Name: 慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶラット後肢の慢性収縮活動モデルを用いた骨格筋の表現型適応の観察法。7日間の短期間でミトコンドリア生合成やオートファジーなどの運動関連細胞適応を研究でき、加齢関連筋萎縮の治療応用にもつながる。

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原稿の彼の専門の読書のリアム フォートタイロンに感謝しております。この作品は、D. A. フードに自然科学と工学研究審議会のカナダ (レベル) からの資金によって支えられました。D. また、A. フード、細胞生理学のカナダの研究の椅子の保持者です。

すべての動物関連のプロシージャはレビューされ、ニューヨーク大学動物ケア委員会によって承認されました。ヨーク大学の動物実験施設に到着すると、すべてのラットは食品提供広告自由で、手術前に自分の環境に順応する 5 日間の最小値を与えられました。他種15,17,22にこのプロトコルが以前適用されている現在の紙 Pette と同僚の23の先駆的な仕事の上に構築、特にラット モデルに焦点を当ています。
1. 慢性収縮活動ユニットの準備
<ol><li>電圧計を使用して、コイン リチウム電池の可能性を確認してください。 注: 各電池の可能性は、3.0 ± 0.10 V をする必要があります。</li>
	<li>合計可能性が 6-9 V、ユニットのスロットに 2 つまたは 3 つの電池を挿入します。 注: この実験中 (6 または 9 V) 維持するためにどのように多くの潜在性を考慮する研究者の裁量次第です。研究デザイン、刺激の目的の強度に応じて 2 または 3 電池を使用できます。</li>
	<li>ユニットがきちんと働いているパルス指標経由ポータブル赤外線ストロボの光によって放射される 1 のパルス ユニットを公開することによってを確認します。</li>
</ol>2. 慢性の収縮活動の手術
注: は、手術前にすべての手術器具を滅菌します。中および手術後すぐに、ラットの体温は、加熱パッドによって維持されます。手術用覆布に手術の手順を実行することをお勧めします。外科医は、滅菌手術用手袋として清潔な白衣を着用ください。必要な場合は、使い捨ての防毒マスクを着用することをお勧めします。
<ol><li>麻酔ラット 1 3% 未満イソフルラン吸入酸素は、ガスの気化器システムが運営しております。後肢のつま先ピンチをチェックすることによって、呼吸の深さそして率を観察することによって、動物が鎮静完全に確認してください。乾燥を避けるために目に眼の潤滑剤を適用します。メロキシカム (0.5 mg/mL) の 2 mg/kg の皮下注射を適用します。 注: またお勧め中や手術後の痛みを最小限に抑えるため鎮痛 (例えば、メロキシカム プラス リドカイン) のマルチ モーダル アプリケーションを持っています。</li>
	<li>優しく剃る、首の後ろから胴体周りのストリップと同様、左後肢周りの後ろに前肢の前胸部全体。ヨードとアルコール消毒する剃毛エリアを軽く拭きます。</li>
	<li>動物の胃の上に敷設、剃毛地域 (肩甲骨の間明白な領域) の中央に首の後ろに小さな切開 (~0.5 cm) を作るメス (第 10 刃) を使用します。</li>
	<li>一般的な腓骨神経を探します。<ol>
<li>その右側に動物をロールし、2 〜 3 cm-長い左後肢の皮膚にカットします。膝関節のディンプルと尾の原点の近くに戻ると landmarked が大腿筋群周囲切開領域をターゲットします。 注: 本体の位置を変更するとき最初の切開領域を汚さないように気をつけてください。</li>
		<li>外科はさみを湾曲した鈍い先端を使用して、皮下のエリアを広く分析 ~3.5 - 4 cm、開いた肌と基になる筋肉の間のポケットを作るために基になる筋肉から皮膚を分離します。全周切開 (~1.5 cm2) の基になる組織から皮膚を開きます。</li>
		<li>外科はさみ、はさみの先端が筋肉を介して直接ダウン切っている確保と大腿二頭筋筋小切開 (0.5 cm 未満) を作る。</li>
		<li>内部の筋肉と、総腓骨神経が表示されるまで優しくカット領域を開く (外部の筋肉組織 (すなわち、大腿二頭筋) の深さの ~0.5 cm あたりです)。鉗子を使用して、優しくタッチ/目に見える神経とピンチ ターゲット筋群 (例えばTA 筋) とつま先 (目に見える屈)、総腓骨神経が分離されたことを確認するための応答を観察します。 注: この手順は、切断または神経の損傷を避けるために細心の注意されるべきであります。</li>
		<li>ウィンドウのサイズがウィンドウの中央に横たわっている腓骨神経と ~1.5 cm2金属リトラクターで開く引いてウィンドウを修正します。ストラップやテーブルの表面 (または手術ボード) に留まり、ゴムバンドに接続されている小さな金属製のフックを使用して (図 2 a)。</li>
	</ol></li>
	<li>神経の両側にワイヤーを取り付けます。<ol>
<li>ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) の 50 〜 60 cm を準備-ステンレス鋼細線をコーティングし、半分に折る。 注: 手術前に紫外線の下で PTFA めっきなしワイヤを公開すると便利場合があります。</li>
		<li>30 cm ステンレス鋼棒のスリットにワイヤーの折れ曲がった部分をフックします。足と背中の中心に沿って L 字型パターンで一緒に、首の後ろの小さな切開領域に向かって後肢のオープン ポケットから皮下、ワイヤー、ロッドを渡します。</li>
		<li>後肢でワイヤの 2 つの端を見つけます。すべてのワイヤ PTFE 絶縁電線をストリップします。~1.5 cm ワイヤーの両端を取り除くメスを使用して、慎重に。ワイヤーは擦り切れた様になって、それらをカットし、再ストリップします。(5 回)、鈍化 21 G 針の周り裸ワイヤの両端をラップ コイルを作るします。コイルが正しく行われると、そこから針をリリースします。</li>
		<li>サイズ 6-0 外科シルクを使用して、それぞれ、総腓骨神経 (図 2 a) のどちら側にコイルの固定します。<ol>
<li>コイルの非常に端に結び目を作るし、左側にある神経の縫合します。コイルが、神経から 1.5 〜 2.5 mm であることを確認します。</li>
			<li>コイルを固定するには、コイルに沿って 2 つまたは 3 つの追加縫合を適用します。</li>
			<li>神経の右側にこれらの手順を繰り返します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>抗生物質溶液 (生理食塩水でアンピシリン; 132 mg/mL) の 2 〜 3 滴を適用し、サイズ 5-0 絹糸を使用してウィンドウ (つまり、大腿二頭筋筋肉組織) を慎重に縫合します。</li>
	</ol></li>
	<li>(約人差し指の直径) 線・ (ヒップ) 上記約大腿二頭筋筋肉の切開部を縫合上皮下ポケットにプッシュの残りの余裕が緩く風します。</li>
	<li>抗生物質溶液再び (生理食塩水でアンピシリン; 132 mg/mL) 2 〜 3 滴を適用します。ホチキス止めして開かれた皮膚を閉じます。</li>
	<li>(首の切開部から出てくる) ワイヤーを CCA 刺激装置に接続します。<ol>
<li>ワイヤーとピンのソケットに接続します。<ol>
<li>切開 2 ワイヤー エンド (腓骨神経のいずれかの側に縫合コイルにこれらの鉛) を作成する首の上部に出てくるワイヤー ループをカットします。</li>
			<li>メスで ~0.5 cm カット擦り切れているワイヤーをワイヤーの端を離れてストリップを使用してください。</li>
			<li>ゆっくりピン ソケットの穴にワイヤの裸の部分を押すし、ピンのソケットの電線をはんだ付け、はんだごてを使用して。</li>
		</ol>
</li>
		<li>必要に応じて、線の接続を確認します。<ol>
<li>ワニ口クリップを介して大規模なベンチトップ型刺激装置ユニットにピンを接続します。</li>
			<li>単一のパルス 9 V (0.1 ms、10 Hz) TA 筋契約および左の足の dorsiflexes を確認するを提供します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>〜 4 cm × 4 cm は、滅菌ガーゼのパッドを介してピン接続ワイヤの両端を渡します。</li>
		<li>ピンを CCA の刺激装置に接続します。<ol>
<li>刺激装置ボックスのベースの穴に通してワイヤーを渡します。 注: このボックスは、CCA の刺激装置の自家製チャンバーは 3.5 cm × 3.5 cm × 2.5 cm13。</li>
			<li>CCA ユニットの接続ソケットにピンを挿入します。CCA ユニットを商工会議所にそっと入れます。粘着タックを使用して、チャンバーの下部に CCA ユニットに固定します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>アスレチック テープまたは多孔質のサージカル テープを使用して、坊主の胴体周りのテープでチャンバーを固定します。テーピングの 3 つの層の部屋の上部を閉じます、ボックス (図 2 b) をセキュリティで保護する刺激装置ボックスの側面にテープをラップすることによって完了します。</li>
	</ol></li>
	<li>CCA が赤外光の単一パルス ユニットを公開することによって動作しているを確認 (波長スペクトル > 770 nm) ポータブル赤外線ストロボの光から放出します。 注: CCA が正しく動作している場合、研究者が後肢筋 (すなわちTA) の近赤外光応答の契約先を見ることができるします。</li>
	<li>ラットを観察し、それは完全に意識を取り戻したまでその温度を監視します。他の動物からの害を防ぐために単一乗員ケージの家および刺激装置の損傷や動物への損傷のリスクを軽減する研究の残りの部分の檻の中、トンネル、またはプラスチック製のオブジェクトを放置しないでください。アモキシシリン含まれて水ボトル (0.5 mg/mL) を提供します。</li>
	<li>次の手術は、少なくとも 72 時間続くすべての 24 h 皮下メロキシカムの 1 mg/kg の投与量を適用します。</li>
</ol>3. 慢性の収縮活動
<ol><li>手術後切開と縫合周辺で/骨格筋の完全復旧のため、少なくとも 5-7 日を許可します。 注: 中と CCA の手順後、(例えば、食べて、飲んで、や移動) 彼らの行動を観察することによってそれぞれの動物の状態を徹底的にチェックします。さらに、CCA の手順の前後に体重の変化をチェックすることによって、重度のストレスや有害効果を決定します。</li>
	<li>赤外光の単一パルス刺激装置ユニットを公開することによって CCA をオンに CCA 刺激の日 (波長範囲 > 770 nm) ポータブル赤外線ストロボの光で。</li>
	<li>10 Hz CCA 刺激の 3 または 6 h を適用します。 注: 刺激のための時間枠は、研究者までです。これらの実験で刺激の周波数は変更されて決して、私たちの経験では、6 h/日に 3 からの刺激を拡張することによってミトコンドリアの適応にのみ非常に控えめな拡張が観察されています。30-60 分毎、刺激と動物を確認可能であれば。</li>
	<li>目的 CCA 期間が過ぎると、赤外光照射 (ユニットの電源を入れると同じプロシージャ) を介して CCA ユニットの電源を切ります。</li>
	<li>複数の日を適用する場合は、3.2 の手順を繰り返します。3.4 を.</li>
	<li>組織の採取のタイミングを決定します。たとえば、cca (すなわち、6 h の最後の CCA 刺激後 18 h)、CCA の手術の手順の間に実行される、麻酔下で行われる最後の試合の発症後 24 時間の組織を収集します。すべての組織を収集、直後後、中動物は麻酔に心臓を切除動物を安楽死します。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

運動、低周波筋刺激を通じて生体内の慢性的な収縮活動 (CCA) モデルは13,24,25を行使する筋肉表現型適応を研究するためのエクセレント モデル,26. 以前研究20,27に示すように、CCA は、研究者がトレーニング ボリュームと周波数 (すなわち時間、日) を制御し、様々 な生化学的、分子を調査の効果的なツール度重なる収縮活動のコース上イベント。このモデルの最高の機能の 1 つは動物間のばらつきを最小限に抑えの内部統制として対側後肢の筋肉を使用することです。また、10 年以上、多数の実験によると外部 CCA ユニットが動物の普通の行動パターン (例えば、ローミング、食べ、そして眠る) は制限されませんし、こ...

骨格筋は、その生体エネルギーと物理構造1の変化を通じてトレーニングに適応できます。持久性トレーニングによってもたらされる主な変更の 1 つはミトコンドリア生合成、ミトコンドリア コンポーネント (例えばチトクローム c 酸化酵素 [シクロオキシゲナーゼ] サブユニット) 発現の増加によって評価することができますの式転写コアクチベーター、pgc-1 α2。研究の増加は、ミトコンドリア代謝と mitophagy を含む、他の多くの要因は筋肉の適応の重要なも示されています。ただし、急性または慢性的な運動によって機構がこれらを調節する骨格筋内のプロセスはまだ明確ではないです。
運動誘発性筋適応を規制する経路を記述するには、様々 な運動モデルはトレッドミル、ホイールを実行して、水泳運動を含む、齧歯類での試験でよく使用されています。ただし、これらのプロトコルは 4 〜 12 週間はこれらの表現型の変化3,4、5の観察に必要な制約があります。実験方法として低周波刺激誘発性慢性収縮活動 (CCA) 効果的として使用されている、それは大幅に短い期間で筋肉の適応をもたらす (すなわち、 7 日前まで) その効果と匹敵する、または他の運動のプロトコルよりもあります。さらに、ホルモン6温度7、および神経学的な効果8の存在は、慢性運動に対する筋特異応答を理解することは困難することができるのです。たとえば、甲状腺ホルモン9,10インスリン様成長因子 (IGF)-111は、トレーニングによる筋肉の適応、また骨格その他のシグナル伝達経路を調節することがありますを仲介に同定されています。筋肉。特に、CCA 誘発効果は、全身的要因、骨格筋の収縮活性への直接反応に配置するフォーカスを許可によって規制されて最小限。
CCA の外部ユニットはタイラーとライト12、初し、変更12で開発されています。一言で言えば、単位は 3 つの主要部分から成る: パルス インジケーター (図 1)、パルス発生器、赤外光への暴露によってオン/オフにすることができます赤外線検出器。刺激装置の詳細な回路設計がされている13で説明しました。CCA の詳細と特定の機能は、大きい数のレビューの深さの記事14,15,16,17。低周波で、総腓骨神経をアクティブにする刺激プロトコルを設計する簡単に言えば、(すなわち、 10 Hz)、神経筋肉 (前脛骨筋前部 [TA] および [EDL] 長趾伸筋) が契約を締結させると、所定の時間 (例えば、3 〜 6 時間) の長さ。時間をかけて、これは毛細血管密度18とミトコンドリア コンテンツ19,20,21の増加によって示されるより好気性表現型に前述の筋肉をシフトします。したがって、このメソッドは、いくつかのラット骨格筋内の主要な持久力トレーニング適応を模倣する実績のあるモデルです。
研究者は、彼らの運動の研究で、このモデルを適用できますので、CCA を誘発する電極注入手術の詳細な手順について述べる。CCA は、したがって運動トレーニングの開始に続く両方の序盤とそれ以降の時間ポイントで様々 な分子とシグナル伝達イベントの調査のための効果的なツールを提供する筋適応の時間的経過を研究するための優れたモデルです。

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Charles River</td><td>Strain 400</td><td></td></tr><tr><td>Chronic contractile Activity Unit</td><td>Home-made</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CCA unit 保護ボックス (3.5 x 3.5 x 2.5 cm)</td><td>Home-made</td><td>n/a</td><td>Box be made of opaque material or covered in a opague</td></tr> tape <tr><td>コインリチウムイオン電池 (3V)</td><td>Panasonic</td><td>CR2016</td><td></td></tr><tr><td>Medwire</td><td>LeicoIndustries</td><td>316SS7/44T</td><td></td></tr><tr><td>はんだピン(ソケット)</td><td>Digi-Key</td><td>ED6218-ND</td><td></td></tr><tr><td>Zonas 多孔質テープ</td><td>Johnson &ジョンソン</td><td>5104</td><td></td></tr>縫<tr><td>合糸シルク(サイズ5)</td><td>エチコン</td><td>640G</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸シルク(サイズ6)</td><td>エチコン</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>湾曲鈍ハサミ(長さ11.5cm)</td><td>F.S.T.</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>湾曲鈍ハサミ(長さ15cm)</td><td>F.S.T.</td><td>14111-15</td><td></td></tr><tr><td>繊細な止血鉗子(長さ16cm)</td><td>ロートン</td><td>06-0230</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>フェ</td><td>ザー3</td><td></td></tr><tr><td>湾曲鉗子</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製ロッド (30 cm; 直径 7mm )</td> <td>自家製</td><td>n/a</td><td>ロッドは、スキンの下にトンネルを掘るためのワイヤーを保持するために、一端に 5 mm のスリットが必要です</td></tr><tr><td>鉗子を適用するクリップ</td><td>KLS マーティン</td><td>20-916-12</td><td></td></tr><tr><td>ステープルズ (クリップ)</td> <td>Bbraun</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>メタル フック/リトラクター</td><td>自家製</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ポビドン ヨード (500 mL)</td><td>Rougier</td> <td>#NPN00172944</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム</td><td>Novopharm</td> <td>#DIN00872644</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer</td> <td>#DIN02240463</td><td></td></tr><tr><td>デジタルマルチメーター(電圧計)</td><td>Soar Corporation</td><td>ME-501</td><td></td></tr><tr><td>LEDデジタルストロボスコープ</td><td>Lutron Electronic</td><td>Enterprise DT-2269</td><td></td></tr></tbody></table>

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

骨格筋は、その生化学的・生理学的特性が大幅に慢性運動に応えて変更適応性の高い組織です。筋肉の様々 な適応をもたらすメカニズムを調べるためには、トレッドミル、ホイール ランニング、水泳など運動プロトコルの数は、動物実験で使用されています。ただし、これら運動のモデル特定の筋肉収縮による適応の研究に応用が少なくて、体液や神経の要因によっても規制が筋の適応を達成するために時間の長い期間を必要とします。それは正常に全身的要因から独立して、7 日以内、筋肉ミトコンドリア適応につながる可能性としての慢性的な収縮活動 (CCA) を誘発する間接低周波刺激 (10 Hz) は運動トレーニングのための代替モデルとして使用されています。広範なアプリケーションを将来的に研究、ラットの骨格筋に CCA の治療を適用する必要な手術手技の詳細を説明します。

我々 は、慢性的な収縮活動 (CCA) が骨格筋内有利なミトコンドリアの適応を誘発する効果的なツールであることを示しています。CCA (6 h/日) の 7 日間を受けるラットは、非刺激対側 (コントロール) 後肢と比べて刺激を受けた筋肉のミトコンドリア生合成を拡張を表示します。ミトコンドリア生合成の増加が他のキーのミトコンドリア蛋白質コックスの標高とともに、ミトコンドリア生合成のマスター調節因子を考慮 PGC-1 α (図 3 a) の増加蛋白質の表現によって示される-I とコックス-IV電子輸送鎖の重要なコンポーネントであります。また、シトクロム c 酸化酵素 (COX) 酵素活性、ミトコンドリア コンテンツの有用な指標は CCA (図 3 b) の 7 日間、次の約 30% を増加しました。また、ミトコンドリア呼吸能力を測定し、CCA (すなわち状態 3) 呼吸の最大の増加をもたらしたことを発見するグリセリン筋線維を使用してミトコ...

このプロトコルでは、ラット後肢筋の刺激による骨格筋適応を観察する運動の慢性収縮活動モデルの使用について説明します。

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

運動の慢性収縮性活動モデルは、in vivoでの運動トレーニング刺激に対する骨格筋の適応を研究するのに役立ちます。特に、このモデルは、6週間のトレーニングプロトコルの表現型適応を7日以内に引き出します。この方法は、ミトコンドリアの生合成、オートファジー、その他多くの運動に関連する細胞適応など、筋肉生理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、数か月を必要とする他の運動トレーニングプロトコルと比較して、7日間の短い時間コースで筋肉特異的な適応を観察できることです。この技術の意味は、慢性的な筋肉刺激が加齢に伴う筋力低下の改善に効果があることが示されているため、筋萎縮年齢の治療にまで及びます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、一般的な腓骨神経をランドマーク化し、両端に電気コイルを取り付けるのが難しいため、苦労するでしょう。まず、酸素を含む1〜3%イソフルラン吸入でラットに麻酔をかけ、後肢のつま先のピンチに対する反応を確認し、呼吸の深さと速度を観察することにより、完全な鎮静を確認します。乾燥を避けるために眼に眼用潤滑剤を塗布し、ラットを低から中程度の設定の加熱パッドに置きます。.左後肢をそっと剃り、首の後ろから胴体の周り、前肢の後ろ、前胸部を横切るストリップを剃ります。削った部分をヨウ素とエチルアルコールでやさしく拭いて消毒します。動物がうつ伏せになっている状態で、10番の刃が付いた滅菌メスを使用して、剃った領域の中央にある首の後ろに約0.5センチメートルの小さな切開を行います。次に、動物を右側に転がし、膝関節のくぼみの間と尾の原点に近い左後肢の皮膚に2〜3センチの切り込みを入れます。先端が鈍く湾曲した手術用ハサミを使用して、皮下領域を約3.5〜4センチメートルに解剖し、皮膚とその下の筋肉を分離して、開いた皮膚とその下の筋肉との間にポケットを作ります。次に、手術用ハサミを使用して、大腿二頭筋の筋肉に0.5センチメートル未満の小さな切開を行い、ハサミの先端が筋肉を直接切り込むようにします。次に、内部の筋肉群と総腓骨神経が見えるまで、切断領域を静かに開きます。神経を切ったり損傷したりしないように細心の注意を払ってください。次に、50〜60センチのPTFEコーティングされた細いステンレス線を用意し、半分に折ります。ワイヤーの折り畳み部分を30センチのステンレス鋼棒のスリットに引っ掛けます。ロッドを使用して、ワイヤーを後肢の開いたポケットに通し、脚を上り、背中の中央に沿ってL字型に通し、首の後ろの小さな切開領域に到達します。窓のサイズが窓の中央に横たわっている状態で窓のサイズが約1.5平方センチメートルになるまで、金属製のリトラクターで窓を引っ張って開きます。メスを使用して、ワイヤーの端を慎重に1.5センチ剥がします。剥がしたワイヤーの端を鈍い21ゲ

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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学ぶラット後肢の慢性収縮活動モデルを用いた骨格筋の表現型適応の観察法。7日間の短期間でミトコンドリア生合成やオートファジーなどの運動関連細胞適応を研究でき、加齢関連筋萎縮の治療応用にもつながる。

慢性的な刺激の収縮活動に伴うラット骨格筋の表現型適応を研究への応用

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