堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築
March 8th, 2018
この記事では、DNA の隔離及び非常に質の悪い DNA の救助を含む標本材料から高スループット シーケンス ライブラリ構築のための詳しいプロトコルを示します。
このプロトコルの全体的な目標は、植物標本から単離された二本鎖DNAとその後のハイスループットシーケンシングライブラリの量を増やし、系統発生研究におけるそれらの有用性を最大化することです。この方法は、広範なサンプル劣化のためにゲノム配列としてのシーケンシングプロジェクトには役立たない植物標本の可能性を解き放ちます。この技術の主な利点は、希少で歴史的に重要な植物標本を大規模な破壊的なサンプリングを必要とせずに使用できるほど堅牢であることです。
この手法は、体系的な間隔を空けたプロジェクトにおける分類群サンプリングの深さを拡張します。種の獲得は制限的なステップですが、このプロトコルを使用すると、歴史的なコレクションをこれらの研究に簡単に使用できます。液体窒素と30〜50ミリグラムの滅菌砂を加えて、事前に選択した植物標本組織の1センチメートル四方を事前に冷却した乳鉢と乳棒で微粉末に粉砕します。
DNA単離を成功させるには、適切な粉砕が不可欠です。また、サンプルが完全に粉砕されるように注意する必要があります。次に、凍結粉末を2本の2ミリリットルのチューブに加え、チューブ容量の半分以下を満たします。
次に、600マイクロリットルの温かいCTAB溶液を各チューブに加えます。粉末を反転させて渦巻きにして完全に混合します。次に、摂氏65度に維持された水浴でサンプルを1〜1.5時間インキュベー
トします。その間、15分ごとに渦を巻きます。次に、サンプルを室温で5分間10, 000gで遠心分離します。遠心分離後、約500マイクロリットルの上清を新しい標識チューブに移します。
上清に、各曲にRNase Aの1ミリリットルあたり10ミリグラムの4マイクロリットルを追加します。.次に、チューブの内容物を反転またはピペッティングして混合します。37°Cに維持されたヒートブロックまたはウォーターバスでサンプルを15分間インキュベー
トします。チューブが室温になったら、約500マイクロリットルの25:24:1フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール混合物をサンプルに加えます。次に、チューブの内容物を反転させるか、ピペッティングを繰り返して混合します。次に、サンプルを室温で12, 000 gで15分間遠心分離します。
上部水層(約400マイクロリットル)を新しいラベル付きチューブのセットに移します。各チューブの水性層に、約400マイクロリットルの24:1クロロホルム、イソアミルアルコール混合物を追加します。ピペッティングまたは反転を繰り返してサンプルを完全に混合します。
次に、チューブを12, 000 gで5分間遠心分離し、約300マイクロリットルの上部水層を事前に冷却したラベル付きチューブに移します。次に、300マイクロリットルの予め冷却したイソプロパノールと12マイクロリットルの2.5モル酢酸ナトリウムを追加します。次に、チューブをマイナス20°Cで30〜60分間インキュベートします。
インキュベーション後、サンプルを冷凍庫から取り出します。次に、サンプルを室温で12, 000gで15分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットを約300〜500マイクロリットルの70%エタノールで洗浄します。
再び、チューブを12, 000 gで10分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さずに、上清を慎重に取り除きます。次に、ペレットを風乾し、DNAを50マイクロリットルの1X Tris-EDTAバッファーに溶解します。
0.2ミリリットルのポリメラーゼ連鎖反応チューブに、1〜16マイクロリットルの単離DNAと2マイクロリットルの断片化反応バッファーを添加します。最終容量をヌクレアーゼフリーの水で18マイクロリットルに調整します。次に、2マイクロリットルの二本鎖DNA断片化酵素を加え、混合物を木の数秒間短時間ボルテックスします。
次に、サンプルを摂氏37度でサーモサイクラーで8.5分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブに5マイクロリットルの0.5モルEDTAを追加します。25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えて、せん断されたDNAの総量を50マイクロリットルに調整します。
次に、室温で維持された45マイクロリットルのSPRIビーズを50マイクロリットルのせん断DNAに加え、ピペッティングで上下させて2つを完全に混合します。チューブを含むサンプルを5分間放置します。次に、チューブを磁気プレートに移し、さらに5分間待ちます。
上清を慎重に排出します。次に、磁気スタンドのチューブに200マイクロリットルの新鮮な80%エタノールを追加し、室温でさらに30秒待ちます。30秒後、上清を慎重に取り除きます。
チューブの蓋を開けたままにして、磁気スタンドでビーズを5分間風乾します。次に、マグネットスタンドからチューブを取り外し、55マイクロリットルの0.1X Tris-EDTAバッファーでビーズからDNAを溶出します。ピペッティングを繰り返してDNAを十分に混合します。
次に、サンプルを室温で5分間インキュベートします。再度、チューブを磁気スタンドに置き、約2分で溶液が透明になるのを待ちます。上清を52マイクロリットル除去し、テキストプロトコルに概説されているようにDNA定量分析を行います。
洗浄および剪断したDNA50マイクロリットルに、エンドヌクレアーゼ3マイクロリットル、リン酸テーリング酵素、および反応緩衝液7マイクロリットルを添加します。DNAと他の成分をピペッティングで上下させて完全に混合します。次に、チューブを回転させて気泡を取り除きます。
紡糸後、サンプルをサーモサイクラーに移し、プログラムを設定します。アダプターを25〜50倍に希釈して、0.6〜0.3マイクロモルの作業濃度を達成します。ハイスループットのショートリードシーケンシングを行うには、30 マイクロリットルのライゲーションマスターミックス、1 マイクロリットルのライゲーションエンハンサー、2.5 マイクロリットルのアダプターをチューブに加えます。
チューブの内容物をピペッティングで上下させて完全に混合します。再度、チューブを回転させて気泡を取り除きます。次に、チューブを摂氏20度で15分間インキュベートします。
ウラシル-DNAグリコシラーゼとDNAグリコシラーゼリアーゼエンドヌクレアーゼVIIIの市販混合物を3マイクロリットルチューブに加えます。総容量を96.5マイクロリットルに調整します。成分を十分に混合し、サーモサイクラーで摂氏37度で15分間インキュベートします。
チューブ内で、洗浄したアダプターライゲーションされたDNAにすべての試薬を添加することにより、ポリメラーゼ連鎖反応ミックスを調製します。次に、ボルテックスによって反応をよく混合します。渦が終わったら、サンプルをサーモサイクラーに入れ、サーモサイクラーの増幅設定を開始します。
室温で保たれた約25マイクロリットルの磁気ビーズをサンプルに加え、ピペッティングを繰り返して混合します。サンプルを5分間インキュベートします。次に、チューブを磁気スタンドに移し、さらに5分間待ちます。
5分後、上清を新しいラベル付きチューブのセットに移します。次に、上清に室温で保たれた6マイクロリットルのSPRIビーズを加え、十分に混合します。サンプルを5分間インキュベートした後、チューブを磁気プレートに移し、さらに5分間待ちます。
上清を取り除き、廃棄します。次に、マグネティックスタンドのチューブに200マイクロリットルの新鮮な80%エタノールを追加します。次に、チューブを室温で30秒間インキュベートします。
30秒後、上清を慎重に取り除き、チューブの蓋を開けたまま、磁気スタンドに置いたままビーズを5分間風乾します。次に、磁石からチューブを取り外します。ビーズからターゲットDNAを33マイクロリットルの0.1X Tris-EDTAバッファーに溶出し、十分に混合します。
適切に混合した後、室温で5分間インキュベートします。次に、チューブを磁気スタンドに移し、溶液が透明になるまで約2分間待ちます。上清30マイクロリットルを2ミリリットルのチューブにピペットで保存します。
植物標本DNAの単離を示すために、異なる植物標本から単離された二本鎖DNAを用いてアガロースゲルを走査した。10ミリグラムの葉組織を用いて、単離された二本鎖DNAの約3.56〜2,610ナノグラムをアガロースゲルにロードした。ゲルは、すべてのレーンに劣化した植物標本DNAを塗抹標本の形で示しています。
次に、10個の植物標本から単離されたDNAから高品質のシーケンシングライブラリの回収を示すために、アガロースゲルを泳動しました。アガロースゲルにロードする前に、単離された植物標本DNAの約1.26〜464ナノグラムを酵素的剪断にかけ、90%のビーズ量でクリーンアップしました。アガロースゲルは、10の植物標本のDNAから高品質のシーケンシングライブラリの回収を示しています。
最終的なシーケンシングライブラリは、300〜500塩基対のプライマリバンドを示しています。次に、植物標本由来DNAのショットガン配列を示すために、TK 686葉緑体ゲノムの円形プロットを得た。この配列は、DNAの全長、逆リピート領域、および大小のシングルコピー領域の存在を示しています。
この手法を習得すると、24のサンプルを13時間未満で実行でき、アクティブなハンズオン時間は約8時間しかありません。この手順の後、得られたライブラリに対してシーケンスキャプチャなどの他の方法を実行して、系統発生研究用の核データを生成できます。
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概要
この記事は、標本館の材料からDNA分離と高スループットのシーケンシングライブラリ構築の詳細なプロトコルを示しています。この方法は、系統発生学的研究における劣化した標本館標本の有用性を向上させます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- ゲノミクス
- 系統発生学
- 植物学研究
背景
- 標本館標本には劣化したDNAが含まれていることがよくあります。
- 従来の方法はこれらのサンプルに適していない場合があります。
- 高スループットのシーケンシングは、改良されたDNA分離技術から恩恵を受けることができます。
- このプロトコルは歴史的なコレクションを効果的に活用することを目指しています。
研究の目的
- 分離された二重鎖DNAの量を増やす。
- 標本館標本から高スループットのシーケンシングライブラリを構築する。
- ゲノム研究における劣化サンプルの有用性を最大化する。
使用された方法
- 液体窒素と滅菌済みの砂を加えて標本館組織を粉砕します。
- サンプル準備のために予め冷やした研削棒と研削鉢を使用します。
- DNA分離の詳細なプロトコルに従います。
- 高スループット分析に適したシーケンシングライブラリを構築します。
主要な結果
- 歴史的に重要な標本からのDNAの成功的な分離。
- 劣化サンプルに対するプロトコルの堅牢性の実証。
- 系統発生学的研究における分類群サンプリングの拡大。
- 歴史的なコレクションのゲノム研究への包含を促進。
結論
- このプロトコルは、シーケンシングプロジェクトにおける標本館標本の使用の実現可能性を向上させます。
- それは系統発生学的研究のための新しい道を開きます。
- 希少な標本は広範な破壊的なサンプリングなしで活用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Unlocking robust DNA isolation and high-throughput sequencing from herbarium specimens addresses a critical bottleneck in plant genomics and phylogenetic discovery. This protocol enables the inclusion of rare, degraded, or irreplaceable samples in large-scale sequencing projects, expanding taxonomic breadth and reducing destructive sampling. The approach supports scalable, reproducible workflows essential for enterprise-level R&D and portfolio expansion in plant biotechnology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of genetic diversity from historical and rare plant specimens.
- Supports functional validation of phylogenetic targets using previously inaccessible material.
- Facilitates predictive confidence in lineage assignment and evolutionary studies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated DNA libraries suitable for high-throughput sequencing platforms.
- Standardizes sample processing across diverse, low-quality plant materials.
- Delivers reproducible, quantitative DNA yields for downstream comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Enables continuity from discovery genomics to translational phylogenetic applications.
- Supports risk-adjusted advancement of plant-derived targets for further study.
- Provides a foundation for biomarker discovery in plant systematics when applicable.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of sample acquisition and sequencing library preparation, bridging early discovery with downstream genomic analysis.
- Discovery Biology: Expands hypothesis testing to include rare and degraded specimens, increasing biological de-risking.
- Screening: Delivers assay-ready DNA libraries with consistent fragment sizes and yields.
- Analytics: Provides quantitative DNA and library quality metrics for cross-sample comparison.
- Translational Research: Maintains continuity for phylogenetic and evolutionary studies using historical samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable workflow for diverse plant lineages and future projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in plant target validation.
- Operational Value: Standardizes DNA isolation and library construction for high-throughput scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for rare sample utilization and portfolio expansion.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of plant targets and maximizes use of historical collections.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant molecular biology and sequencing library preparation.
- Needs access to standard molecular biology instrumentation and high-throughput sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across diverse sample types.
- May require adaptation for plant lineages with extreme DNA degradation or inhibitory metabolites.
- Limited by DNA fragment size distribution and presence of secondary metabolites in some specimens.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
DNA Extraction
4:39
DNA Shearing
5:28
Bead Clean-up
7:06
Library Preparation
7:40
Adaptor Ligation
8:46
PCR Amplification
9:12
Size Selection for Desired Library Size and Quality Control
11:04
Results: Isolation and High-throughput Sequencing of Poor Quality DNA Isolated from Various Herbarium Species
12:33
Conclusion
