Name: リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 学ぶリボソームプロファイリングによるSaccharomyces cerevisiaeのゲノム規模での翻訳定量法。この高感度技術は翻訳制御メカニズムの解明と他のモデル系への応用に有用です。

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この仕事は健康補助金 AG040191 と VML に AG054566 研究機構によって支えられました。VML が加齢医学研究のためのアメリカ連合から遠く研究助成受信者間に調査しました。

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation during mitosis.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+translational+profiling+by+ribosome+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting.</a> Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).</li>
<li>Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+non-standardized+biases+of+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling.</a> Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).</li>
<li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anota%3A+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboDiff%3A+detecting+changes+of+mRNA+translation+efficiency+from+ribosome+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints.</a> Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).</li>
<li>Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+assessment+of+differential+translations+with+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data.</a> Nat Commun. 7, 11194(2016).</li>
<li>Chung, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+duplex-specific+nuclease+in+ribosome+profiling+and+a+user-friendly+software+package+for+Ribo-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis.</a> RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).</li>
<li>Popa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboProfiling%3A+a+Bioconductor+package+for+standard+Ribo-seq+pipeline+processing%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing.</a> F1000Res. 5, 1309(2016).</li>
<li>Dunn, J. G., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid%3A+nucleotide-resolution+analysis+of+next-generation+sequencing+and+genomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data.</a> BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).</li>
<li>Baranov, P. V., Michel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+translation+with+ribosome+profiling+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Illuminating translation with ribosome profiling spectra.</a> Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).</li>
<li>Calviello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+actively+translated+open+reading+frames+in+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data.</a> Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).</li>
<li>Michel, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboGalaxy%3A+A+browser+based+platform+for+the+alignment%2C+analysis+and+visualization+of+ribosome+profiling+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data.</a> RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34-Hbs1+mediated+dissociation+of+inactive+80S+ribosomes+promotes+restart+of+translation+after+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress.</a> EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).</li>
<li>Guydosh, N. R., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dom34+rescues+ribosomes+in+3%27+untranslated+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions.</a> Cell. 156 (5), 950-962 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+ribosome+profiling+reveals+complex+translational+regulation+in+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).</li>
<li>Weinberg, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+ribosome-footprint+and+mRNA+measurements+provide+insights+into+dynamics+and+regulation+of+yeast+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation.</a> Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).</li>
<li>Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+poly%28A%29+tail+and+translation+during+the+somatic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle.</a> Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).</li>
<li>Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+redefinition+of+UGA+codons+is+regulated+by+selenium+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability.</a> J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonuclease+selection+for+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ribonuclease selection for ribosome profiling.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).</li>
<li>Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+inhibitors+cause+abnormalities+in+ribosome+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).</li>
<li>O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+survey+of+the+relative+impact+of+mRNA+features+on+local+ribosome+profiling+read+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density.</a> Nat Commun. 7, 12915(2016).</li>
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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

リボ Seq アプローチは、mRNA 翻訳体内でゲノムのレベル3の解析のための強力な技術として浮上しています。シングル コドン解像度変換を監視でき、この手法を使用して研究は翻訳制御の私達の理解に貢献しています。その利点にもかかわらずリボ Seq いくつか制限があります。リボソーム RNA (rRNA) フラグメントは、リボソーム保護足跡リボ Seq 実験9,25で得ることができる便利な配列読み取りの収量の減少の分離中に常に共同浄化されました。我々 のデータは、rRNA 汚染は、すべての読み取り (図 8) の 40-50% に貢献できることを示しています。この制限を克服する方法の 1 つは、シーケンス処理深さを増やすことです。シーケンスの追加のラウンドは、各分析サンプルの配列読み取りの必要な数を達成するまで行わなければなりません。我々 のプロトコルを使用したシーケンス ライブラリの分析では、12 ...

mRNA の翻訳は、タンパク質発現の調節に重要な役割を果たしている細胞の基本的なプロセスの 1 つです。したがって、mRNA の翻訳は、さまざまな内部および外部生理的刺激1,2への応答では厳重します。ただし、翻訳制御機構のまま流。ここでは、プロファイリング ・ リボソームで翻訳出芽酵母におけるゲノム定量化のプロトコルについて述べる.リボソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、研究し、細胞の異なる条件の下で特定の Mrna の翻訳を定量化することです。このテクニックは、ゲノム全体のリボソーム占有率を定量的に解析する次世代シーケンスを使用して、タンパク質合成生体内単一コドン解像度3,4の率を監視できます。現在、このメソッド タンパク質翻訳のレベルを測定する最も先進的な手段を提供して他の現在利用可能な技術、マイクロ アレイなどによって明らかにすることができない情報を提供する便利な検出ツールをあると証明したか翻訳の状態配列解析 (TSAA) 5。リボソームのプロファイリングと並進出力のトラン スクリプト レベルでそれらの変更内容をレポートとしてそれはまた他の方法と比べて多くの高い感度を提供します。
このアプローチは、リボソームで保護された mRNA の断片3のディープ シーケンスに基づいています。リボゾームの保護タンパク質翻訳中 〜 (足跡と呼ばれる) mRNA の6の 28 の nt 部分。リボソームで保護されたフラグメントのシーケンスを決定すると、リボ Seq は翻訳 mRNA にリボソームの位置をマップし、積極的にタンパク質3,7と訳されるが mRNA のどの領域を確認できます。さらに、特定の mRNA のコピーに揃える足跡の数をカウントすることによって mRNA の翻訳定量的測定できます。
リボソーム保護断片を分離するためにセル lysates は当初リボヌクレアーゼ消化続いてリボソームを失速する翻訳阻害剤と扱われます。無料の mRNA およびリボゾームによって保護されていない翻訳 Mrna の部分はリボヌクレアーゼによって低下するのに対し、フット プリントとはそのままリボソーム複合体を浄化することによって mRNA のリボソーム保護断片を回復できます。これらの mRNA の足跡は cDNA ライブラリに変換し、ディープ シーケンス (図 1) によって分析します。リボソームのプロファイリングに並行して、そのまま mRNA を同じサンプルから抽出してシーケンスします。リボ Seq mRNA 豊富な測定と識別される翻訳のレベルを比較すると、特にアップ- または調整される翻訳のレベルでは、ある遺伝子を識別し、ゲノム全体のレベルでの mRNA の翻訳の効率を計算できます。この資料で説明されているプロトコルはイースト菌の特定が、他のシステムでリボ Seq プロトコルを確立しようとして、研究者の役に立つまたする必要があります。

<table><tbody><tr><td>0.45 μ;M メンブレンフィルター</td><td>Millipore</td><td>HVLP04700</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 遠心フィルター (100 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C;C)</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>10% TBE-尿素ゲル</td><td>Invitrogen</td><td>EC6875BOX</td><td></td></tr><tr><td>15% TBE-尿素ゲル</td><td>Invitrogen</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>RPI</td><td>M24500-10.0</td><td></td></tr><tr><td>2X TBE-尿素サンプルバッファー</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>3M NaOAc、pH 5.5</td><td>Invitrogen</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' Deadenylase (10 U/&mu;L)</td><td>Epicentre</td><td>DA11101K</td><td></td></tr><tr><td>5X Nucleic acid sample loading buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0767</td><td></td></tr><tr><td>8% TBE gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC6215BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-46B</td><td></td></tr><tr><td>Chrome-steel beads,3.2 mm</td><td>BioSpec 製品</td><td>11079132c</td><td></td></tr><tr><td>クライオグラインダー</td><td>Biospec 製品</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>RPI</td><td>C81040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>データ収集システム</td><td>DATAQ 機器</td><td>DI-245</td><td></td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド (dNTP) 溶液混合物 (10 mM)</td><td>NEB</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>グラジエント分画システム</td><td>Brandel</td><td>BR-184X</td><td></td></tr><tr><td>High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>5X Phusion HF Buffer</td></tr><tr><td>次世代シーケンシングライブラリ定量キット</td>付属 <td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Nucleic acid gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 ultracentrifuge</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(A) mRNA 単離キット</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td></td></tr><tr><td>Rec J エキソヌクレアーゼ (10 U/&mu;L)</td><td>Epicentre</td><td>RJ411250</td><td></td></tr><tr><td>逆転写酵素 (200 U/&mu;L)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td>5X first-strand buffer および 0.1 M DTT</td></tr><tr><td>RNA フラグメンテーションバッファー</td><td>NEB</td><td>E6186A</td><td></td></tr><tr><td>RNase I (100 U/&mu;L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNase阻害剤(20 U/&mu;L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンゴムキャップ</td><td>BioSpec Products</td><td>2008</td><td></td></tr><tr><td>ssDNAリガーゼ (100 U/&mu;L)</td><td>Epicentre</td><td>CL9021K</td><td>10X CircLigase IIバッファーと50 mM MnCl2</td></tr><tr><td>Stainless microvials、1.8 mL</td><td>BioSpec Products</td><td>2007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>RPI</td><td>S24060-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>SW-41 Tiローター</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (10,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>10X T4 ポリヌクレオチドキナーゼバッファーが付属</td></tr><tr><td>T4 RNA リガーゼ 2 切断型 KQ (200,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>M0373S</td><td>10X T4 RNA リガーゼバッファーと 50%</td></tr><tr><td>PEG8000 サーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>薄肉ポリアロマーチューブ、13.2 mL</td> ベ<td>ックマン・コールター</td><td></td> 331372 <td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td> が付属<td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>UVモニター</td><td>バイオ・ラッド</td><td>7318160</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae 株 BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td></td></tr></tbody></table>

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

MRNA のタンパク質への翻訳は、規制のいくつかの層を含む複雑なプロセスです。MRNA 転写の変化蛋白質合成に変更を反映するが、多くの例外を観察されているとしばしば見なされます。最近では、リボソーム プロファイル (またはリボ Seq) と呼ばれる手法は、mRNA の領域はタンパク質とゲノムのレベルで翻訳の定量化に変換されます、精度の高い識別ができる強力な方法として浮上しています。ここでは、出芽酵母リボ Seq を使用して翻訳のゲノムワイドな定量化のための一般的なプロトコルを提案する.また、同時に何千もの同じサンプルの mrna の翻訳効率を定量化し、比較実験への応答でこれらのパラメーターの変更を可能にリボ Seq データ mRNA 豊富な測定と組み合わせること操作または異なる生理学的状態に。ヌクレアーゼ消化、ショ糖勾配分画法によるフット プリントとはそのままリボソーム複合体の分離および DNA ライブラリの準備を使用して適切なと共にディープ シーケンスのリボソーム足跡の生成のための詳しいプロトコルについて述べる生体内で翻訳の正確な分析を確保するために必要な品質を制御します。

詳細なプロファイルデータ リボソームの構造バイオ情報解析パイプラインをされている8,9で説明しました。さらに、いくつかの研究グループの差動遺伝子発現解析とシーケンス データをプロファイリング方法10、11,12 リボソームに固有の処理のためのバイオインフォマティクス ツールを開発しています。 ,13,14,15,16,17<su...

翻訳制御蛋白質量の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、我々 は出芽酵母出芽酵母における翻訳の定量分析のための高スループット方法をについて説明します。

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

この手順の全体的な目標は、mRNAのどの領域がタンパク質に翻訳されるかを特定し、出芽酵母saccharomyces cerevisiaeのタンパク質翻訳をゲノムワイドレベルで定量的に測定することです。リボソームプロファイリングは、タンパク質や疾患の速度をモニターし、翻訳調節のメカニズムを研究するために使用できます。この技術の主な利点は、他の方法と比較してはるかに高い感度が追加されることであり、その中でも、単一の接触分解能で生体内でタンパク質と疾患を測定することができます。このプロトコールは出芽酵母に特異的ですが、哺乳類の細胞や組織など、他のモデルシステムでリボソームプロファイリングを確立しようとしている研究者にも有用です。抽出物は、対数期中期まで成長した酵母細胞から調製されます。グラスホルダーフィルターアセンブリを使用して、0.45マイクロメンブレンフィルターで培養物をろ過します。ペレットをヘラでこすり落とし、液体窒素で急速冷凍し、マイナス80°Cで保存します。1.8ミリリットルのステンレス鋼管に3つのクロム鋼3.2ミリメートルビーズを入れ、液体窒素でチューブを予冷します。凍結したペレットを追加し、鋼管をシリコーンゴムキャップで覆います。4200 rpmで10秒間凍結粉砕することにより、サンプルを均質化します。粉砕手順全体でサンプルを凍結しておくには、各粉砕の間に少なくとも10秒間、チューブを液体窒素で冷却することが重要です。均質化が完了したら、シクロヘキシミドを含む1ミリリットルの溶解バッファーをサンプルに加えます。ピペッティングでよく混合し、サンプルを新しい1.5ミリリットルチューブに移します。摂氏 4 度で 20, 000 倍 g で 5 分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。100マイクロリットルのライセートを別の新しい1.5ミリリットルチューブに移し、ポリ(A)mRNAを単離します。mRNAサンプルを含むチューブを残りのライセートに急速凍結し、液体窒素でのフットプリント抽出に使用し、マイナス80°Cで保存します。足跡抽出の前夜に、事前に準備したショ糖勾配を摂氏4度で解凍しました。翌日、細胞溶解物を氷上で解凍します。50 OD260ユニットを含む細胞溶解物のアリコートを新しい1.5ミリリットルチューブに移し、最大1ミリリットルの新鮮な溶解バッファーと10マイクロリットルのRNaseを1つ追加します。室温で、ヘッドオーバーヒールローテーターで穏やかに回転させながら1時間インキュベートします。次に、ポリマーチューブ内の10%から50%のスクロースグラジエントの上にライセートサンプルを穏やかに層状にします。SW41 tiの回転子を使用して、35、000のrpmで摂氏4度で3時間のためのultra遠心分離機。ウルトラセトリフュージング中に、グラジエント分画システムを設定します。コンポーネントの電源を入れ、UVモニターを少なくとも30分間ウォームアップします。シリンジにチェイス溶液を充填し、シリンジとカニューレ内の気泡を取り除きます。超遠心分離が完了したら、ショ糖勾配が入った超遠心チューブを取り付けて穴を開けます。シリンジポンプを1分あたり1ミリリットルで始動し、A254値を監視しながら1ミリリットルのフラクションを収集します。ADSモノソームピークを表すフラクションが収集され、プールされます。12、000倍のgで摂氏4度で0.5ミリリットルの遠心フィルターを通して10分間フラクションをろ過し、フロースルーを廃棄し、容量が100マイクロリットル未満になるまで繰り返します。ピペッティングで混合した400マイクロリットルの放出緩衝液で、氷上で10分間インキュベートし、ユニットを新しいコレクションチューブに移し、摂氏4度で10分間12, 000倍gで遠心分離します。フロースルーを収集します。続いて、フットプリントフラグメントを精製し、テキストプロトコルに記載されているようにエタノール沈殿を使用してサンプルを沈殿させます。この手順を開始するには、沈殿したフットプリントと断片化されたmRNAサンプルを20,000倍のgおよび摂氏4度で30分間遠心分離します。エタノールを除去し、ペレットを風乾した後、各ペレットを7.75マイクロリットルの水に懸濁します。各ペレットに、1マイクロリットルの10XT4ポリヌクレオチドキナーゼバッファー、1マイクロリットルのT4ポリヌクレオチドキナーゼ、および0.25マイクロリットルのRNase阻害剤を追加します。摂氏37度で1時間インキュベートします。10マイクロリットルの2X TBE尿素サンプルバッファーを、各フットプリントおよびmRNAサンプルの10マイクロリットルに加えます。サンプルと適切なコントロールを摂氏75度で3分間インキュベートし、スピンダウンして1分間氷上に置きます。各サンプルを15%TBE尿素ゲルの2つのウェルにロードし、180ボルトで1時間ゲル電気泳動することによりRNAフラグメントを分離します。光から5分間保護した核酸ゲル染色でゲルを染色します。青色光トランスイルミネーターの下でゲルを可視化しながら、フットプリントサンプルの場合は28〜32ヌクレオチド、mRNAサンプルの場合は約50〜70ヌクレオチドの適切なバンドを切り取ります。切除したポリアクリルアミドゲル片をマイナス80°Cで少なくとも10分間凍結してから、ポリアクリルアミドゲルからRNAを抽出します。逆転写の前に、3つのプライムアダプターライゲーションを行い、テキストプロトコルに記載されているようにサンプルを沈殿させます。各ペレットを11.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。次に、0.5マイクロリットルの8マイクロモル逆転写プライマーと1マイクロリットルのdNTPミックスを追加します。摂氏65度で5分間インキュベートし、次に氷の上に置きます。各サンプルに、4マイクロリットルの5xファーストストランドバッファー、2マイクロリットルの0.1モルDTT、0.5マイクロリットルのRNase阻害剤、および0.5マイクロリットルの逆転写酵素を追加します。48°Cで30分間、65°Cで1分間、80°Cで5分間インキュベートします。各サンプルに0.8マイクロリットルの2モル水酸化ナトリウムを加え、摂氏98度で30分間インキュベートすることにより、RNAの加水分解に直ちに進みます。0.8マイクロリットルの2モル塩化水素を加えて、反応を中和します。テキストプロトコルに記載されているようにサンプルを沈殿させた後、各ペレットを5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁し、5マイクロリットルの2x TBE尿素サンプルバッファーを追加します。摂氏75度で3分間インキュベートし、スピンダウンし、1分間氷で冷やします。10%TBE尿素ゲルの1ウェルにサンプルをロードします。逆転写反応の生成物をゲル電気泳動180ボルトで50分間分離します。光から保護された核酸ゲル染色でゲルを5分間染色します。青色光トランスイルミネーターを使用して、バンドを約128ヌクレオチド以上で切り取ります。ポリアクリルアミドゲル片をマイナス80°Cで少なくとも10分間凍結してから、ポリアクリルアミドゲルからDNAを抽出します。DNAを環状化するには、各DNAペレットを16.75マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。2マイクロリットルの10x一本鎖DNAライガスバッファー、1マイクロリットルの50ミリモル塩化マンガン、および0.25マイクロリットルの一本鎖DNAリガーゼを追加します。60°Cで1時間インキュベートし、続いて80°Cで10分間インキュベートします。沈殿せずに、一本鎖DNAライゲーション反応生成物をマイナス20°Cで保存します。続いて、PCRライブラリ増幅を行い、続いてテキストプロトコルに記載されているようにライブラリ定量とハイスループットシーケンシングを行います。PCR増幅フットプリントライブラリとmRNAサンプル用に得られたシーケンシングライブラリの代表的なバイオアナライザープロファイルを示します。フットプリントライブラリーの予想平均サイズは148〜152ヌクレオチドで、mRNAライブラリーの予想サイズは170〜190ヌクレオチドです。このグラフは、野生型サンプルとhbs1欠失変異体の2つの独立した生物学的複製について得られたmRNA、フットプリント、およびrRNAリードの合計数を示しています。フットプリントライブラリ内のシーケンシングされたすべてのリードの50%から60%が、リボソームで保護されたフットプリントフラグメントに対応していました。対照的に、mRNAライブラリーではrRNA断片のわずか3%しか観察されず、ポリ(A)mRNAの単離によりrRNAリードの効果的な排除が可能になることが実証されました。フットプリントサンプルライブラリとmRNAサンプルライブラリはどちらも、一致したサンプル間のピアソン相関係数が約0.99であることで示されるように、良好な再現性を示しています。mRNA存在量測定と組み合わせることで、リボソームプロファイリングにより、実験条件間の翻訳効率の変化を測定することができます。hbs1欠失変異体において有意にアップレギュレーションされた遺伝子とダウンレギュレーションされた遺伝子は、mRNA転写の変化、翻訳効率、または共通の影響の影響を受けるかどうかによってグループ化されます。習得すると、約11日ですべてのプロトコルを実行できます。この手順を試行する際は、手袋を着用し、RNaseフリーの試薬と消耗品を使用してすべての手順を実行することを忘れないでください。これにより、RNaseの汚染を回避し、サンプル中のRNA分解のリスクを下げることができます。このビデオを見れば、ヌクレアーゼ消化を使用してリボソームフットプリントを生成する方法、ショ糖勾配分画による無傷のリボソームフットプリント複合体の単離方法、ディープシーケンシング用のDNAライブラリの調製方法について十分に理解できるはずです。液体窒素の取り扱いは非常に危険であり、極端に冷たい材料を取り扱う際には、安全メガネやクライオ手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

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グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

共翻訳相互作用は、新生鎖修飾、標的化、折り畳み、およびアセンブリ経路において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、 in vivo、モデル真核生物...

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De novo リボソームプロファイリングデータによるアクティブに翻訳されたオープンリーディングフレームの同定

学ぶリボソームプロファイリングによるSaccharomyces cerevisiaeのゲノム規模での翻訳定量法。この高感度技術は翻訳制御メカニズムの解明と他のモデル系への応用に有用です。

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

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