3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

新生RNA-FISHとウイルス潜伏タンパク質のアミノ染色を組み合わせる全体的な目標は、ウイルス転写工場の形成に結合した活性転写を視覚化することです。この方法は、遺伝学、細胞生物学、ウイルス学、および細胞生物学ウイルス学の分野における主要な質問に答えるために使用できます。この技術の主な利点は、誘導性ウイルスミニ染色体モデルを利用して、ゲノム構造変化の背後にある分子の詳細を研究することです。

1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに細胞を採取します。細胞を200ボルトの重力で2分間遠心分離します。1ミリリットルの滅菌DEPC PBSで細胞を3回洗浄します。

次に、細胞を1.2ミリリットルのDEPC PBSに再懸濁します。カバーをスリップさせて6ウェルプレートの底に置きます。セルDEPC PBS混合物の200マイクロリットルを各カバースリップにピペットで移します。

細胞が2分間落ち着いた後、過剰なDEPC PBSを吸引し、細胞の薄い層のみを残します。各カバースリップに1ミリリットルの固定液を慎重に追加します。セルを 10 分間固定します。

カバースリップをDEPC PBSで3回洗います。洗浄後、各カバースリップの最終濃度100ミリモルのグリシンに1ミリリットルのグリシンDEPC PBSを慎重に加えます。細胞を5分間急冷します。

1.5ミリリットルのDEPC PBSを加えてシェーカーに5分間置き、手でしっかりと、しかし穏やかに1分間振とうします。余分なDEPC PBSを吸引し、細胞を乱さないように注意してください。各カバースリップに1ミリリットルの透過化溶液を慎重に加えます。

細胞を15分間透過化させます。1.5ミリリットルのDEPC PBSを追加します。細胞をシェーカーに5分間置き、手でしっかりと、しかし穏やかに1分間振とうします。

余分なDEPC PBSを吸引し、細胞を乱さないように注意してください。顕微鏡スライドにラベルを貼り、ペーパータオルを湿らせてから、密封可能なプラスチック容器の底にタオルを敷きます。次に、一次抗体溶液を調製し、存在する各カバースリップのレシピを掛け

30 μリットルの一次抗体溶液を各標識顕微鏡スライドに置きます。一次抗体の濃度が正しいことを確認するには、カバースリップの角を持ち、軽くはじきます。さらに、ティッシュの角を使用して余分な水分を逃がすことができます。

次に、カバースリップをラベル付きの顕微鏡スライドに置き、気泡が入らないように注意します。容器の外側をラップで覆います。容器を摂氏37度に設定されたインキュベーターに1時間移動します。

インキュベーション中に、必要な試薬を調製します。インキュベーション後、6ウェルプレートでDEPC PBSで細胞を3回、それぞれ5分間洗浄します。次に、細胞をFISH洗浄バッファーで3回、それぞれ5分間洗浄します。

そして、二次抗体であるイントロンプローブ混合物が調製されるまで、カバースリップをFISH洗浄バッファーに保持します。次に、石鹸水とのハイブリダイゼーションのための一次抗体インキュベーションのためにスライドガラスを洗浄します。乾いたら、エタノールと実験用ティッシュできれいにします。

40マイクロリットルの二次抗体と溶液を含むFISHイントロンプローブを各スライドガラスに置きます。セルをスライド上にカバースリップで置き、セル側を下にしてバッファーの上に置きます。そして、気泡が入らないように注意してください。

スライドをプラスチック容器に入れ、底に湿らせたペーパータオルを敷きます。プラスチック容器を最初にラップで包み、次にアルミホイルで包みます。そして、スライドで容器をインキュベートします。

インキュベーション後、カバースリップをスライドガラスの端から慎重にスライドさせ、上を向いて6ウェルプレートに戻します。細胞をFISH洗浄バッファーで6ウェルプレートで3回、それぞれ5分間洗浄します。次に、細胞を2倍SSCで2回洗浄します。

1〜1000濃度のDAPIを2倍重SSCに添加し、溶液を室温で5分間放置します。細胞を2倍SSCで2回洗浄します。ハイブリダイゼーションに使用したスライドガラスを清掃し、10マイクロリットルのマウント溶液をスライドガラスに加えます。

カバースリップを下向きにして取り付けソリューションに置きます。実験用ティッシュペーパーを用いて、細胞が押しつぶされないように注意しながら、余分なマウント溶液を静かに取り除きます。マニキュアを使用して、カバースリップの端に十分な層を塗り、ポリッシュを乾かします。

これで、サンプルを蛍光顕微鏡で観察する準備が整いました。BCBL-1細胞をLANAおよびK-Rta RNAについて染色し、活発に転写するウイルスエピソームがどこにあるか、およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、またはKSHV再活性化刺激に対する応答の不均一性を調べました。ウイルスエピソームの分布と密接に一致する領域での明確なK-Rta蛍光は、KSHVゲノムの近くで活発な転写が行われている証拠です。

同じサンプルでは、LANAと大きく重複しないはるかに弱く拡散したK-Rta蛍光を示す細胞が観察でき、細胞集団内の再活性化刺激に対するかなりの変動と応答の程度を示しています。次に、ウイルスタンパク質の発現を可視化することで、チミジン同期の有効性を検討したところ、同期細胞は非同期集団よりも再活性化刺激に対してより反応することが明確に示されました。DAPI染色はいくつかの機能を果たすことができますが、この例では、1つではなく3つの別々の細胞が存在することを明確に示しています。

この技術と並行して3D顕微鏡検査を行うと、末梢に点在するKSHVゲノムとともに見られるリング状のRNA PII構造が明らかになりました。その開発により、ミニウイルス染色体は、研究者が遺伝子発現の特別な時間的組織と細胞核の退行を探求するためのユニークなツールを提供します。