心筋細胞のシステム生物学における細胞構造の役割を研究する心筋細胞の構造的に現実的な有限要素の幾何学的なモデルを作成します。

この手順の全体的な目標は、心臓細胞の細胞内構造の空間的に詳細な有限要素モデルを作成することです。このモデルは、電子顕微鏡と共焦点顕微鏡のデータから作成されます。このようなモデルは、心細胞機能に対する細胞構造の役割を研究するために使用できます。

この方法は、細胞の内部組織の変化や健康状態、疾患状態が心臓細胞システムの生物学にどのように影響するかという重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、電子顕微鏡と共焦点顕微鏡からの補完的な情報を統合して、細胞構造の空間的に詳細なモデルを作成できることです。この方法は、心臓細胞システムの生物学に関する洞察を提供しますが、この一般的な全体的なアプローチは、細胞構造が細胞の機能に及ぼす影響を理解する必要がある他の細胞にも使用できます。

この手法の視覚的なデモンストレーションは、イオンチャネルをシミュレートしてより細かい要素メッシュにマッピングする手順が非常に新しいため、非常に重要です。左心室自由壁組織切片を作製し、テキストプロトコルに従って電子線トモグラフィーを用いてイメージングした後、IMODプログラム3dmodを実行します。グラフィカルユーザーインターフェース内で、セルの3D再構築画像データセットを含むrecまたはmrcファイルのアドレスを[画像ファイル]というラベルの付いた入力ボックスに入力し、[OK]を押します。

次に、ファイルメニューで[新しいモデル]を選択します。次に、「モデルに名前を付けて保存」メニュー項目を使用して、ファイルを適切な名前で保存します。[スペシャル]メニューで[描画ツール]を選択し、[スカルプト]オプションを選択して、マウスをイメージウィンドウに移動します。

マウスポインタを中心とする円形の輪郭が表示されます。画像ファイルの暗い領域であるミトコンドリア上でマウスの中央ボタンを押しながら、円の輪郭の周囲をその境界の形にドラッグします。ミトコンドリア境界の輪郭形成が完了したら、中央のボタンを離し、データ内の各ミトコンドリアに対してこのプロセスを繰り返します。

各コンターは、IMODによって同じオブジェクト内の新しいコンターとして自動的に認識されます。[オブジェクトの編集] メニューで [新規] を選択して新しいオブジェクトを作成します。これにより、オブジェクトの総数が自動的に 1 ずつインクリメントされ、この数が新しいオブジェクトに割り当てられます。

スカルプトオプションを使用して、筋原線維の輪郭をセグメント化して保存します。また、セルの境界をセグメント化し、[ファイル]メニューでモデルファイルを保存します。テキストプロトコルに従ってiso2meshをダウンロードした後、ここに示すGitHubのWebサイトからメッシュ上のRyRクラスターをシミュレートするためのソースコードとデータをダウンロードします。

Cardiac Cell Mesh Generator MATLAB アプリケーションを起動します。次に、GUI の左上にある 3 つの [プッシュ] ボタンを使用して、さまざまなオルガネラ コンポーネント マスクを MATLAB に読み込みます。筋原線維とミトコンドリアの間のギャップを区切る別のバイナリイメージスタックを作成するには、Image Jを開き、[ファイルを開く]ダイアログを使用して、筋原線維とミトコンドリアのTIFFスタックをプログラムにロードします。

Image Additionプラグインを開始するには、「Process Calculator Plus」を選択します。Myofibril イメージスタックを I1 として、mitochondria イメージスタックを I2 として選択し、Add Operator を選択して Okay をクリックします。結果を表す新しい画像スタックが表示されたら、[反転の編集] を選択して画像スタックを生成します。

Cardiac Cell Mesh GeneratorプログラムのRyR Gaps fileボタンを押して、筋原線維とミトコンドリアの間のギャップのバイナリ画像スタックを含むファイルを読み込み、GUIのGenerate Meshを押します。GUI の [Generate RyR-Simulator Inputs] ボタンを押して、RyR-Simulator に必要な入力を生成します。関数の実行後、OUT_DIRパスとして指定されたディレクトリ (d_axial_micron) 内に次のファイルが作成されていることを確認します。

txtファイルは、Zディスクの位置と画像スタック内の残りのピクセルとの間の軸方向距離を表し、d_radial_micron. txtファイルは、可能なRyRクラスター位置のセット内の各ピクセルからZディスク平面上のピクセルまでの軸成分を除いたユークリッド距離を表します。 W_micro。RyR クラスターが存在するすべての利用可能な位置の空間座標のリストを表す txt ファイル。

フォルダ内の残りの 3 つのファイルには、これらのファイル内の値がピクセル座標形式で書き出されたことを示すために、micron ではなく pixel という接尾辞が含まれています。筋原線維のバイナリイメージスタック上のRyRクラスター分布をシミュレートするには、RでRyRシミュレータを開くというラベルの付いたボタンを押して、Rプログラムを開始します。R GUI で [ファイルを開く] を選択し、RyR-Simulator パッケージ内でファイル設定を見つけます。

R.このフィールドのパラメータとデフォルト値の詳細な説明については、テキストプロトコルを参照してください。ユーザーは、R ウィンドウで RyR クラスターのシミュレートされた分布を調べ、クラスターが Z ディスクの近くに配置され、セルの断面全体に均等に分散するように設定を調整する必要があります。Cardiac Cell Mesh Generator を使用してポイントを空間密度として計算モデルにマップするには、[Select RyR Points File] というラベルのボタンを選択し、RyR-Simulator によって出力されたテキスト ファイルからシミュレートされた RyR クラスター分布テキスト ファイルを選択します。

最後に、MATLAB の GUI で RyR Density Mapper を実行します。ユーザーは、高密度値の近傍が実験データのRyRクラスターのサイズと類似するように密度値が分布していることを視覚的に確認する必要があります。これらの明視野画像は、切断面に対して縦方向、斜め方向、および断面方向に向き合ったときに細胞がどのように見えるかを明らかにします。

斜めおよび縦方向のサンプルには縞模様がありますが、断面サンプルにはありません。また、毛細血管は、斜め図よりも断面図の方が円形に見えます。このパネルは、このプロトコルの組織調製部分に従ったときに取得できる良質の断層撮影スタックを表しています。

組織ブロックが十分に染色され、組織ボリューム全体に金コロイド粒子が均一に分布していることを確認するには、注意と経験が必要です。ここに示されているのは、筋原線維とミトコンドリアのセグメント化された3Dモデルです。この四面体メッシュの 3D レンダリングは、iso2mesh によって生成されます。

元の画像スタックとセグメンテーションタスクの品質が良好である限り、この手順はかなり堅牢です。最後に、これらのパネルは、球面カーネル強度推定器アルゴリズムを使用した後、同じメッシュトポロジ上でシミュレートされたRyRクラスターの3つの例を示しています。RyR クラスターの構成のばらつきに注目してください。

一度習得し、適切に実行すれば、心臓細胞の構造的に現実的な有限要素モデルであるこのモデルは、私たちの技術を使用して数時間以内に生成できます。この手順に続いて、カルシウムシグナル伝達、心臓生体エネルギー学、および細胞力学の有限要素シミュレーションを行い、心筋細胞の機能に対する細胞構造の役割に関する質問に答えることができます。