リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

この手順の全体的な目標は、mRNAのどの領域がタンパク質に翻訳されるかを特定し、出芽酵母saccharomyces cerevisiaeのタンパク質翻訳をゲノムワイドレベルで定量的に測定することです。リボソームプロファイリングは、タンパク質や疾患の速度をモニターし、翻訳調節のメカニズムを研究するために使用できます。この技術の主な利点は、他の方法と比較してはるかに高い感度が追加されることであり、その中でも、単一の接触分解能で生体内でタンパク質と疾患を測定することができます。

このプロトコールは出芽酵母に特異的ですが、哺乳類の細胞や組織など、他のモデルシステムでリボソームプロファイリングを確立しようとしている研究者にも有用です。抽出物は、対数期中期まで成長した酵母細胞から調製されます。グラスホルダーフィルターアセンブリを使用して、0.45マイクロメンブレンフィルターで培養物をろ過します。

ペレットをヘラでこすり落とし、液体窒素で急速冷凍し、マイナス80°Cで保存します。1.8ミリリットルのステンレス鋼管に3つのクロム鋼3.2ミリメートルビーズを入れ、液体窒素でチューブを予冷します。凍結したペレットを追加し、鋼管をシリコーンゴムキャップで覆います。

4200 rpmで10秒間凍結粉砕することにより、サンプルを均質化します。粉砕手順全体でサンプルを凍結しておくには、各粉砕の間に少なくとも10秒間、チューブを液体窒素で冷却することが重要です。均質化が完了したら、シクロヘキシミドを含む1ミリリットルの溶解バッファーをサンプルに加えます。

ピペッティングでよく混合し、サンプルを新しい1.5ミリリットルチューブに移します。摂氏 4 度で 20, 000 倍 g で 5 分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。

100マイクロリットルのライセートを別の新しい1.5ミリリットルチューブに移し、ポリ(A)mRNAを単離します。mRNAサンプルを含むチューブを残りのライセートに急速凍結し、液体窒素でのフットプリント抽出に使用し、マイナス80°Cで保存します。足跡抽出の前夜に、事前に準備したショ糖勾配を摂氏4度で解凍しました。

翌日、細胞溶解物を氷上で解凍します。50 OD260ユニットを含む細胞溶解物のアリコートを新しい1.5ミリリットルチューブに移し、最大1ミリリットルの新鮮な溶解バッファーと10マイクロリットルのRNaseを1つ追加します。室温で、ヘッドオーバーヒールローテーターで穏やかに回転させながら1時間インキュベートします。

次に、ポリマーチューブ内の10%から50%のスクロースグラジエントの上にライセートサンプルを穏やかに層状にします。SW41 tiの回転子を使用して、35、000のrpmで摂氏4度で3時間のためのultra遠心分離機。ウルトラセトリフュージング中に、グラジエント分画システムを設定します。

コンポーネントの電源を入れ、UVモニターを少なくとも30分間ウォームアップします。シリンジにチェイス溶液を充填し、シリンジとカニューレ内の気泡を取り除きます。超遠心分離が完了したら、ショ糖勾配が入った超遠心チューブを取り付けて穴を開けます。

シリンジポンプを1分あたり1ミリリットルで始動し、A254値を監視しながら1ミリリットルのフラクションを収集します。ADSモノソームピークを表すフラクションが収集され、プールされます。12、000倍のgで摂氏4度で0.5ミリリットルの遠心フィルターを通して10分間フラクションをろ過し、フロースルーを廃棄し、容量が100マイクロリットル未満になるまで繰り返します。

ピペッティングで混合した400マイクロリットルの放出緩衝液で、氷上で10分間インキュベートし、ユニットを新しいコレクションチューブに移し、摂氏4度で10分間12, 000倍gで遠心分離します。フロースルーを収集します。続いて、フットプリントフラグメントを精製し、テキストプロトコルに記載されているようにエタノール沈殿を使用してサンプルを沈殿させます。

この手順を開始するには、沈殿したフットプリントと断片化されたmRNAサンプルを20,000倍のgおよび摂氏4度で30分間遠心分離します。エタノールを除去し、ペレットを風乾した後、各ペレットを7.75マイクロリットルの水に懸濁します。各ペレットに、1マイクロリットルの10XT4ポリヌクレオチドキナーゼバッファー、1マイクロリットルのT4ポリヌクレオチドキナーゼ、および0.25マイクロリットルのRNase阻害剤を追加します。

摂氏37度で1時間インキュベートします。10マイクロリットルの2X TBE尿素サンプルバッファーを、各フットプリントおよびmRNAサンプルの10マイクロリットルに加えます。サンプルと適切なコントロールを摂氏75度で3分間インキュベートし、スピンダウンして1分間氷上に置きます。

各サンプルを15%TBE尿素ゲルの2つのウェルにロードし、180ボルトで1時間ゲル電気泳動することによりRNAフラグメントを分離します。光から5分間保護した核酸ゲル染色でゲルを染色します。青色光トランスイルミネーターの下でゲルを可視化しながら、フットプリントサンプルの場合は28〜32ヌクレオチド、mRNAサンプルの場合は約50〜70ヌクレオチドの適切なバンドを切り取ります。

切除したポリアクリルアミドゲル片をマイナス80°Cで少なくとも10分間凍結してから、ポリアクリルアミドゲルからRNAを抽出します。逆転写の前に、3つのプライムアダプターライゲーションを行い、テキストプロトコルに記載されているようにサンプルを沈殿させます。各ペレットを11.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。

次に、0.5マイクロリットルの8マイクロモル逆転写プライマーと1マイクロリットルのdNTPミックスを追加します。摂氏65度で5分間インキュベートし、次に氷の上に置きます。各サンプルに、4マイクロリットルの5xファーストストランドバッファー、2マイクロリットルの0.1モルDTT、0.5マイクロリットルのRNase阻害剤、および0.5マイクロリットルの逆転写酵素を追加します。

48°Cで30分間、65°Cで1分間、80°Cで5分間インキュベートします。各サンプルに0.8マイクロリットルの2モル水酸化ナトリウムを加え、摂氏98度で30分間インキュベートすることにより、RNAの加水分解に直ちに進みます。0.8マイクロリットルの2モル塩化水素を加えて、反応を中和します。

テキストプロトコルに記載されているようにサンプルを沈殿させた後、各ペレットを5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、5マイクロリットルの2x TBE尿素サンプルバッファーを追加します。摂氏75度で3分間インキュベートし、スピンダウンし、1分間氷で冷やします。10%TBE尿素ゲルの1ウェルにサンプルをロードします。

逆転写反応の生成物をゲル電気泳動180ボルトで50分間分離します。光から保護された核酸ゲル染色でゲルを5分間染色します。青色光トランスイルミネーターを使用して、バンドを約128ヌクレオチド以上で切り取ります。

ポリアクリルアミドゲル片をマイナス80°Cで少なくとも10分間凍結してから、ポリアクリルアミドゲルからDNAを抽出します。DNAを環状化するには、各DNAペレットを16.75マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。2マイクロリットルの10x一本鎖DNAライガスバッファー、1マイクロリットルの50ミリモル塩化マンガン、および0.25マイクロリットルの一本鎖DNAリガーゼを追加します。

60°Cで1時間インキュベートし、続いて80°Cで10分間インキュベートします。沈殿せずに、一本鎖DNAライゲーション反応生成物をマイナス20°Cで保存します。続いて、PCRライブラリ増幅を行い、続いてテキストプロトコルに記載されているようにライブラリ定量とハイスループットシーケンシングを行います。

PCR増幅フットプリントライブラリとmRNAサンプル用に得られたシーケンシングライブラリの代表的なバイオアナライザープロファイルを示します。フットプリントライブラリーの予想平均サイズは148〜152ヌクレオチドで、mRNAライブラリーの予想サイズは170〜190ヌクレオチドです。このグラフは、野生型サンプルとhbs1欠失変異体の2つの独立した生物学的複製について得られたmRNA、フットプリント、およびrRNAリードの合計数を示しています。

フットプリントライブラリ内のシーケンシングされたすべてのリードの50%から60%が、リボソームで保護されたフットプリントフラグメントに対応していました。対照的に、mRNAライブラリーではrRNA断片のわずか3%しか観察されず、ポリ(A)mRNAの単離によりrRNAリードの効果的な排除が可能になることが実証されました。フットプリントサンプルライブラリとmRNAサンプルライブラリはどちらも、一致したサンプル間のピアソン相関係数が約0.99であることで示されるように、良好な再現性を示しています。

mRNA存在量測定と組み合わせることで、リボソームプロファイリングにより、実験条件間の翻訳効率の変化を測定することができます。hbs1欠失変異体において有意にアップレギュレーションされた遺伝子とダウンレギュレーションされた遺伝子は、mRNA転写の変化、翻訳効率、または共通の影響の影響を受けるかどうかによってグループ化されます。習得すると、約11日ですべてのプロトコルを実行できます。

この手順を試行する際は、手袋を着用し、RNaseフリーの試薬と消耗品を使用してすべての手順を実行することを忘れないでください。これにより、RNaseの汚染を回避し、サンプル中のRNA分解のリスクを下げることができます。このビデオを見れば、ヌクレアーゼ消化を使用してリボソームフットプリントを生成する方法、ショ糖勾配分画による無傷のリボソームフットプリント複合体の単離方法、ディープシーケンシング用のDNAライブラリの調製方法について十分に理解できるはずです。液体窒素の取り扱いは非常に危険であり、極端に冷たい材料を取り扱う際には、安全メガネやクライオ手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。