ゼブラフィッシュ初期胚細胞 (HSPCs) を造血幹・前駆細胞の量的にIn Vitroアッセイの開発

このアッセイの全体的な目標は、発生中のゼブラフィッシュ胚における造血前駆細胞の分化を列挙し、調べることです。この方法は、発生中のゼブラフィッシュの胚に実際にいくつの幹細胞と前駆細胞があるかなど、造血分野におけるいくつかの非常に重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、迅速で、比較的安価で、簡単に実行できることです。

この方法は、発生中のゼブラフィッシュに存在する前駆細胞の数についての洞察を提供するだけでなく、研究者が薬物または遺伝子変異が血液前駆細胞の形成に及ぼす機能的影響を測定することも可能にします。この方法のアイデアは、血液の発達に重要であると仮定した遺伝子をノックダウンしたときに思いつきました。私たちは、このアッセイにより、正常に発生している胚とモルファントである胚の違いを測定できると予測しました。

ゼブラフィッシュの胚を漂白するには、プラスチック容器を使用して3つの洗浄ステーションを作成し、1つはE31リットルあたり5%の漂白剤を1ミリリットル、2つは滅菌E3を含むステーションです。トランスファーピペットを使用して、胚をティーストレーナーに入れ、1番の洗浄ステーションに5分間浸します。次に、胚を入れたティーストレーナーを2番の洗浄ステーションに5分間移します。最後の5分間、3番の洗面所で繰り返します。

最後の洗浄後、清潔な10センチメートルのシャーレで逆さまにしてティーストレーナーから胚を取り出し、トランスファーピペットと滅菌E3を使用して胚をストレーナーから優しく洗い流します。胚を脱角化するには、トランスファーピペットを使用して、ペトリ皿からできるだけ多くのE3を取り出して廃棄します。次に、500マイクロリットルのデコレーションプロデアを胚に加え、室温で5分間インキュベートします。

次に、ペトリ皿の側面を軽くたたいて、チョリオンを完全に取り除きます。次に、血清ピペットを使用して、20ミリリットルの滅菌E3を加えてプロデアを希釈します。胚が落ち着くのを待ち、ピペットを使用してE3を取り出します。この洗浄手順を3回繰り返して、デコレーションプロデアの痕跡をすべて取り除きます。

胚サンプルを調製するには、ピペットを使用して10個の胚を1本の滅菌1.5ミリリットル微量遠心チューブに入れます。次に、E3を慎重にピペットで取り出して廃棄します。サンプルを層流フードに移し、1ミリリットルの滅菌E3を追加して胚を洗浄し、胚がチューブの底に落ち着くようにします。

次に、P1000ピペットを使用して上清を取り除きます。合計3回の洗浄を繰り返します。最後の洗浄後、E3を取り外して廃棄します。

次に、E3に10ミリモルDTTを1ミリリットル加えて、粘液コーティングと、胚の周囲に閉じ込められている可能性のある胞子、酵母、または細菌を取り除きます。次に、微量遠心チューブを水平に置き、室温で25分間インキュベートします。胚を解離するには、1ミリリットルの滅菌DPBSを使用してサンプルを3回洗浄します。

最後の洗浄後、カルシウムとマグネシウムを含む500マイクロリットルのDPBSと、5ミリグラム/ミリグラムの解離プロデアを5マイクロリットル追加します。試料を摂氏37度で、180rpmの水平軌道シェーカーで60分間インキュベートします。次に、サンプルと層流フードを配置し、P1000を使用して、サンプルが完全に解離するまで胚を粉砕します。

注意を払い、胚を定期的にチェックして、いつ解離するかを判断してください。あなたはいくつかの組織が存在する必要があります。胚を過剰に消化すると、前駆細胞が破壊される可能性があります。

解離した10個の胚を、35マイクロメートルのセルストレーナーキャップが付いた5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブの上部リザーバーにピペットで移します。ピペットと滅菌PBSを使用して、胚チューブをすすぎ、ろ過された細胞を含む5ミリリットルのポリスチレンチューブに溶液を移します。チューブ内に4ミリリットルの液体が存在するまで、すすぎを繰り返します。

チューブを重力の300倍、摂氏4度で5分間遠心分離し、均質化された細胞サンプルをパレット化します。ピペットで、底にペレット化された細胞を破壊しないように注意しながら、丸底チューブから上清を取り出して捨てます。次に、100マイクロリットルのPBSを使用して細胞を再懸濁します。

1つのX完全メチルセルロースストック溶液を準備し、3ミリリットルのシリンジと16ゲージの針を使用して、2.5ミリリットルの滅菌丸底14ミリリットルのチューブを追加します。テストする条件ごとに1つのチューブを使用してください。骨髄分化のためには、1%のコイ血清と0.3ミリグラム/ミリグラムの組換えゼブラフィッシュ顆粒球コロニー刺激因子またはGCSFをメチルセルロース培地に加えます。

赤血球の分化には、1%のコイ血清と0.1ミリグラム/ミリグラムの組換えゼブラフィッシュエリスロポエチンまたはEPOをメチルセルロース培地に加えます。多系統の祖先を調べるには、EPOとGCSFを追加します。ピペットを使用して、解離した10個の胚のうち100マイクロリットルを、調製したメチルセルロースの表面に、コイ血清中の組換えサイトカインとともに加えます。

蓋をして静かにボルテックスし、サンプルを完全に均質化します。これで、各チューブには10個の胚の解離組織が含まれているはずです。3ミリリットルの注射器と16本のゲージニードルを使用して、1ミリリットルのサンプルを2つの別々の35ミリメートルのシャーレに分注します。

サンプルがペトリ皿全体に完全に分散していることを確認してください。サンプルごとに繰り返します。細胞とメチルセルロースを入れた35mmのシャーレを15cmのシャーレに入れます。

各大きなプレートに、5ミリリットルの滅菌水を入れた35mmの皿を1つ追加して、サンプルを加湿します。摂氏32度と二酸化炭素5%で皿を7〜10日間インキュベートします。最後に、テキストプロトコルに従ってコロニー形成ユニットを視覚化します。

造血支持因子を用いた培養で7日間を行った後、48匹のHPF胚性ゼブラフィッシュの祖先を数え、画像化しました。重要なのは、使用されるCFの量が、プレーティングされた胚の数と直接相関していることです。1ミリリットルあたり4個または8個の胚をプレーティングすると、これは実験の開始時に10個または20個の胚から開始することと相関し、それぞれ約1200または2400CFUが得られます。

一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば2時間半で完了します。この手順を試みるときは、胚を過剰に消化しないように注意することが重要です。これは前駆細胞を破壊するためです。この手順では、異なる時点で存在する前駆細胞の数を比較できます。

突然変異動物と野生型動物を比較したり、血液発生に対する薬物の影響をテストしたりできます。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの造血前駆細胞を列挙するためのメチルセルロースアッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。この手順は、特定のサイトカインの試験など、特定の実験ニーズに合わせて変更できます。

脊椎動物の血液や針を扱う作業は非常に危険であり、このアッセイを行う際には常に注意する必要があります。