Name: 新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぼう、気管支上皮細胞の移動を評価する新規in vitro傷治癒アッセイ法。シリコンインサートを用いた擬似創傷作成と自動画像解析により、免疫調節ペプチドの効果を定量的に測定し、創傷治癒メカニズムの解明に貢献します。

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この作品は、ローマ ・ ラ ・ サピエンツァ大学とイタリアの嚢胞性線維症研究財団 (プロジェクト FFC #11/2014 年シエナ、ソンドリオ Valchiavenna、Cerea Il ソリーゾ ・ ディ ・ ジェニー、パヴィア FFC 代表団によって採用) からの資金によって支えられました。この仕事の一部はまたによって FILAS グラント Prot. FILAS-RU-2014-1020 をサポートされていました。
気管支の上皮細胞を提供するため博士ロレッタ フェレーラ (U.O.C. Genetica ・ メディカ、Istituto Giannina ガスリーニ、ジェノバ、イタリア) に感謝しております。

1. セル準備
<ol><li>10% 牛胎児血清 (FBS)、抗生物質 (ペニシリンとストレプトマイシンの 0.1 mg/mL) およびピューロマイシン プラス 2.5 x 106 10 mL の最小必須培地 (MEM) 2 mM グルタミン (MEMg) を添加した細胞を播く (0.5 μ G/ml の選択と維持のため、行のセル) T75 フラスコ。2 日間の 37 ° C、5% CO2でフラスコを孵化させなさい。実験を始める前に、倒立顕微鏡下で細胞の合流点を確認します。 注: 実験用セルは、レンチウイルスベクターをピューロマイシン耐性で導入した不死化ひと気管支上皮細胞です。安定機能 CFTR14,15を表します。</li>
	<li>セルの合流は 90-100% に達したら、フラスコから培地を吸引し、生物学的安全キャビネット クラス II の下で廃棄ボトルにそれを破棄します。カルシウムとマグネシウム (CMF PBS) なし生理食塩水リン酸緩衝の ml の 6 セルを洗います。優しく、フラスコを手動でロックし、CMF PBS を破棄します。 注: ピペットで細胞膜を触れないように気をつけてください。</li>
	<li>CMF PBS の 10 mL を追加し、10 分間の 37 ° C および 5% の CO2でフラスコを孵化させなさい。</li>
	<li>CMF PBS を吸引し、それを破棄します。トリプシン/EDTA の 2 mL をフラスコに追加します。</li>
	<li>完全に細胞が顕微鏡の下で目に見えて戸建まで 10 分の CO2を 37 ° C、5% でフラスコをインキュベート細胞をコートしソリューションを許可するフラスコみ合います。 注: インキュベーション時間の終わりに、セルが丸いとプラスチック表面にもアタッチされていないに表示されます。まあ戸ないセルは、手動撹拌が必要かもしれません。</li>
	<li>MEMg プラス 10% の 10 mL を加えてトリプシンを不活化し、フラスコの底を洗浄することにより細胞を収集する政府短期証券。50 mL のコニカル チューブにボリュームを転送します。</li>
	<li>80 x gで 5 分間チューブを遠心します。</li>
	<li>上清を吸引し、再 MEMg プラス 10% の 6 mL のセルを中断政府短期証券。ピペット繰り返し任意の塊を破る。</li>
	<li>マイクロ ピペットで細胞を懸濁液の 10 μ L を取り出して、以前 Burker またはノイバウアー室の上に置くカバー ガラスの下でボリュームを挿入します。</li>
	<li>セル数をカウントします。</li>
</ol>2. 細胞文化の播種を挿入します。
<ol><li>12 ウェル プレートの各ウェル、滅菌ピンセット (図 1) で文化挿入を転送します。板の表面にそれらを修正するために挿入のエッジに沿って押すようにピンセットを使用します。 注: 挿入により接着性粘着性の下側があります。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg"> 図 1: 12 ウェル プレートのウェルに正しく入れて、シリコーン文化挿入の略図。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="2"><li>正しく MEMg プラス 10% の細胞懸濁液を希釈 FBS。細胞懸濁液 (約 3.5x104セル/室) の 70 μ L で、挿入の各区画を入力します。 注: 各区画に適用されるセルの密度は、細胞の種類によって異なります。24 h 内で合流の細胞密度を使用することをお勧めします。</li>
	<li>顕微鏡で細胞挿入コンパートメントから漏れていないと 37 ° C、5% CO2で 24 時間 12 ウェル プレートを孵化させなさいことを確認します。</li>
</ol>3. 擬似創傷治癒アッセイ
<ol><li>インキュベーション後、コンフルエントの細胞が形成されていることを確認を倒立顕微鏡下で細胞を可視化します。</li>
	<li>再 1 ml MEMg のテスト混合物 (例えばアンプ) を中断します。 注: 準備新鮮なアンプ希釈原液-20 ° C で保存から始まって</li>
	<li>滅菌ピンセットでチップを慎重に取り外します。細胞膜を壊さないように注意してください。転送吸収紙の上に挿入します。 注: 同じ挿入を再利用するには、滅菌に少なくとも 3 時間の 70% エタノールで。その後にそれらを捨てることをお勧めします。</li>
	<li>非付着性のセルを削除するには、マイクロ ピペットを使用してあたり MEMg の 1 mL を追加します。プレートを閉じ、そっとそれをロックします。 注: は、混乱を避けるために細胞膜上に直接メディアを追加しないでください。</li>
	<li>培地を吸引し、ウェルあたり MEMg の 1 mL と置き換えます。プレートを閉じ、ビデオ カメラを装備して、4 倍の倍率で倒立顕微鏡下で (挿入によって作成された) 携帯無料ギャップを可視化します。画像時 0 (T0) を取得し、.jpg 形式で保存します。</li>
	<li>井戸からメディアを取り出して、1 mL の PBS で洗浄し、それを破棄します。</li>
	<li>井戸に (3.2 の時点で準備) テスト混合物を追加します。無処理試料 MEMg の 1 mL を追加します。37 ° C と 5% の CO2でプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>15、20、および 24 時間治療後、4 倍の倍率の顕微鏡下で細胞の移動を観察し、画像を取得します。 注: この手順では、T0 は同じエリアの画像をキャプチャする試み。イメージがキャプチャされます時間間隔は、セルの移動速度によって決まります。</li>
	<li>いくつかの選択的阻害薬の効果を研究、すなわちAG1478、細胞移動への挿入を削除する前に各挿入のコンパートメントから媒体を吸引します。<ol>
<li>新鮮な MEMg と各コンパートメントを洗浄し、AG1478 を添加した MEMg の 70 μ L でそれを埋めます。</li>
		<li>37 ° C および 5% CO2で潜伏の 30 分後 3.3 ポイントから説明するように進みます。 注意: 洗浄のステップおよび細胞特異的阻害剤単分子膜の前処理中に挿入を削除しないように注意します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 画像解析
<ol><li>実験が完了したら、さまざまな実験的グループの最も代表的なサンプルの画像を選択し、T0、T15、T20、T24 h で 1 つの画像を含む zip ファイルを作成します。 注: 単一の画像はすべてサンプルを選択した時間間隔で撮影されます。少なくとも 3 回を繰り返し、それぞれの実験の実行をトリプリケートします。最後に、すべての実験的グループ、("a"、"b"、"c"、等、それぞれの独立した実験から派生する) 3 つの画像の最小の各時点で分析されます。</li>
	<li>自動的に電子メールで選択した時点で (パーセンテージ) 細胞に覆われたとスクラッチ領域の実験的データを含むスプレッドシートの概要ファイルを提供する画像解析ソフトに zip ファイルをアップロードします。 注: リーディング エッジとギャップ領域の認識は (目的で画像の明るさが大幅に変更された点を識別する) エッジ検出法に基づいて。</li>
	<li>データを保存し、それらを収集します。時間 0 で平均値に対するすべてのデータを正規化します。各時点で相対的標準誤差 (SEM) すべて複製の正規化されたデータの平均値を計算します。双方向分散分析 (ANOVA) を使用して、適切な統計解析ソフトウェアの統計分析を実行します。ペプチド投与群と異なる時間間隔で制御グループの違いと見なされる統計的に重要なpの &lt; 0.05。</li>
	<li>グラフに、選択した時間間隔すべてサンプル グループ対の細胞で覆われた領域のパーセントを示すヒストグラムとして得られたデータをプロットします。</li>
</ol>

<ol><li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25813429">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li>
<li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complicated+skin%2C+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li>
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<li>Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+wound+healing%3A+biological+and+therapeutic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations.</a> Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).</li>
<li>Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+role+of+stem+cells+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing.</a> Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).</li>
<li>Hu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+regenerative+repair+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and regenerative repair in wound healing.</a> Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).</li>
<li>Ramot, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+PPARgamma-mediated+signalling+in+skin+biology+and+pathology%3A+new+targets+and+opportunities+for+clinical+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology.</a> Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).</li>
<li>Lai, Y., Gallo, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPed+up+immunity%3A+how+antimicrobial+peptides+have+multiple+roles+in+immune+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense.</a> Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).</li>
<li>Zasloff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+of+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides of multicellular organisms.</a> Nature. 415, 389-395 (2002).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).</li>
<li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frog+skin-derived+antimicrobial+peptide+esculentin-1a%281-21%29NH2+promotes+the+migration+of+human+HaCaT+keratinocytes+in+an+EGF+receptor-dependent+manner%3A+a+novel+promoter+of+human+skin+wound+healing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?</a> PLoS One. 10, e0128663(2015).</li>
<li>Di Grazia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-Amino+acids+incorporation+in+the+frog+skin-derived+peptide+esculentin-1a%281-21%29NH2+is+beneficial+for+its+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions.</a> Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).</li>
<li>Cappiello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esculentin-1a-derived+peptides+promote+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+internalized+in+bronchial+cells+of+cystic+fibrosis+patients+and+lung+cell+migration%3A+biochemical+properties+and+a+plausible+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).</li>
<li>Bebok, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+cAMP+agonists+to+activate+rescued+deltaF508+CFTR+in+CFBE41o-+airway+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers.</a> J Physiol. 569, 601-615 (2005).</li>
<li>Trinh, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+defective+cystic+fibrosis+airway+epithelial+wound+repair+after+CFTR+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue.</a> Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).</li>
<li>Gan, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+tyrosine+kinase+inhibitor+AG1478+increases+the+formation+of+inactive+untethered+EGFR+dimers.+Implications+for+combination+therapy+with+monoclonal+antibody+806%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li>
<li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li>
<li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li>
<li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li>
</ol>

著者がある何も開示するには

細胞遊走は、創傷治癒、萌芽期の開発、がんの転移など多くの生理学的および病理学的イベントに欠かせないプロセスです。細胞移行生体外で勉強する基本的な手順を含む: (iii) 傷までのさまざまな時間間隔での画像キャプチャ閉鎖に達する (i) 細胞膜、(ii) 細胞の合流の層で擬似傷の生産の作成、および (iv) 選択したセルの移行速度を定量化するために, 動画像の解析。
我々 の結果は、客観的かつセル移行特性の定量的評価法の信頼性の高い実験的文化挿入のアプリケーションである示されています。このアッセイは、基本的な実験装置とその研究グループによって実行できます。ただし、プロトコルのいくつかの重要なステップは再現性を達成するために考慮する必要があります。たとえば、パイロット実験、細胞のすべての個々 のサンプルの合流の同じ範囲を得るために各区画に種子への正確な数によって定義することが重要です。この目的に同期周期を持つ細胞と播種前に、の細胞塊を避けることが重要です。凝集を最小限にする可能な方法は、注射針で細胞を懸濁液の穏やかな通路です。しかし、サンプル サイズを増やすことにより...

動物の創傷治癒過程がけが1後の整合性と組織層の正常な機能に再確立する基本的なプロセスであることを主として知られています。物理・化学的侮辱から防護壁を形成上皮表面 (例えば、呼吸器、皮膚、消化管) の外部環境にさらされているにもかかわらず、傷の形成が発生しやすく、特に後手術または微生物感染症2。例として、嚢胞性線維症 (CF) 患者において日和見細菌菌緑膿菌、によって肺組織の植民地化とそれに伴う呼吸不全3、気道上皮の損傷につながる 4。創傷治癒は、負傷した組織5通常の建築を復元する複雑なホスト修理メカニズムです。上皮形成、血管新生、コラーゲン産生と細胞分化6,7,8 組織の改造現象を包括的な再生期間続いて初期の炎症によって特徴づけられる.上皮の完全性を確保するため、微生物の増殖を制御するため、すべての生きている有機体は抗菌ペプチド (アンペア)9,10を含む防衛分子を生成します。創傷治癒過程シミュレートの in vitro細胞残屑および異なる種類の細胞間の複雑な相互作用の欠乏のために非常に困難です。ただし、ペプチドの生体外で能力を刺激することによって擬似傷の閉鎖を加速する上皮細胞の移行は侵害された上皮を治癒する能力を示す。確かに、細胞遊走は創傷治癒にレート制限イベントと改良された創傷治癒のためのターゲット治療に役立つ細胞の移動に影響を与える要因を勉強します。
ここでは、再現性の高い実験的試金はセル移行体外を評価する特殊シリコン文化挿入に基づいて提供しています。それは、コンフルエントの細胞膜上に 500 μ m ギャップ (擬似傷) の作成に基づいています。無料のセル領域に移行する、新しい細胞間の接触を形成、人工の「負傷者」のフィールドの端にあるセルが開始されます。文化の挿入は、高速治癒促進実験のための新しいツールを表します。500 μ m の壁で区切られた 2 つの貯水池が提供され、12 ウェル プレートの井戸、3 cm 皿プレートにそれら正しく配置ことができます。挿入の各コンパートメントの細胞懸濁液を充填セル挿入の除去は (分離壁と同じ幅) 約 500 μ m のきれいな無細胞のギャップを生む一方、confluence (コンフルエンス) まで各指定地域で成長することができます。試験化合物を添加した適切な細胞培養液を皿に追加できるプレート/ウェル。その後、ギャップの閉鎖は、好ましくは 1 つの画像取り込みビデオ カメラ搭載、倒立顕微鏡下で異なる時間間隔で視覚化できます。最後に、web ベースの自動画像解析プログラムによってセル面積の変化の測定には、創傷閉鎖と細胞移動の速度の定量化ができます。全体的にみて、この方法は、スクラッチは滅菌した針でコンフルエントの細胞膜を切開によってなされる手動でまたはピペット チップ11クラシックのアッセイに関して一歩前進です。確かに、最後の手順は、皿のプラスチック底を破壊できるプレート/まあ、表面コーティング、しわを作成します。さらに、高針の先端に研究者によって適用される圧力にもよりますので、「負傷者」の領域には、ギャップの全体の長さに沿って明確に定義された幅がありません。さらに、剥がれ細胞が、ゼロの端の生活および死んだ細胞の塊を形成できます。また、「負傷者」の領域に生きている細胞の広がりは、12非再現性のある結果を生成する細胞移動の速度と干渉することができます。
さらに、スクラッチのイメージ解析プラットフォームのおかげでユーザー急速に受信できる (数分) 追加のソフトウェアを取得する必要なく選択したセルの回遊行動の定量的なデータ。このプラットフォームは、低 (~ 5 X) の位相コントラスト顕微鏡画像、中規模 (~ 10 X)、および (~ 20 倍) の高倍率を分析が可能です。セルの速度だけでなく、細胞に覆われたエリアとスクラッチ領域の割合を示すサマリー ファイルを生成する (*.jpg、*.jpeg、*.jp2, *.png, *.gif, *.tiff 形式) で画像の zip ファイルをアップロードした後、分析は自動的に行なわれます移行は、異なる時間間隔で。
カエル皮膚のアンプ誘導体、すなわちEsc(1-21) とそのジアステレオマー Esc(1-21)-1 c13、および機能 CF 膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR)14,15を表現する気管支細胞ラインを使用して、この作業でペプチドによる細胞移行 (無処理) サンプルとの比較の例を示します。気道上皮、CFTR が肺機能を維持するために重要な役割を果たすことに注意してください、修理16を傷します。さらに、による上皮成長因子受容体 (EGFR)、前述のペプチドによる気管支の細胞の移動を含む EGFR12の活性化の証拠の選択的阻害剤 (例えばAG1478)17 18の報告します。
この手順の目標は文化そのようなシリコンを挿入の使用状況が正確に付着性のセル (例えば、気管支上皮細胞) と分子の移行を判断する迅速かつ簡単にアクセスできるアッセイをどのように表現するかを要約すると、このようなイベントを制御するメカニズムです。

<table><tbody><tr><td>最小必須媒体(MEM)&nbsp;</td><td>ユーロクロン</td><td>ECB2071L</td><td>37 °C で暖かくなります。Cウォーターバス使用前</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>ユーロクロン</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清(FBS)</td><td>ユーロクロン</td><td>ECS0180DH&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンとストレプトマイシン</td><td>ユーロクロン</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA 1X in PBS</td><td>ユーロクロン</td><td>ECB3052D</td> 使用<td>前に室温で温める</td></tr><tr><td>カルシウムとマグネシウムを含まない DPBS (CMF-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>カルシウムとマグネシウムを含む DPBS (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>同上文化-挿入2ウェル</td><td>同上&nbsp;</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>Wimasis 画像解析</td><td>同上&nbsp;</td><td>30002</td><td></td></tr><tr><td>PRISMソフトウェア&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>バージョン 6.0</td><td></td></tr></tbody></table>

新規in vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

この作業の目的は、抗菌ペプチド (アンペア)、細胞の移動を刺激するなどのいくつかの免疫調節分子の能力を評価する新しい方法を提示することです。重要なは、細胞遊走、傷害後の整合性と組織層の正常な機能に再確立する創傷治癒プロセスの間にレート制限イベントです。手動で作られた単層細胞傷に基づいている古典的な分析上のこのメソッドの利点は、特殊シリコン文化の使用は明確に定義された幅 (500 μ m と無細胞の擬似巻きフィールドを作成する 2 つのコンパートメントを提供するを挿入します).さらに、自動画像解析プラットフォーム、ため急速に創傷閉鎖と細胞移動の速度で定量的なデータを得ることが可能です。正確には、気管支上皮細胞の移動に 2 つのカエルの皮アンプの効果が表示されます。さらに、これらの細胞特異的阻害剤での前処理は分子機構などのイベントに関する情報を提供します。

このプロトコルは創傷治癒機能 CFTR を表現する気管支上皮細胞に誘発される細胞の移行活動の面で Esc(1-21) と Esc(1-21)-1 c の効果を決定するために使用されました。このアッセイで文化挿入された 12 ウェル プレートの井戸に置かれ、各コンパートメントは 35,000 MEMg 10% を添加した細胞が播種された FBS。セルその後 24 時間以内の完全な合流点に達した、500 μ m ギャップが生成された、それぞれはよく異なる濃度でペプチドを含む MEMg と満たされました。実験を 4 回繰り返した。図 2で示したように、単層の細胞で生成される擬似巻きフィールドのほぼ完全な閉鎖はそれぞれ最適な濃度 1 μ M と 10 μ M の Esc(1-21)-1 c と Esc(1-21) のための ~ 20 h 以内 2 ペブチドによって誘起されました。これは Esc(1-21)-1 c が気管支細胞における擬似傷の再上皮化を促進する上でより効率的なことを示します。
<p class="...

ここでは、ペプチドの気管支上皮細胞の移動に及ぼす影響を評価するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、セル移行および創傷閉鎖の速度に定量的なデータの迅速かつ再現性の高い国又できます。

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

この手順の目標は、一部の免疫調節分子、例えば、抗マイクロペプチドが、創傷治癒過程における律速イベントである細胞移動を刺激する能力を評価する方法を示すことです。一般的に、in vitroで細胞遊走を研究するための基本的な手順には、細胞単層の作成、疑似創傷の生成、創傷閉鎖に達するまでの異なる時間間隔での画像のキャプチャ、および細胞遊走を定量化するための画像配列の解析が含まれます。さて、この方法が手作業で作製したスクラッチに基づく従来のアッセイよりも優れているのは、特殊なシリコーン培養インサートを使用して、細胞が全くなく、幅が500マイクロメートルと非常に明確に定義された疑似創傷野を作り出すことです。さらに、ウェブベースの自動画像解析プログラムにより、創傷閉鎖速度と細胞移動速度に関する定量的データを数分で迅速に受け取ることができます。したがって、全体として、これは信頼性の高い実験手法であり、データの再現性が非常に高いあらゆる種類の接着細胞に適用できます。ここでは、例として、気管支上皮細胞の遊走に対するカエル皮抗マイクロペプチドの影響と、特定の阻害剤によるこれらの細胞の前処理がそのような事象の根底にある分子メカニズムに関する情報をどのように得ることができるかを提供します。より正確には、ペプチド誘導性細胞遊走が上皮成長因子受容体の活性化にどのように関与するかを示します。実験を開始するには、細胞培養インキュベーターから細胞の入ったフラスコを取り出し、自動画像取得システムを搭載した倒立顕微鏡で周囲を確認します。完全な合流の90%に達した場合は、バイオセーフティフードに移動し、無菌条件下で10ミリリットルのプラスチックピペットを使用して培地を慎重に吸引し、培地を廃棄物ボトルに静かに廃棄します。カルシウムとマグネシウムを含まない6ミリリットルのPBS、つまりCMFで細胞を洗浄します。手動でフラスコを静かに揺らし、CMFを捨てます。次に、他の10ミリリットルCMFを添加して、細胞の破片と付着していない細胞をさらに除去します。この時点でフラスコを閉じ、細胞培養インキュベーターに10分間戻します。フラスコを取り出し、CMFを捨て、2ミリリットルのトリプシン-EDTAを静かに加えて、プラスチック表面から細胞を剥離します。フラスコを手動で静かに揺らし、溶液が細胞を完全に覆うようにし、フラスコをさらに10分間インキュベートします。その後、インキュベーターからフラスコを取り出し、トリプシン添加プロセスが完了したかどうかを確認します。この場合、細胞は懸濁状態になり、顕微鏡下で丸みを帯びて見えます。トリプシンを不活化するには、10%熱不活化ウシ血清を添加した10ミリリットルの培養培地を加え、フラスコを慎重に洗浄します。細胞懸濁液を回収し、この容量を円錐形の50ミリリットルチューブに移し、サンプルを遠心分離します。遠心分離後、ペレットの形成を確認し、上清を吸引し、血清を添加した6ミリリットルの培養培地に細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を数回上下にピペットで動かし、凝集体の形成を分解します。このプロセスには数分かかる場合があります。その後、マイクロピペットチップで10マイクロリットルを取り出し、BurkerチャンバーまたはNeubauerチャンバーのカバーガラスの下に容量を注入し、細胞数をカウントします。12ウェルプレートの各ウェルに、滅菌ピンセットを使用して培養インサートを入れます。各インサートは、500マイクロメートルの壁で区切られた2つのコンパートメントで提供され、接着を可能にする粘着性のある裏側があります。ただし、ピンセットを使用して、インサートの端に沿って圧力をかけ、プレートの表面に固定します。インサートの各コンパートメントに、チャンバーあたり約3.5×10〜4個の細胞を含む70マイクロリットルの細胞懸濁液を充填します。重要なのは、各コンパートメントに適用される細胞の濃度は、細胞の種類に依存することです。24時間以内に完全なコンフルエントにつながる細胞密度を使用することをお勧めします。顕微鏡で4倍に拡大し、インサートコンパートメントから細胞が漏れていないことを確認してから、プレートを24時間インキュベートします。インキュベーション後、細胞単層を壊さずに滅菌ピンセットでインサートを静かに取り出し、インサートを吸収紙に移します。ウェルごとに1ミリリットルの培地を追加して細胞を洗浄します。細胞単層の破壊を避けるために、培地を細胞単層の上に直接追加しないように注意してください。プレートを閉じ、手動で静かに揺らします。培地を吸引し、ウェルごとに1ミリリットルの新鮮な培地と交換します。顕微鏡下で無細胞ギャップを可視化し、タイムゼロで画像を取得します。培地をウェルから取り出し、カルシウムとマグネシウムを添加したPBSを加えます。プレートを振ってPBSを取り除き、最後にテストコンパウンドをウェルに加えます。未処理のコントロールサンプルには、1mmの培地が使用されます。プレートをインキュベートします。各サンプルについて、顕微鏡下で細胞移動を4倍の倍率で観察し、15時間、20時間、および24時間のインキュベーション後に画像を取得します。この手順では、タイム ゼロと同じ領域で画像をキャプチャしてみてください。画像をキャプチャする時間間隔の選択は、選択したセルの移動速度によって異なります。実験が終了したら、異なる時間間隔で各サンプルの画像を選択し、zip ファイルを作成します。各時間間隔で、各サンプルに対して少なくとも 3 回の反復を行うことが重要です。自動画像解析Wimasisプログラムを開き、最も低い倍率でzipファイルをアップロードします。プログラムは、選択した時点における細胞被覆領域とスクラッチ領域の実験データを、サンプル1aや2aなどの各単一サンプルの割合でまとめた要約ファイルを電子メールで自動的に提供します。時間 0 におけるすべてのサンプルの平均値を計算します。時間 0 の平均値に対してすべてのデータを正規化します。各時点におけるすべてのサンプルの平均値と相対標準誤差を計算します。二元配置ANOVA検定を使用して、統計分析を実行します。取得したデータは、さまざまなサンプルグループのさまざまな時点でのセル被覆面積の割合を示すヒストグラムとしてグラフにプロットできます。これらのヒストグラムは、コントロールと比較して、抗ミクロペプチドエスキュレンチン1-21-1cまたはエスキュレンチン1-21の異なる濃度で気管支細胞を15時間、20時間、および24時間治療した後に得られた創傷閉鎖を示しています。ヒストグラムおよびいくつかの代表的な顕微鏡写真によって指摘されるように、エスキュレンチン1-21-1cは、1マイクロモルで約20時間以内に創傷野のほぼ完全な閉鎖で誘導される気管支細胞における疑似創傷の再上皮化を促進するのにより効率的であるが、一方、エスキュレンチン1-21、すなわち10マイクロモルにはより高い濃度が必要である。上皮成長因子受容体などの一部の受容体が細胞遊走に果たす役割を研究するには、AG1478という化合物などの特異的阻害剤で細胞単層を前処理します。この目的のために、インサートを取り外す前に、各コンパートメント内の媒体を吸引し、一度洗浄し、5マイクロモルAG1478を補充した70マイクロリットルの培地を追加します。プレートを30分間インキュベートします。次に、ピンセットでインサートを取り外し、前述のように進めます。これらは、ペプチドによって誘発される細胞遊走が上皮成長因子受容体の活性化に関与していることを示す最終的なデータです。実際、インヒビターAG1478による前処理後、ペプチドを添加する前に細胞をAG1478と事前にインキュベートしなかった場合の結果と比較して、細胞被覆面積の割合は、すべての時間間隔で有意に減少します。結論として、記載された方法は、異なる種類の細胞の遊走特徴、ならびに最も有望な創傷治癒促進剤および/または阻害剤の選択に関する理解を、短時間かつ高精度で大幅に改善する高い可能性を有する。

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Research

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インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

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インビトロ ヒアルロン酸に富む細胞外マトリックスが神経堤細胞遊走に及ぼす影響の検討

学ぼう、気管支上皮細胞の移動を評価する新規in vitro傷治癒アッセイ法。シリコンインサートを用いた擬似創傷作成と自動画像解析により、免疫調節ペプチドの効果を定量的に測定し、創傷治癒メカニズムの解明に貢献します。

新規In Vitro細胞移動を評価する癒しのアッセイを傷

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