Name: 魚の精子の評価ソフトウェアを使用して、冷却装置 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学ぶ魚類精子品質評価法。CASA技術と冷却装置を用いて4℃環境下で精子運動性を正確に解析し、水産養殖の人工授精成功率向上に貢献する手法を解説します。

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このプロジェクトは、コストの協会から資金を受けている (食品と農業コスト アクション FA1205: インプレス (ジョージア州 No 642893) プロジェクト AQUAGAMETE と欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラムの下でマリー マリアスクウォドフスカ キュリー。具体的にはこのプロジェクトの記録ビデオで彼の積極的な参加の学生アルベルト ・ ヴェンドレル ベルナベウ、PROiSER の科学的なチームに感謝したいと思います。

含む動物対象としている手順は、農業生産や家畜、大学パラオレイ バレンシアでの一般的な方向性によって (2015/VSC/エンドウ/00064) を承認しました。
1. 捕われの身で精子を成熟したヨーロッパのウナギから収集します。
注: 使用ヨーロッパうなぎ男性海水と一定した温度 (20 ° C) での再循環システム タンクに保持されます。毎週の腹腔内注射 (ひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG); 魚体重の g あたり 1.5 IU) を通してホルモンを扱います。慣らす徐々 に始まる 3 日間淡水魚に海水交換が続く (1/3 水タンク内の) 37.0 g/mL の塩分濃度に到達するまで 2 日おき。
<ol><li>良質の精子のサンプルを取得するホルモン注射後 24 h ウナギを麻酔します。<ol>
<li>あらかじめ、麻酔の準備: 70% エタノール 100 mL にベンゾカインの 300 mg を追加。よく混合し、4 ° C で保存</li>
		<li>60 mg/L の最終的な集中を取得し、正しくミックス システム水の 5 L の柔軟なバケツにベンゾカインを希釈します。</li>
		<li>ベンゾカイン システム水とバケツに魚を転送します。魚が落ち着くまで、数分を待ってください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>水で陰部をクリアし、糞便、尿や海水によって精子サンプルの汚染を避けるために吸水紙を乾燥します。</li>
	<li>腹部に穏やかな圧力を適用し、真空ポンプを使った 15 mL プラスチック チューブに精子を採取します。精子の量まで 6-7 mL、男性によって。</li>
	<li>運動解析を実施するまで少なくとも 1 時間のための 4 ° C で精子サンプルを保ちます。</li>
</ol>2. 冷蔵庫で冷やし、精子サンプルを希釈
<ol><li>原因の解決策を事前に準備します。 注: それぞれの種に固有のエクステンダー ・ ソリューションで精子サンプルを希釈する必要があります。<ol>
<li>うなぎ精子サンプル (P1 中) の非活性化メディアを準備します。重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウムと 250 mL の蒸留水に塩化カルシウム 0.037 g 0.56 g の 0.127 g の 1.828 g 0.42 g を追加します。ミックスも解散します。4 ° C でのストア</li>
	</ol>
</li>
	<li>一定温度でサンプルを維持するために 4 ° c のクーラーのブロックを設定します。温度が安定するまで待ちます。</li>
	<li>それぞれの種にソリューション固有の攪拌機構を用いた精子サンプルを希釈します。 注: 希釈倍率固有種であり、プロトコルの標準化を定義する必要があります。まず、手順 3 と 4 で説明したように、ソフトウェアを使用して運動の事前の分析で得られた濃度に基づく精子濃度を予測します。この分析とは、運動の割合に基づいて最高の精子のサンプルを選択することが可能ですも。この後、研究者は正しい濃度で最高のサンプルを用いた実験のためのデータ収集を開始できます。<ol>
<li>1:50 の比率で P1 中うなぎ精子サンプルを希釈します。500 μ L の希釈うなぎ精子を準備するには、新鮮な精子サンプルを 50 μ l 添加し、P1 の 450 μ L を追加します。よく混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 精子の運動パラメーターを評価します。
<ol><li>
セットアップ ソフトウェアの運動モジュール
	<ol>
<li>4 ° C のクーラーの段階を設定し、それが安定するまでを待ちます。</li>
		<li>ソフトウェアを開き、運動モジュールを選択します。必要な場合は、ユーザー名とパスワードを作成します。</li>
		<li>プロパティと精子分析を開始する前に必要なパラメーターを選択します。<ol>
<li>種をクリックして |魚。</li>
			<li>それぞれの種の最高の技術的な条件によって1 秒あたりのフレームとイメージの数を選択します。1 秒あたり 120 の画像の両方のオプションを設定します。</li>
			<li>否定的なコントラストを選択します。精子の軌跡16の正確な再生のために必須です。</li>
			<li>対応する商工会議所のカウントとビデオカメラのスケールを選択します。実験で使用される倍率レンズのカメラを調整します。カウント部屋として SpermTrack10 と 10 倍の規模を設定します。 注: 一般的に、カウントの商工会議所で 10 μ m の深さと 10 倍の倍率のレンズが推奨条件以来、彼らはすべての精子のよりよい焦点を提供し、セルの最大数をキャプチャします。ただし、それぞれの種の運動解析のための最適な条件の以前の研究をすることをお勧めします。</li>
			<li>それぞれの種の粒子領域と接続を調整します。2 の2 μ m と 7 μ m で接続で最小の粒子領域を設定します。 注: 魚のため、粒子面積の範囲は 2-5 μ m と接続との間の最小値は精子の速度とフレーム レートに依存します。</li>
			<li>設定を保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>キャプチャを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ソフトウェアでのヨーロッパウナギ精子を分析します。
	<ol>
<li>2 %bsa の蒸留水 25 mL に市販塩の 0.946 g を追加することによってソリューションの活性化 (人工海水) を準備します。</li>
		<li>500 mL の活性剤溶液 (人工海水) を取り出して、クーラーのブロックにします。 注: 一般に、魚の精子をアクティブに浸透衝撃イベント、いくつかの種のイオン濃度も重要かもしれませんが。海洋生物の培地は、高張べき間淡水種のため活性化中低張性浸透圧が必要です。</li>
		<li>冷却ステージの下で数える商工会議所を置き、4 ° C に温度が安定するまで待つ</li>
		<li>ミックス活性化と希薄化後精子精子をアクティブにし、アクティブ化後 5-10 秒間録画運動を開始します。<ol>
<li>カウントの商工会議所の活性化ソリューションの場所 4 μ L を取る。</li>
			<li>優しく精子細胞の損傷を防ぐため、遠心の 3 回を揺することによって希釈した精子をホモジナイズしてください。</li>
			<li>0.5 μ L の希釈した精子を取り出して活性剤混ぜてカウントの商工会議所ですぐにカバーをかけます。 注: この手順は、5 以上を取る必要がありますいない s 分析をできるだけ早く開始します。</li>
			<li>精子細胞に焦点を当てるし、セル (補足図 1 a) 間の遮断を避けるために精子 (150 に 200 細胞) の低い数字によって定義された最高の視覚領域を見つけます。速度に従って分かれている精子のトラックを取得するビデオのキャプチャを選択します。</li>
			<li>キャプチャを取得、結果の変動が少なく進み以前のように最適な間隔である 7 に 3 フィールドを取得するを選択します。120 の s ライセンス認証後カウント チャンバーのカバーの結露を避けるためにまでビデオを録画できます。</li>
			<li>出口の一般的なビューのすべてのフィールドを選択します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 運動データを取得します。
<ol><li>フィールドを選択 |部分的な |保存とファイル名を選択します。保存をクリックします。 注: スプレッドシートは、部分的なデータ、グラフおよび精子トラックの画像の平均値を提供します。</li>
	<li>一般的なデータを選択 |ファイル名 |保存。 注: データは、すべてのフィールドの個々 の精子の運動の値を提供します。</li>
</ol>

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<li>Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermiogram+and+sperm+head+morphometry+assessed+by+multivariate+cluster+analysis+results+during+adolescence+%2812-18+years%29+and+the+effect+of+varicocele%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).</li>
<li>Soler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dog+sperm+head+morphometry%3A+its+diversity+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution.</a> Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).</li>
<li>Valverde, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+and+subpopulation+structure+of+Holstein+bull+spermatozoa%3A+variations+in+ejaculates+and+cryopreservation+straws%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws.</a> Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).</li>
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著者が明らかに何もありません。

このプロトコルで使われる精子分析ソフトウェア使用されています研究者によって世界的な種、魚など。しかし、魚は精子の評価に影響を与えることができるいくつかの特定の機能にあります。魚の精子はすぐに低下し、活性化した後短時間の運動につながる活性化の瞬間に高速を示した。その上、再現の温度は種に依存し、いくつかのケースでは約 4 ° C2,4,8,12かもしれない。したがって、魚の精子分析のためのコンピュータ システムの効率を改善するためにいくつかの適応にする必要です。運動パラメーターの基本原則は買収と運動精子の連続画像の解析です。ほとんどのシステムは、ハードウェアとソフトウェア17,18,19,</...

再現性は、両方の配偶子 (卵と精子)1,2の品質に依存します。これは、正常な受精の可能な子孫3,4の開発が可能に貢献する主要な要因です。配偶子の便利な評価は、標本の不妊の可能性を定義するための最良のツールです。
多くの水生商業種4の生産に一般的な方法は、複数の男性から精子を混合します。ただし、男性の精子変動が精子競争につながることができますそして、したがって、すべての男性は、同じように遺伝子プール5に貢献しています。この意味で、運動などの個々 の射精/精子機能の適切な評価は潜在的な個々 の男性不妊に関する差別的な情報を取得に不可欠です。それは時間と一貫性の欠如、結果6、7の非互換性につながる経験を必要と、精子の運動の直接観察は不正確で、主観的なデータを生成できます。ただし、信頼性の高い精子の品質分析2,4を提供することができます多くの革新的な迅速かつ定量的手法があります。
精子のコンピューター支援型分析は、精子品質8に関する正確なデータを提供する開発されました。この技術には、精子の運動性の評価をできる位相差顕微鏡に関連するソフトウェアの開発が含まれています。しかし、運動パラメーターの制限要因はビデオ カメラのフレーム レートです。軌道が精子に基づいている個々 の精子頭部重心位置の連続したフレームでビデオ録画の鞭毛運動パターン3,9,10,と相関している11. 測定するメインの速度論的パラメーターは直線速度 (VSL)、曲線速度 (VCL) 平均パス速度 (VAP)。VSL は、開始と精子を時間で割った値で撮影したエンドポイントとの間の距離です。VCL は、精子で撮影した正確な軌道に沿って実際の速度です。VAP は、軌道の派生平滑化されたパスに沿って速度です。これらのパラメーターは、直線性 (LIN)、真直度 (STR)、揺れ (一) 横方向のヘッドの動き (ALH) とビート クロス周波数 (BCF)4,10の振幅のような暴行測定など追加の運動情報を許可します。
哺乳類の精子分析システムがもともと、ドナー (約 37 ° C) の体温で動作するシステムの要件の 1 つです。このソフトウェアは魚種にも使えるとはいえ、精子分析結果の誤差を減らすためにいくつかの適応を作るべきです。サケやウナギの8,12など、いくつかの魚種で受精は低温 (およそ 4 ° C)2,4で発生します。したがって、不快な労働条件を避けるためには、冷却装置を開発する必要があります。また、魚類精子のいない精液の運動性、運動を有効に浸透衝撃を必要です。海洋生物の培地は、高張べき間淡水種のため活性化中低張性浸透圧が必要です。しかし、いくつかの種は、サケ科魚類、としてイオン濃度もかもしれない重要な3,4,9。活性化後の魚の精子は運動 (2 分以内)13,14高速で信頼性の高いデータ15を取得する最適なフレーム レートを決定することが重要されているの急速な減少によって特徴付けられます。
本研究の目的は、デザインし、魚精子サンプルの冷凍システムを適用です。さらに、このプロトコルは、種に応じて標準プロトコルの確立のための最適なフレーム レートを決定する方法を定義します。このプロトコルの使用は、モデルとしてヨーロッパのウナギを用いた魚精評価のコンテキストで新しい扉を開きます。

<table><tbody><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン</td><td>アージェント化学研究所</td><td>hCG</td><td>ホルモン</td></tr><tr><td>ベンゾカイン</td><td>メルク</td><td>E1501 シグマ</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>メルク</td><td>S5761 シグマ&nbsp;</td><td>P1ミディアム</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>1.06406 EMD ミリポア</td><td>P1 中</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>メルク</td><td>1374248 USP</td><td>P1 中</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルク</td><td>P3911-500G</td><td>P1 中</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>メルク</td><td>C7902-500G</td><td>P1 中</td></tr><tr><td>商業塩</td><td>アクアメディック&nbsp;</td><td>Meersalz</td><td>Activator ソリューション&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>05470 Sigma</td><td>Activator ソリューション&nbsp;</td></tr><tr><td>ファルコンチューブ 15 ml</td><td>メルク</td><td>T1943-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブサポート</td><td>メルク</td><td>R5651-5EA</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ</td><td>メルク</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット 20 & マイクロ;l</td><td>ギルソン・</td><td>ピペットマン&reg;クラシック</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット10 & マイクロ;l</td><td>メルク</td><td>Z683787-1EA</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット用ヒント 20 & マイクロ;l</td><td>メルク</td><td>Z740030-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット 10 & マイクロのヒント;l</td><td>メルク</td><td>Z740028-2000EA</td><td></td></tr><tr><td>Spermtrack</td><td>PROiSER</td><td>計数室</td><td></td></tr><tr><td>TruMorph</td><td>PROiSER</td><td>TruMorph</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 UB 200i Serie</td><td>PROiSER</td><td>顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>クーラープレート</td><td>PROiSER</td><td></td><td>プロトタイプ</td></tr><tr><td>クーラーブロック</td><td>PROiSER</td><td></td><td>プロトタイプ</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>PROiSER</td><td>ISAS</td><td>ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

魚の精子の評価ソフトウェアを使用して、冷却装置

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

配偶子品質評価のため養殖のための有用なデータを提供できる革新的な迅速かつ定量的な手法があります。精子分析のためのコンピューター化されたシステムは、いくつかのパラメーターを測定するため開発された測定する最も一般的の 1 つ、精子の運動です。
当初は、魚の精子分析のため使用することもできますが、このコンピューター技術は哺乳類種のため設計されました。魚は、精子評価など短い運動時間活性化した後と、場合によっては、温度を下げるための適応に影響を与えることができる特定の機能を持っています。したがって、運動解析を魚の精子分析のためより効率的にソフトウェアとハードウェアのコンポーネントを変更する必要は。哺乳動物の精子、精子の最適温度を維持するために加熱プレートを使用します。しかし、いくつかの魚種のため、以来、精子は 2 分以内にアクティブなまま、運動の持続時間を延ばすために低温を使用する便利です。したがって、冷却装置が分析、光学顕微鏡などの時間の経過とともに一定の温度でサンプルを冷蔵する必要です。このプロトコルでは、魚の精子の運動性の精子分析のためのソフトウェアを使用して、新しい結果を最適化するデバイスを冷却の分析について説明します。

精子の運動の時間効果の解析
15 から静的な精子の割合増加するヨーロッパのウナギの場合 120 s (36.9% 20.9%) から s (24.4% から 40.7%)、活性化とモバイルの進歩的な精子の割合が減少しました。(図 1 aと1 b)。速度に基づいて、精子細胞は時間 (図 1と1 D) 減少の経過速度の低下を示した。急速な速度で精子の割合が減少 (49.4% 26.6%) から約 23% と音速を持つ精子の割合は約 7% を増加しました。
フレーム レートとカウントのチャンバーの効果</...

この議定書は、精子のコンピューター支援型分析を使用して、デバイスを冷却魚精子評価の手順を説明します。ソフトウェアは、迅速、正確なと養殖業の再生の成功を改善するために便利なツールをすることができます、精子運動に基づく魚の精子の質の定量分析を与えます。

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

この手順の主な目標は、人工受精の成功に貢献するために、精子の運動性に基づいて魚の精子の質を分析することです。バレンシア大学の教授であり、PROiSER R+Dの科学ディレクターであるCarles Soler博士です。私はカリーナ・カルデイラ、インプレス・プロジェクトのフェローシップです。CASA技術は、数十年前に、コンピューター支援の精液分析を使用して哺乳類種の精液分析のために開発されました。魚の場合、2つのことを考慮に入れる必要があります。最初のものは、これらの動物は通常、約4度の低温で受精しているという事実であり、このため、家庭内の精液を分析することはできませんが、サンプルを冷蔵するための特定のツールを開発する必要があります。もう一つの問題は、活性化後に運動性が非常に速く減少することであり、この事実を分析し、品質または精液の質の分析に適した瞬間を定義する必要があります。だから、我々は魚の精子の分析を示すつもりです、そしてこのプロトコルは哺乳類のプロトコルの修正版であり、それを使用して運動性分析が含まれますので、始めましょう。魚はホルモン注射のために麻酔をかけられ、24時間後に精子サンプルが採取されます。性器領域は汚染を避けるために洗浄されます。精子は穏やかな圧力を加えることで収集されます。精子サンプルは、運動性分析が行われるまで4度に保たれます。希釈剤と活性剤は事前に調製されます。Cooler ブロックを 4 度に設定して、サンプルを一定の温度に保ちます。安定するまで待ちます。精子サンプルは、各種に特異的な希釈剤を使用して希釈します。ヨーロッパウナギの場合、精子はP1培地で1:50の比率で希釈されます。希釈した精子500マイクロリットルを準備し、P1の450マイクロリットルと新鮮な精子サンプルの50マイクロリットルを追加します。よく混ぜます。活性剤溶液のアリクオーターを取り、クーラーブロックに置きます。涼しい方のステージを 4 度に設定します。安定するまで待ちます。motilityモジュールを選択し、必要に応じて名前とパスワードを使用します。プロパティを選択します。種をクリックし、魚を選択します。毎秒のフレーム数と使用する画像の数を選択します。ネガティブコントラストの使用は必須です。対応する計数チャンバーとスケールを選択します。各種ごとに、粒子の面積と接続性を適応させます。ヨーロッパウナギの場合、最小粒子面積は2、接続性は7である必要があります。設定を保存します。キャプチャを開きます。4マイクロリットルの活性化剤溶液を取り、チャンバーに入れます。希釈した精子をよく均質化します。5マイクロリットルの精子を取り、活性化剤と混合します。カバーを置きます。サンプルに焦点を当て、最適な視覚領域を見つけます。キャプチャビデオを選択して、速度に応じて分離された精子トラックを取得します。より多くのフィールドをキャプチャできます。キャプチャを選択し、前と同じように続行します。[exit]をクリックすると、すべてのフィールドの全体像が表示されます。精子の捕捉は、活性化後、特定の時間間隔で取得されました。ただし、精子分析は、反復する時間間隔ごとに実施されました。各時間間隔の部分レポートは、フィールドを選択して[部分]をクリックすることで取得できます。Excelシートには、精子の軌跡の部分データ、グラフ、および画像の平均値が表示されます。他のフィールドについても同じ手順を繰り返します。もう 1 つのオプションは、一般データです。これらのデータは、すべてのフィールドの個々の精子の運動学的値を提供します。パーシャルレポートでは、円グラフを使用して、さまざまな時間の運動性と進行性の割合をすぐに比較できます。一般的なデータでは、速度論的パラメータを使用していくつかの統計解析を取得することができます。Spermatozoa トラックには 3 つのパラメーターがあります。VCL、曲線速度、VSL、プログレッシブ速度、VAP、パス速度。VCL は最も重要なパラメータであり、1 秒あたりのフレーム数によって変化します。フレーム数を増やすと、VCLも増加し、ほぼ完璧なトラック解析が可能になります。最適なフレームレートは、種によって異なります。目的は、VCLの最高値を見つけることであり、その後、カウンティングチャンバーなどの他のツールとの潜在的な違いが観察される可能性があります。サブポピュレーションは現在、精子サンプルに関するより多くの情報を提供する重要な統計分析です。これはアトランティックサーモンの精子サンプルの例です。飼育下で生産されたさまざまな世代で、さまざまな精子の亜集団が観察されます。魚の精子分析にコンピューターシステムを使用する方法と、カウンティングチャンバー、温度、フレームレートなどの技術的および方法論的側面を最適化する方法を示しました。したがって、このデータを使用すると、魚の繁殖など、さまざまな分野で多くの分析を行うことができ、水産養殖だけでなく、保全プログラム、系統発生研究、または精子の個体数に関する知識を増やすためにも行うことができます。ですから、このプロトコルがあなたの研究に役立つことを願っています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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本稿では、密度勾配遠心法と精子の生理学的研究への応用のパフォーマンスについて説明を目指します。...

密度勾配遠心法を用いた差動品質の精液採取

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本プロトコルは、単一のサイトメーターでヒト精子のアポトーシス、ミトコンドリア膜電位、およびDNA損傷の測定を可能にする実用的なソリューションを提供します。...

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この記事では、小型モデル魚メダカ(Oryzias...

硬骨動物モデルにおける精子採取とコンピュータ支援精子解析 メダカ

このプロトコルは、精子の運動特性とチグモタキシスを利用して、DNA断片化指数が低い高品質の精子をスクリーニングする方法を説明しています。U字型の水平スイミングレーンを採用しているため、死んだ精子や細胞残骸、不純物を排除しながら、バッファー液滴を通じて高品質な精子を反対側に届けることができます。...

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学ぶ魚類精子品質評価法。CASA技術と冷却装置を用いて4℃環境下で精子運動性を正確に解析し、水産養殖の人工授精成功率向上に貢献する手法を解説します。

魚の精子の評価ソフトウェアを使用して、冷却装置

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