Name: リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 学ぶリボソームプロファイリングによるSaccharomyces cerevisiaeのゲノム規模での翻訳定量法。この高感度技術は翻訳制御メカニズムの解明と他のモデル系への応用に有用です。

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この仕事は健康補助金 AG040191 と VML に AG054566 研究機構によって支えられました。VML が加齢医学研究のためのアメリカ連合から遠く研究助成受信者間に調査しました。

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboDiff%3A+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li>
<li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194(2016).</li>
<li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li>
<li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboProfiling%3A+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309(2016).</li>
<li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid%3A+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).</li>
<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

リボ Seq アプローチは、mRNA 翻訳体内でゲノムのレベル3の解析のための強力な技術として浮上しています。シングル コドン解像度変換を監視でき、この手法を使用して研究は翻訳制御の私達の理解に貢献しています。その利点にもかかわらずリボ Seq いくつか制限があります。リボソーム RNA (rRNA) フラグメントは、リボソーム保護足跡リボ Seq 実験9,25で得ることができる便利な配列読み取りの収量の減少の分離中に常に共同浄化されました。我々 のデータは、rRNA 汚染は、すべての読み取り (図 8) の 40-50% に貢献できることを示しています。この制限を克服する方法の 1 つは、シーケンス処理深さを増やすことです。シーケンスの追加のラウンドは、各分析サンプルの配列読み取りの必要な数を達成するまで行わなければなりません。我々 のプロトコルを使用したシーケンス ライブラリの分析では、12 ...

mRNA の翻訳は、タンパク質発現の調節に重要な役割を果たしている細胞の基本的なプロセスの 1 つです。したがって、mRNA の翻訳は、さまざまな内部および外部生理的刺激1,2への応答では厳重します。ただし、翻訳制御機構のまま流。ここでは、プロファイリング ・ リボソームで翻訳出芽酵母におけるゲノム定量化のプロトコルについて述べる.リボソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、研究し、細胞の異なる条件の下で特定の Mrna の翻訳を定量化することです。このテクニックは、ゲノム全体のリボソーム占有率を定量的に解析する次世代シーケンスを使用して、タンパク質合成生体内単一コドン解像度3,4の率を監視できます。現在、このメソッド タンパク質翻訳のレベルを測定する最も先進的な手段を提供して他の現在利用可能な技術、マイクロ アレイなどによって明らかにすることができない情報を提供する便利な検出ツールをあると証明したか翻訳の状態配列解析 (TSAA) 5。リボソームのプロファイリングと並進出力のトラン スクリプト レベルでそれらの変更内容をレポートとしてそれはまた他の方法と比べて多くの高い感度を提供します。
このアプローチは、リボソームで保護された mRNA の断片3のディープ シーケンスに基づいています。リボゾームの保護タンパク質翻訳中 〜 (足跡と呼ばれる) mRNA の6の 28 の nt 部分。リボソームで保護されたフラグメントのシーケンスを決定すると、リボ Seq は翻訳 mRNA にリボソームの位置をマップし、積極的にタンパク質3,7と訳されるが mRNA のどの領域を確認できます。さらに、特定の mRNA のコピーに揃える足跡の数をカウントすることによって mRNA の翻訳定量的測定できます。
リボソーム保護断片を分離するためにセル lysates は当初リボヌクレアーゼ消化続いてリボソームを失速する翻訳阻害剤と扱われます。無料の mRNA およびリボゾームによって保護されていない翻訳 Mrna の部分はリボヌクレアーゼによって低下するのに対し、フット プリントとはそのままリボソーム複合体を浄化することによって mRNA のリボソーム保護断片を回復できます。これらの mRNA の足跡は cDNA ライブラリに変換し、ディープ シーケンス (図 1) によって分析します。リボソームのプロファイリングに並行して、そのまま mRNA を同じサンプルから抽出してシーケンスします。リボ Seq mRNA 豊富な測定と識別される翻訳のレベルを比較すると、特にアップ- または調整される翻訳のレベルでは、ある遺伝子を識別し、ゲノム全体のレベルでの mRNA の翻訳の効率を計算できます。この資料で説明されているプロトコルはイースト菌の特定が、他のシステムでリボ Seq プロトコルを確立しようとして、研究者の役に立つまたする必要があります。

<table><tbody><tr><td>0.45 μ;M メンブレンフィルター</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 遠心フィルター (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C;C)</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% TBE-尿素ゲル</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-尿素ゲル</td><td>Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X TBE-尿素サンプルバッファー</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc、pH 5.5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenylase (10 U/&mu;L)</td><td>Epicentre</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Nucleic acid sample loading buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8% TBE gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Chrome-steel beads,3.2 mm</td><td>BioSpec 製品</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>クライオグラインダー</td><td>Biospec 製品</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>データ収集システム</td><td>DATAQ 機器</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド (dNTP) 溶液混合物 (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>グラジエント分画システム</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>5X Phusion HF Buffer</td></tr><tr><td>次世代シーケンシングライブラリ定量キット</td>付属 <td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Nucleic acid gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 ultracentrifuge</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(A) mRNA 単離キット</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J エキソヌクレアーゼ (10 U/&mu;L)</td><td>Epicentre</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>逆転写酵素 (200 U/&mu;L)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>5X first-strand buffer および 0.1 M DTT</td></tr><tr><td>RNA フラグメンテーションバッファー</td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNase I (100 U/&mu;L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNase阻害剤(20 U/&mu;L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンゴムキャップ</td><td>BioSpec Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNAリガーゼ (100 U/&mu;L)</td><td>Epicentre</td><td>CL9021K</td><td>10X CircLigase IIバッファーと50 mM MnCl2</td></tr><tr><td>Stainless microvials、1.8 mL</td><td>BioSpec Products</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Tiローター</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (10,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>10X T4 ポリヌクレオチドキナーゼバッファーが付属</td></tr><tr><td>T4 RNA リガーゼ 2 切断型 KQ (200,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>10X T4 RNA リガーゼバッファーと 50%</td></tr><tr><td>PEG8000 サーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>薄肉ポリアロマーチューブ、13.2 mL</td> ベ<td>ックマン・コールター</td><td></td> 331372 <td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td> が付属<td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>UVモニター</td><td>バイオ・ラッド</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae 株 BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

MRNA のタンパク質への翻訳は、規制のいくつかの層を含む複雑なプロセスです。MRNA 転写の変化蛋白質合成に変更を反映するが、多くの例外を観察されているとしばしば見なされます。最近では、リボソーム プロファイル (またはリボ Seq) と呼ばれる手法は、mRNA の領域はタンパク質とゲノムのレベルで翻訳の定量化に変換されます、精度の高い識別ができる強力な方法として浮上しています。ここでは、出芽酵母リボ Seq を使用して翻訳のゲノムワイドな定量化のための一般的なプロトコルを提案する.また、同時に何千もの同じサンプルの mrna の翻訳効率を定量化し、比較実験への応答でこれらのパラメーターの変更を可能にリボ Seq データ mRNA 豊富な測定と組み合わせること操作または異なる生理学的状態に。ヌクレアーゼ消化、ショ糖勾配分画法によるフット プリントとはそのままリボソーム複合体の分離および DNA ライブラリの準備を使用して適切なと共にディープ シーケンスのリボソーム足跡の生成のための詳しいプロトコルについて述べる生体内で翻訳の正確な分析を確保するために必要な品質を制御します。

詳細なプロファイルデータ リボソームの構造バイオ情報解析パイプラインをされている8,9で説明しました。さらに、いくつかの研究グループの差動遺伝子発現解析とシーケンス データをプロファイリング方法10、11,12 リボソームに固有の処理のためのバイオインフォマティクス ツールを開発しています。 ,13,14,15,16,17<su...

翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々 は出芽酵母出芽酵母における翻訳の定量分析のための高スループット方法をについて説明します。

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

この手順の全体的な目標は、mRNAのどの領域がタンパク質に翻訳されるかを特定し、出芽酵母saccharomyces cerevisiaeのタンパク質翻訳をゲノムワイドレベルで定量的に測定することです。リボソームプロファイリングは、タンパク質や疾患の速度をモニターし、翻訳調節のメカニズムを研究するために使用できます。この技術の主な利点は、他の方法と比較してはるかに高い感度が追加されることであり、その中でも、単一の接触分解能で生体内でタンパク質と疾患を測定することができます。このプロトコールは出芽酵母に特異的ですが、哺乳類の細胞や組織など、他のモデルシステムでリボソームプロファイリングを確立しようとしている研究者にも有用です。抽出物は、対数期中期まで成長した酵母細胞から調製されます。グラスホルダーフィルターアセンブリを使用して、0.45マイクロメンブレンフィルターで培養物をろ過します。ペレットをヘラでこすり落とし、液体窒素で急速冷凍し、マイナス80°Cで保存します。1.8ミリリットルのステンレス鋼管に3つのクロム鋼3.2ミリメートルビーズを入れ、液体窒素でチューブを予冷します。凍結したペレットを追加し、鋼管をシリコーンゴムキャップで覆います。4200 rpmで10秒間凍結粉砕することにより、サンプルを均質化します。粉砕手順全体でサンプルを凍結しておくには、各粉砕の間に少なくとも10秒間、チューブを液体窒素で冷却することが重要です。均質化が完了したら、シクロヘキシミドを含む1ミリリットルの溶解バッファーをサンプルに加えます。ピペッティングでよく混合し、サンプルを新しい1.5ミリリットルチューブに移します。摂氏 4 度で 20, 000 倍 g で 5 分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。100マイクロリットルのライセートを別の新しい1.5ミリリットルチューブに移し、ポリ(A)mRNAを単離します。mRNAサンプルを含むチューブを残りのライセートに急速凍結し、液体窒素でのフットプリント抽出に使用し、マイナス80°Cで保存します。足跡抽出の前夜に、事前に準備したショ糖勾配を摂氏4度で解凍しました。翌日、細胞溶解物を氷上で解凍します。50 OD260ユニットを含む細胞溶解物のアリコートを新しい1.5ミリリットルチューブに移し、最大1ミリリットルの新鮮な溶解バッファーと10マイクロリットルのRNaseを1つ追加します。室温で、ヘッドオーバーヒールローテーターで穏やかに回転させながら1時間インキュベートします。次に、ポリマーチューブ内の10%から50%のスクロースグラジエントの上にライセートサンプルを穏やかに層状にします。SW41 tiの回転子を使用して、35、000のrpmで摂氏4度で3時間のためのultra遠心分離機。ウルトラセトリフ

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここでは、ストレス条件に応答する真核細胞のmRNA翻訳の開始の変化を分析するための方法を記載している。このメソッドは、非翻訳リボソームからリボソームを翻訳するショ糖勾配に速度の分離に基づいています。...

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

リボソームはタンパク質合成の中心的な役割を果たしている。ショ糖密度勾配遠心分離によりポリリボソーム（ポリソーム）分画は、ゲノムワイドな規模での個々のmRNAの翻訳効率の直接測定を可能にする。さらに、この方法は、シャペロンおよびシグナル伝達分子としてのリボソーム及びポリソーム関連因子の生化学的分析のために使用することができる。...

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

細胞がストレスに適応する能力は、彼らの生存にとって非常に重要です。mRNA翻訳の制御は、プロテオームの迅速な制御を可能にする適応戦略の1つです。ここでは、ストレス条件下で選択的に翻訳される特定のmRNAを同定するための標準化されたポリソームプロファイリングプロトコルを提供します。...

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

本稿では、可視化し、細胞内コンパートメントのローカライズされた翻訳イベントを定量化する方法について説明します。本稿で提案する手法は基本的な共焦点イメージング...

グローバルを測定する定量的蛍光ローカライズ翻訳

ここで説明されているプロトコルは、4-チオウラシルが付いた酵母から精製した新しく合成された mRNA のゲノムワイドな定量化に基づいています。このメソッドは、mrna から非 mRNA 合成を測定することができ、したがって、RNA のポリメラーゼ II...

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

ここでは、細菌におけるRIBO-seqのサンプル採取および調製の段階について説明する。これらのガイドラインに従って作成されたライブラリのシーケンシングは、包括的なバイオインフォマティクス分析のための十分なデータをもたらす。私たちが提示するプロトコルはシンプルで、標準的な実験装置を使用し、リシスから図書館の取得まで7日かかります。...

細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。...

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

共翻訳相互作用は、新生鎖修飾、標的化、折り畳み、およびアセンブリ経路において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、 in vivo、モデル真核生物...

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

リボソームを翻訳すると、コドンあたり3つのヌクレオチドがペプチドに解読される。リボソームプロファイリングによって捕捉されたmRNAに沿ったそれらの動きは、特徴的な三重項周期性を示すフットプリントを生成する。このプロトコルでは、RiboCodeを使用してリボソームプロファイリングデータからこの顕著な特徴を解読し、トランスクリプトーム全体でアクティブに翻訳されたオープンリーディングフレームを特定する方法について説明します。...

De novo リボソームプロファイリングデータによるアクティブに翻訳されたオープンリーディングフレームの同定

学ぶリボソームプロファイリングによるSaccharomyces cerevisiaeのゲノム規模での翻訳定量法。この高感度技術は翻訳制御メカニズムの解明と他のモデル系への応用に有用です。

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

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