ol><li>使用、DLS 楽器 nm 。
		注: 後方散乱 DLS 多重散乱を避けることができる集中されたサンプルに適しています。DLS は小さい粒子に適しており粒子をそれぞれ混合側散乱 (検出器角度 90 °) と前方散乱 (検出器角度 15 °) です</li>。
		<li>前に、水の測定に超音波粒子 3 分 
		注: は、粒子の希釈液を使用します。この目的のための水 96 μ L で 9.6 μ 粒子をミックスします</li>。
		<li>慎重にポリスチレン ・ ラテックス粒子溶液 50 μ L をピペットします。キュベットの泡の形成を避けるためと 。
		注: 各サンプルでは、使い捨てのキュベット (材料の表を参照) を使用します</li>。
		<li>は、キュヴェットの明快さと光ビームの方向に注意してください。サンプル ホルダーにセルを挿入し、商工会議所を閉じます</li>。
		<li>測定の次のパラメーターを使用して、: 気温: 25 ° C; 分散相 (鉄) の屈折率: 2.344; 屈折率分散環境 (水): 1.333 
		注: 小説やハイブリッド材料を開発するときに特により正確な結果を得るのため、糖度計を用いた屈折測定を実行します</li>。
	</ol></li></ol> 4。DNA、磁性粒子と結合バッファーを準備する <ol><li>DNA 株式 <ol><li>使用 10 mM トリス塩酸バッファー (pH = 8) の希釈と DNA の。研究室 (反応設定と条件のセクション 5.2 を参照) で直接 PCR のプロトコルと特異的増幅することができる標準的な DNA のサンプルを使用します。バクテリオファージ λ コントロールから x 遺伝子の 498 の塩基対 (bp) を増幅する、次のプライマーを使用します。プライマーを転送: 5 &#39; - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ逆プライマー: 5 &#39; - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 &#39;</li> <li>商業 DNA 精製キットを使用して PCR の浄化製品 。
		注: シリカ列ベースのプロシージャを使用して商業キット収量 &#62; 100 ng/μ L は、DNA を精製した</li>。
		吸光光度法を用いた DNA の <li>測定濃度 (吸光度 260 nm)。10 の作業ソリューションを上記の手順で 10 11 コピー/μ L の DNA 株式を希釈 10 10 9 10 8、および 10 の 7 のコピー/μ L 。
		注: PCR の製品のコピーの数は、平均分子量はそれぞれ bp の 650 Da と仮定すると、次の式に従って計算できます: DNA コピー/μ L = (ng/μ L の量 * 6.022x10 23 コピー/mol)/(498 bp * bp の 650 g/mol* 1 x 10 9 ng/g)</li></ol></li> <li>磁性粒子 <ol><li>磁石なし堆積物粒子を許可し、上清を除去。ミックス 1:20 v/v 比磁性粒子の ddd 水 (粒子: 水). 
		メモ: ボリューム ベースのアプローチは MNPs および Mmp の等しい固まりが容易に比較することは困難だったので、磁性粒子の量を記述するため使用します</li>。
	</ol></li> <li>バッファーをバインド <ol><li>0.75 M ナトリウム酢酸塩酸溶液の急速な準備のため (pH = 6)、ミックスの 3 M 酢酸ナトリウム 1 mL の 1 mM 塩酸 3 mL と 。
		注意: バインディングで使用されるすべてのソリューションが 4 で保存することができます ° C. 注意低温が特にエタノール溶液の場合バインディングを大幅に増加します。慎重に良い再現性のためのソリューションの温度およびスクリーニングの精度を制御します</li>。
	</ol></li></ol> 5。効率の DNA 分離を使用して量的な PCR のテスト <ol><li>Mmp または MNPs の変更によって DNA の隔離 <ol><li>96 ウェル プレートと少量の実験のための 96 ウェル プレート用にカスタマイズされた磁石を使用します</li>。
		<li>次のバインディング解決の混合物を使用: 8 μ L 変更 Mmp または MNPs、10 μ L ナトリウム酢酸塩酸 (0.75 M、pH = 6)、60 μ L の 85% のエタノール、10 μ L の DNA (10 10 コピー ソリューション).</li>
		<li>ミックスはピペッティングでよくし、3 分のための磁石のプレートを配置します。プレートは、磁石では、ソリューションを削除および洗浄のための 85% のエタノールを 100 μ l 添加します</li>。
		<li>エタノール削除します 。
		注: 許可して数秒間乾燥するエタノールが粒子を過剰に乾燥や亀裂をさせてください。溶出溶液で溶解できない粒子を過剰に乾燥する場合</li>。
		<li>は、磁石からプレートを削除し、溶出溶液 40 μ L を追加します。ピペッティングでよく混ぜます。背面磁石プレートを置き、溶離された DNA を収集 (~ 37 μ L)。さらに分析まで-20 ° C で溶離液を格納します</li>。
	</ol></li> <li>定量 PCR <ol><li>Haddad ら によってプロトコルに従ってステップ x 遺伝子のコピーを定量化する 4.1.1 入荷 DNA を準備するために使用されたプライマーを使用します 。10</li> <li>テストされるべきサンプルの量に応じてマスター ミックス溶液を調製し、PCR チューブや白い背景の 96 ウェル プレートに混合物を配布します</li>。
		<li>20 μ L の pcr の完全なボリュームの次の数量を使用: 10 μ L ポリメラーゼ間染料混合物をインターカ レート/(材料の表を参照)、2 μ L の DNA のサンプル、2 μ L 前方プライマー (10 μ M)、2 μ L 逆プライマー (10 μ M)</li>
		<li>たちによると、次のプログラムを設定: 95 ° C、120 s、40 サイクル (95 ° C、15 s、64 ° C、15 s、45 68 ° C s)、68 ° C で 5 分間</li>
		使用を標準とサンプル、トリプリケート <li>サイクルしきい値を計算し、各サンプルの取得 DNA のコピーの数を推定するための標準曲線を構築します。ここで使用される楽器はこれを自動的に行います</li>。
		<li>総溶出容量 (~ 40 μ L) の DNA のコピーの数を推定するここでは。0 に 100 時間外 DNA ソリューション (完全 10 11 コピー) をバインディングに追加する元の金額に対応する取得の割合が変わることができる</li>。
	</ol></li></ol> 6。DNA 磁気粒子結合解析を使用して DL (1.5 mL チューブ) で <ol>大量の DNA 結合 <ol><li><li>実験使用次のバインディング溶液混合: 96 μ L 変更 Mmp または MNPs、120 μ L ナトリウム酢酸・塩酸(0.75 M、pH = 6)、720 85% エタノール, 120 μ L の DNA の μ L (10 10 コピー ソリューション) または 120 μ L トリス塩酸バッファー (10 mM、pH = 8) コントロール</li>。
	</ol></li> <li>ゼータ電位解析 <ol><li>準備 2 バインド ソリューション、DNA との 1 つおよび 6.1.1 のステップの手順に従って、コントロールのトリス塩酸バッファーと別。気泡の形成を避けるためには、慎重に使い捨てのセルにバインド混合物の 800 μ L をピペットします 。
		注意: 使用して使い捨てのキュベット測定の表面ゼータ電位 (材料の表を参照).</li>
	</ol></li> <li>DLS 音色の測定で次のパラメーターを使用して: 1.5、温度の F(ka) と Smoluchowski モデル: 25 ° C、分散相 (鉄) の屈折: 2.344、屈折率分散環境 (水): 1.333 。
	注: DNA 磁性粒子間相互作用の直接複製の測定に影響します。計測器による単一測定は、60-70 s を取ります。ここでは、楽器は、遅延間隔 1 分と 10 の測定を取るように指示されました。わかりやすくするため、結果は、時に表示される、= 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 分最初の読書から</li>。
</ol>

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</ol>

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このプロトコルでは磁性粒子のゼータ電位を経由する DNA 結合を説明する理論的な原理は質問の下にあった。プロトコルでは、合成と磁性ナノ粒子・微粒子の変更について説明します。DNA コントロールとバインド溶液の調製法についても述べる。DNA 粒子間相互作用のスクリーニングのため 2 つの戦略がここで表示されます: 量的な PCR と DLS に近づきます。DLS は、粒子の物理化学的変化の 3 つの指標を提供します: 粒子サイズ、分散インデックスとゼータ電位。粒子サイズの変更は、集約や崩壊を直接示します。分散インデックス値が単分散に至るシステムの粒子種の分布を説明します (インデックス &#60; 0.05) 高度多分散する (インデックス &#62; 0.7)。ゼータ電位は非常に肯定的な粒子表示値を 30 mV と高い負の粒子を示す値-30 未満より大きい表面電荷によると粒子を分類できる mV。予想通り、比較的ソリューションをバインドで polycharged 磁性粒子のゼータ電位は、粒子が DNA にさらされたとき減少しました。この規則の例外は、MNPs_TEOS です。これらの粒子は、ユニークな高い負電荷 (<strong clas...

DNA の隔離は、分子生物学の最も重要な手順の 1 つです。核酸の抽出方法の開発ゲノミクス、メタゲノム、エピジェネティクス、トランスクリプトームの新興分野にインパクトもあり。DNA の隔離を含む医療 (法医学/診断ツールと予後バイオ マーカー) のバイオ テクノロジーのアプリケーションおよび環境アプリケーション (メタゲノム生物多様性、病原体の有病率、および監視) の広い範囲があります。浄化し、血液、尿、土、木および他の種類のサンプルなどスケールが異なる、さまざまな材料からの DNA を隔離する需要の増加がずっとあります。1,2,3,4
ナノ ・ マイクロ粒子は、ときに彼らは、磁場によって固定化することができます DNA の隔離と特にその高い表面積のために適しています。粒子サイズや電荷などの物理化学的性質が大きくターゲット生体分子を結合する機能を影響します。5生体分子の結合を強化して粒子を安定させるためには、異なる化学修飾 (表面コーティング) を利用できます。バインドするためのさまざまな方法は、共有と非共有結合性相互作用によると分類されます。6粒子のサイズは、粒子組成は金属、合金の密度、間隙率、および表面に影響を与えることができる他の材料の混入によって合わせることができるに対し、その磁化特性を直接影響します。7小さな粒子の表面電荷を測定する信頼性の高い方法はありません。代わりに、すべり面 (ナノ粒子表面から離れていくつかの距離) で電位が測定できます。8この値ゼータ電位と呼びます通常 DL 経由ナノ ・微粒子の安定性評価に使用される強力なツールです。9その値は pH およびイオン強度の分散環境の粒子の表面特性にだけではなく依存、のでそれも証明できるとの相互作用によって引き起こされるこの表面の変化、粒子および興味の分子。10
その一方で、容易の沈殿物 (集約) 比較した場合によく脱水条件 (A DNA フォーム) 展示圧縮構造の DNA 構造は B DNA フォームを発生しています。静電気 (イオンと水素結合) がその立体アクセス リン酸により他の材料と結合した DNA を制御する主要な力と窒素塩基 (特にグアニン)。7,10
この作品は、磁性ナノ粒子・微粒子の 3 つの代表的な化学修飾の解析 (図 1 a)。合成法とナノ粒子と微粒子の化学修飾、説明します。バインドのソリューションは、DNA の沈殿物 (pH、イオン強度、脱水) の理論的な原理に則したは DNA 結合・溶出評価するた量的な PCR を使用して、代表的なナノ粒子と微粒子 (図 1 b) から dna 溶出効率を評価します。粒径と分散インデックス、ゼータ電位は、粒子表面 (図 1) で発生した物理化学的変化を視覚化するために使用する重要なパラメーターです。磁性粒子表面の化学的性質を強調することが重要です。この手順は、このプロトコルの範囲を超えていた、一方、化学修正の効率を調べるいくつかの近代的な技術を適用できます。11,12,13,14フーリエ変換赤外分光法 (FTIR) は、粒子表面の赤外スペクトルを評価し、無料の化学修飾剤のスペクトルを比較する使用ことができます。X 線光電子分光法 (XPS) は、材料表面の元素組成を識別するために使用することができます別の手法です。微粒子の合成の品質に光を当てる他の電気化学顕微鏡、分光学的方法を使用できます。この作品は、DLS による DNA 磁性粒子の相互作用を分析する新たな視点を強調表示します。

<table><tbody><tr><td>塩化鉄(III)六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207926</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>塩化鉄(II)四水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380024</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>硫酸鉄(II)七水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>ペンタ</td><td>10060-11000</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>テトラエチルオルトケイ酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131903</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>ポリエチレン、分岐、平均 Mw ~25,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>磁性粒子合成</td></tr>水<tr><td>酸化アンモニウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228-M&nbsp;</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>ペンタ</td><td>71250-11000</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>硝酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6083</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05012</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>ow-molecular-weightカットオフ膜(Mw = 1 kDa)</td><td>Spectrum labs</td><td>G235063</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>オーバーヘッドスター</td><td>ラーwiteg Labortechnik GmbH</td><td>DH。WOS01035</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Memmert GmbH + Co.</td><td>84198998</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>バンデリン</td><td>795</td><td>磁性粒子合成</td></tr><tr><td>ブランド UVキュベットマイクロ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759200-100EA</td><td>サイズ測定用</td></tr><tr><td>キュベット UVキュベット用ブランドキャップ マイクロ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR759240-100EA</td><td>サイズ測定用キュベットキャップ</td></tr><tr><td>折り畳み毛細血管 ゼータセル</td><td>マルバーン</td><td></td><td>DTS1070 ゼータ電位測定用キュベット</td></tr><tr><td>ゼータサイザー ナノ ZS</td><td>マルバーン</td><td>ZEN3600</td><td>サイズとゼータ電位の測定装置</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO NanoQuant 装置</td><td>Tecan</td><td>396 227 V1.0, 04-2010</td><td>DNA濃度測定装置</td></tr><tr><td>SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QR0100</td><td>PCR kit</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S機器</td><td>エッペンドルフ</td><td>6325 000.013</td><td>サーモサイクラー</td></tr><tr><td>MinElute キット</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>DNA 精製キット</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td>DNA 結合</td></tr></tbody></table>

バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 dna 磁性粒子

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

磁性粒子を用いた DNA の隔離は、バイオ テクノロジーや分子生物学の研究で重要度の高いフィールドです。このプロトコルでは、動的光散乱 (DL) と電気泳動光散乱 (ELS) を介して結合 DNA 磁性粒子の評価について説明します。DLS による解析は、多分散性、粒径、ゼータ電位を含む粒子の物理化学的性質に関する貴重な情報を提供します。後者は、DNA などの材料の静電結合で主要な役割を果たしている粒子の表面電荷をについて説明します。ここでは、比較分析は、ナノ粒子・微粒子 DNA 結合と溶出への影響の 3 つの化学修飾を悪用します。化学修飾による分岐ポリエチレンイミン、エチル オルトけい酸、(3-アミノプロピル) プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシランを調査しました。以来、DNA は負の電荷を展示、DNA の結合に伴う粒子表面のゼータ電位が下がる予定です。クラスターの形成と粒子サイズする必要がありますもに影響します。単独でこれらの粒子の効率性と DNA の溶出を調査するために粒子は低 pH (~ 6)、高イオン強度および脱水環境で DNA と混合されます。磁石の粒子を洗浄し、それから DNA はトリス塩酸バッファーによって溶離される (pH = 8)。DNA コピー数は、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を使用して推定されます。ゼータ電位と粒径、多分散性および定量的 PCR のデータ評価、比較します。DLS は、洞察力と粒子の DNA の隔離のためのスクリーニングのプロセスに新たな視点を追加する解析法をサポートします。

化学合成と磁性粒子の改質のためにここで説明したプロトコルを使用して、六つの磁性粒子を合成し、DNA 結合の分析します。解析の概要は、表 1の通りです。バインドのソリューション、水の粒径を比較すると、2-22 折目によってソリューションをバインドですべての粒子を集約することは明らかです。いくつかの粒子はさらに DNA の存在下でより多くのひだに集約しかしこの直接相関が無かった (表 1) の量的な PCR によって検出された DNA 検索。ゼータ電位 (~ 2 分間隔で 10 測定) 3 粒子の急激な低下を示した DNA のコントロールと粒子の比較すなわち: MNPs_APTES、MMPs_TEOS、MMPs_APTES (図 2)。また、彼らはほとんどの場合 (図 3) が安定する前に最初の 3 つの測定値の変化を示す、ゼータ電位時間をかけての動向観察されました。DNA への暴露後の変化...

このプロトコルでは、磁性粒子の合成と DNA 結合の動的・電気泳動光散乱法による評価について説明します。粒子サイズ、彼らの多分散性の変化の監視に焦点を当てこのメソッドとを担う粒子表面のゼータ電位の主要な DNA など材料の結合の役割。

バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 DNA 磁性粒子

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

この実験の全体的な目標は、動的および電気泳動光散乱を介してDNAと磁性粒子の結合を分析することです。この方法は、核酸と磁性粒子の間の結合がどれほど速く、強いかなど、バイオテクノロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、サイズ、多分散性、ゼータ電位など、粒子の物理化学的変化を視覚化できることです。この技術の意味するところは、迅速で高感度なDNA単離に対する需要が高まっているため、分子診断にまで及びます。この手順では、20ミリモルの塩化第二鉄と10ミリモルの塩化第一鉄を20ミリリットルの脱酸素二重蒸留水に加えます。次に、透明な溶液が得られるまで、機械攪拌機を使用して窒素ガス雰囲気下のビーカーで得られた溶液を激しく攪拌します。次に、急速な機械的攪拌の下で、150ミリリットルの1モルのアンモニア水溶液を、滴下漏斗を使用して1時間かけて一滴ずつ加えます。その後、溶液をねじ込み式容器に移し、溶液を75°Cに加熱します

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

この記事では、単純な、定量、液相の親和性捕捉アッセイが提示されています。それは一方では、磁気ビーズとタグ融合タンパク質（例えば、ナノボディ）との間の相互作用や他のタグ付きタンパク質と第二、標識タンパク質（例えば、ポリオウイルス）との間の親和性に基づく信頼性の高い手法である。...

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

平面試料中の磁性粒子を撮像するためのスキャナは、磁気検出技術を混合平坦な周波数を使用して開発されました。粒子の非線形nonhysteretic磁化からの磁気相互変調積応答は、2周波励磁に記録されています。薄い生体サンプルの2次元画像を撮影するために使用することができます。...

平面サンプル中の磁性粒子を撮像する磁気検出スキャナ周波数混合

転写因子(TF)DNA結合に影響を与える非コード遺伝的変異を特定するための戦略的な計画とプロトコルを提示します。遺伝子型依存性TF...

機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング

ここでは、個々のナノ粒子のゼータ電位を決定するために用いることができる粒子転速度の測定を介してナノ粒子表面化学を特徴づけるために、抵抗パルスセンシング技術に一体化ポリウレタン可変ナノポアを使用します。...

調整可能なナノ細孔を介してナノ粒子の転ベロシティを経由してゼータ電位の決意：例として、DNA修飾された粒子を用いました

ここで、安定同位体と核磁気共鳴 (NMR) 分光法とマイクロ スケールを用いたタンパク質間相互作用の後の評価と生産のラベルが付いている蛋白質の浄化のためのプロトコルを紹介します。働く (MST)...

核磁気共鳴分光法 (NMR) とマイクロ働く (MST) による球状と糸状のタンパク質の相互作用を測定

天然変性タンパク質の弱く一過性の分子間および分子内相互作用を検出するための常磁性緩和増強NMR分光法の適用のためのプロトコルが提示されています。...

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

ここでは、力に敏感な生体分子を最大1.2kHzの速度でナノメカニカル測定を行う高速磁気ピンセットのセットアップについて説明します。モデル系としてDNAヘアピンやSNARE複合体への応用を紹介しますが、メカノバイオイベントに関与する他の分子にも応用できます。...

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

蛍光標識され、完全に再構成されたCdc45/Mcm2-7/GINS(CMG)ヘリカーゼの動きを光学トラップに保持された直鎖状DNA分子上で直接画像化および定量化するためのハイブリッドアンサンブルおよび単一分子アッセイを報告します。...

完全に再構成されたCMGの動きを画像化するためのハイブリッドアンサンブルおよび単一分子アッセイ

不凍タンパク質(AFP)は、氷の特定の平面に結合して、氷の成長を防ぐか、または遅くします。蛍光ベースの氷面親和性(FIPA)分析は、AFP結合した氷面の決定のためのオリジナルの氷エッチング法の改変である。AFPは蛍光標識され、巨視的な単氷結晶に組み込まれ、UV光下で可視化されます。...

蛍光ベースの氷面アフィニティーによる不凍タンパク質の氷結合平面の決定

コロイドプローブナノスコピーは、コロイドシステムの物理的安定性と凝固速度についての洞察を得るための様々な分野で使用され、生物学的システムを用いた創薬と製剤化科学を支援することができます。で説明する方法は、そのようなシステムを研究するための定量的および定性的な手段を提供します。...

コロイドプローブナノスを使用して、粒子間相互作用の定量的および定性的調査

学ぶ動的光散乱と電気泳動光散乱を用いたDNA磁性粒子の結合解析法。粒子サイズ、ゼータ電位、ポリ分散性の変化を可視化し、バイオテクノロジー研究や分子診断への応用可能性を評価します。

バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 DNA 磁性粒子

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