Name: 堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: 学ぶ 標本からのDNA抽出とシーケンスライブラリー構築法。液状窒素と滅菌砂を用いた粉砕処理により、劣化した標本からも高品質なDNAを分離し、系統ゲノミクス研究への応用を可能にします。

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破壊的なサンプリングの標本へのアクセスのためのミズーリの植物園とサンプリング標本、援助のクリスティーナ Zudock ヨルダン Teisher、テイラー AuBuchon-高齢者を感謝いたします。この作品は全米科学財団 (DEB-1457748) からの助成金による支援です。

<ol><li>Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00984634">The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement.</a> Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).</li>
<li>Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bij.12509/abstract">Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico.</a> Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).</li>
<li>Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphyly+of+Arundinoideae+%28Poaceae%29+and+Evolution+of+the+Twisted+Geniculate+Lemma+Awn%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn.</a> Ann Bot. , (2017).</li>
<li>Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10592-006-9209-7">Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris.</a> Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).</li>
<li>Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+the+future%3A+museum+specimens+in+population+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Tre+Eco+%26+Evo%22%5BJournal%5D)">Back to the future: museum specimens in population genetics.</a> Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).</li>
<li>Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006320711002679">How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?</a> Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).</li>
<li>Saltonstall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+invasion+by+a+non-native+genotype+of+the+common+reed%2C+Phragmites+australis%2C+into+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America.</a> PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).</li>
<li>Besnard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+museums+to+genomics%3A+old+herbarium+specimens+shed+light+on+a+C3+to+C4+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition.</a> J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).</li>
<li>Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+open+the+treasure+chest%3F+Optimising+DNA+extraction+from+herbarium+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43808(2012).</li>
<li>Harris, S. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00937835">DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods.</a> Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).</li>
<li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+in+plant+herbarium+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA damage in plant herbarium tissue.</a> PLoS ONE. 6 (12), e28448(2011).</li>
<li>Bakker, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bij.12642/abstract">Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline.</a> Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).</li>
<li>Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-294X.1997.00266.x/full">Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA.</a> Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).</li>
<li>Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequences+from+multiple+amplifications+reveal+artifacts+induced+by+cytosine+deamination+in+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA.</a> Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).</li>
<li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+treasure+troves%3A+Complete+genome+sequencing+of+herbarium+and+insect+museum+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens.</a> PLoS ONE. 8 (7), e69189(2013).</li>
<li>Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/00837792.2017.1313383">Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens.</a> Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).</li>
<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.citeulike.org/user/echinotrix/article/678648">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).</li>
<li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406474">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide.</a> Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).</li>
<li>Twyford, A. D., Ness, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+complete+plastid+genome+seqeuncing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Eco+Resour%22%5BJournal%5D)">Strategies for complete plastid genome seqeuncing.</a> Mol Eco Resour. , (2016).</li>
<li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Bio%22%5BJournal%5D)">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome Bio. 12 (2), R18(2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).</li>
<li>Grigoriev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MycoCosm+portal%3A+gearing+up+for+1000+fungal+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes.</a> Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>McKain, M. R. Herbarium Genomics. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>McKain, M. R., Wilson, M. A. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+rapid+diversification+and+convergent+origins+of+active+pollination+within+Agavoideae+%28Asparagaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae).</a> Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).</li>
<li>McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verdant%3A+automated+annotation%2C+alignment%2C+and+phylogenetic+analysis+of+whole+chloroplast+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes.</a> Bioinf. , (2016).</li>
<li>Staton, S. E., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposome%3A+A+toolkit+for+annotation+of+transposable+element+families+from+unassembled+sequence+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads.</a> Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).</li>
<li>Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repbase+Update%2C+a+database+of+repetitive+elements+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes.</a> Mobile DNA. 6 (1), 11(2015).</li>
<li>McKain, M. R. Transposons. , Github Repository 
 <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017).</li>
<li>Weiß, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterns+of+damage+and+decay+kinetics+of+DNA+retrieved+from+plant+herbarium+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Soc+Open+Sci%22%5BJournal%5D)">Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens.</a> Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239(2016).</li>
<li>Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterns+of+nucleotide+misincorporations+and+DNA+fragmentation+in+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA.</a> PLoS ONE. 7 (3), e34131(2012).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequence+capture+as+a+powerful+tool+for+evolutionary+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis.</a> Am J Bot. 99, 312-319 (2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する利益あるを宣言します。

ここで提示されたプロトコルは、DNA の隔離および植物の乾燥標本からのライブラリの準備をシーケンス処理の包括的かつ堅牢な方法です。メソッドとそれを変更する必要は最小限の一貫性は、それは大規模な標本に基づくシーケンス プロジェクトのスケーラブルな標本の品質確認に基づいています。低降伏点ライブラリのオプション reamplification ステップを含めることは、低品質、低量、珍しい、またはシーケンスに適していないなる歴史的に重要なサンプルの包含をことができます。
初期 DNA の収穫の重要性 標本由来 DNA 劣化初期試料保存11検体の DNA と結果として 300 年以上古い歳31の数千に数百を動物の遺体から分離された DNA として劣化とされて,32します。 その結果、初期 DNA 収量の最適化成功シーケンス ライブラリの準備のため十分な高品質 dsDNA の取得で重要であり...

標本コレクションは、種と系統1,2,3, 集団遺伝学4,5, 保全を含む研究のためのゲノムの多様性の両方の可能性がある貴重な情報源生物学6、外来種生物学7、および形質進化8。種、人口、地理的な場所、タイム ポイントの豊かな多様性を取得する機能は、標本は、「宝箱」9を強調表示します。歴史的に、標本由来 DNA の劣化した自然が多い領域の葉緑体ゲノムや、リボソームの内部転写スペーサー (ITS) などの高いコピー内で見つかったマーカーのみを使用する研究者を追いやって、PCR ベースのプロジェクトを妨げています。RNA。標本と DNA の品質によって異なります広く保全9,10二本鎖切断と損傷の最も一般的な形であること、作成の乾燥工程で使用される熱から断片化の手法、いわゆる 90 %dna ロックアップ PCR ベースの研究11を妨害しています。断片化、別標本のゲノムの第 2 最も一般的な問題は汚染、生菌13から派生する菌類コレクション後、標本12にもマウントする前に死後を取得したようにこの問題は、右真菌データベース (下記参照) を与えられた解決の bioinformatically をすることができます。11押し葉標本の低い (〜 0.03%) と推定されている、3 番目、およびより少なく共通の問題はシトシン脱アミノ化 (C/G→T/A)14日シーケンス変更です。短いリードとシーケンス深さ12,15、低品質の多数の標本から遺伝子レベルのデータ集録が可能高スループット シーケンス (HTS) の出現により、断片化の問題を克服できます。DNA と時々 全ゲノム シーケンス15を許可します。
標本サンプルはより頻繁に使用されるなる、系統のプロジェクト16の大きなコンポーネントです。標本を用いた高温超伝導体の現在の課題が個々 のための方法を最適化することがなく、タイムリーに多くの種から十分な二本鎖 DNA、シーケンス プロトコルは、必要な前提条件を一貫して取得します。標本。本稿では、既存の手段を活用して、高速かつ複製可能な結果を可能にするそれらを変更に DNA の抽出と標本のライブラリの準備のためのプロトコルが示されています。この方法は 13 h、8 h のハンズオン タイム、または 16 h、9 h、ハンズオン時間、オプション reamplification ステップが必要な場合 24 サンプルのライブラリに試験片から処理が完了すること。多くのサンプルの同時処理は、制限要因は遠心力と技術的なスキルが達成可能で。プロトコルは DNA をせん断してだけ典型的な実験装置 (たち、遠心とマグネット スタンド) ネブライザー、超音波発生装置などの特殊な機器ではなくを必要とする設計されています。
DNA の品質、フラグメント サイズと数量は、高スループット シーケンス実験の標本の使用のための要因を制限しています。標本の DNA を分離し、高スループット シーケンス ライブラリを作成する他の方法は 10 として少し使用の有用性を実証している DNA16; ngただし実験的 PCR の最適な数を決定する必要なライブラリの準備のために必要なサイクルです。これは、いくつか標本が単一のライブラリの準備のため十分な DNA のみを生成するよう実行可能なダブルの非常に小さな金額を扱う鎖 DNA (dsDNA)、非現実的ななります。ライブラリの最適化の手順で DNA は失われませんので、ここで紹介した方法は単一サンプルの質に関係なくサイクル数を使用します。代わりに、ライブラリは、シーケンスに必要な最低限の量を満たしていない場合に、reamplification ステップが呼び出されます。多くの植物標本サンプルはまれであり、多くの場合有害なサンプリングを正当化するが難しく少し材料を所有しています。これを対抗するため提案するプロトコルにより、dsDNA 入力サイズを 1.25 未満 ng のライブラリの準備プロセス、高スループット シーケンスと供試体の破壊のサンプリングのための必要性を最小限に抑えるのための実行可能なサンプルの範囲を拡大します。
次のプロトコルを草用に最適化されており、我々 はプロトコルことができます他の多くの植物のグループに適用されることを期待するものの、標本サンプルから別の種の何百ものテストします。低品質または珍しい標本を保存するために使用できる省略可能な回復手順が含まれています。テスト 200 以上の標本を基に、このプロトコルは、最小限の破壊的なサンプリングによって珍しい標本の保存を可能にする低組織入力と品質、標本で動作します。ここでこのプロトコルがゲノミクス ベース プロジェクトのシーケンスことができます高品質ライブラリを提供できることを示す.

<table><tbody><tr><td>Veriti サーマルサイクラー</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 well&nbsp;</td></tr><tr><td>ゲルイメージングシステム</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Series</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis System</td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (Ultra pure water)</td><td>ELGA&nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBindチューブ&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス ジーニー 2</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>モルタル</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>S02591</td><td>磁器</td></tr><tr><td>乳棒</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>S02595</td><td>磁器</td></tr><tr><td>遠心チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック 21-403-161</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td>ケンモア</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit アッセイチューブ</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 用ストリップチューブとキャップ</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 蛍光光度計</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>天びん</td><td>メトラー・トレド</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素 短期保存</td><td>Nalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>マグネティックリングスタンド&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96井戸&nbsp;</td></tr><tr><td>水浴室</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>の熱い版の攪拌機</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>の空気ガス</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 X TEの緩衝液</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>のリボヌクレアーゼA</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/mL 溶液</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>バイオ WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>バイオ WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>バイオ WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>イソアミルアルコール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム三水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE アガロース</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS DNA ラダー</td><td>ゴールド バイオテクノロジー</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA、二ナトリウム塩</td><td>IBI サイエンティフィック</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>量子ビット dsDNA HS アッセイキット</td><td>ライフサイエンス</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td>ultra pure</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Purple (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>フェノール溶液</td><td>SIGMA ライフサイエンス</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td></td><td>VWR EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 プルーフ</td></tr><tr><td>シリカ砂</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>再増幅プライマー</td><td>統合 DNA テクノロジー</td><td>本文</td><td>参照</td></tr><tr><td>シーケンチャーv.5.0.1</td><td>GeneCodes</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

堅牢な dna の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

標本は、さまざまな生物学的研究で使用できる植物材料の非常に貴重な源です。標本の使用はサンプル保存品質、劣化 DNA、珍しい標本の破壊的なサンプリングを含む課題の番号に関連付けられます。効果的に大規模なプロジェクトの標本材料を使用、するために DNA の分離およびライブラリの準備の信頼性と拡張性の高い方法が必要です。本稿は、DNA 分離、高速ライブラリ構築に標本から個々 のサンプルの変更を必要としない堅牢で、始めから終わりまでプロトコルを示します。このプロトコルは、組織研削、ライブラリ サイズ選択を変更して低収量ライブラリのオプション reamplification ステップを導入することを最適化することにより従来の低品質の乾燥植物素材とを利用に合わせて調整します。低収量 DNA ライブラリの reamplification は、かけがえのない、潜在的に貴重な標本、追加破壊サンプリングし、共通認識できるシーケンス バイアスを導入することがなく、必要性を否定することから派生したサンプルを救うことができます。系統のアプリケーション。プロトコル数百草種でテストされていますが確認後他の植物の系統での使用に適応します。このプロトコルは、フラグメントは目的のサイズの範囲では存在しない、非常に低下した DNA ときれいな DNA 分離を抑制する二次代謝産物いくつかの植物材料の存在によって制限することができます。全体的に、このプロトコルは DNA の隔離と最小限の変更でアクティブなハンズオン タイムの 8 時間だけで 13 h 未満の 24 サンプル調製されたライブラリでは、高速かつ包括的な方法を紹介します。

DNA の隔離および最終的なライブラリ収量 本研究では 1920 年からの最も古いと 2012 年 (表 2) から最年少 50 の異なるサンプルを使用して標本の DNA の分離および高品質シーケンス ライブラリの回復用のプロトコルの有効性を示した.各サンプルは、葉の組織の約 10 mg は DNA の隔離に使われました。場合は、環境に優しい葉組織が支持され、明らかなカビ汚染と組織が選択されていません。成功の分離は、収量が低くなるはずに黄色や茶色のティッシュを使用して行うことが。合計二重らせん DNA (dsDNA) 3.56 から最初の分離から 2,610 に ng ng。予想通り、標本から得られた DNA は著しく低い (図 1 a図 1カスタマーインフォメーション センターの障害)。酵素せん断 (1.26-464 ng) の分離の部分が使用さ...

この記事では、DNA の隔離及び非常に質の悪い DNA の救助を含む標本材料から高スループット シーケンス ライブラリ構築のための詳しいプロトコルを示します。

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

このプロトコルの全体的な目標は、植物標本から単離された二本鎖DNAとその後のハイスループットシーケンシングライブラリの量を増やし、系統発生研究におけるそれらの有用性を最大化することです。この方法は、広範なサンプル劣化のためにゲノム配列としてのシーケンシングプロジェクトには役立たない植物標本の可能性を解き放ちます。この技術の主な利点は、希少で歴史的に重要な植物標本を大規模な破壊的なサンプリングを必要とせずに使用できるほど堅牢であることです。この手法は、体系的な間隔を空けたプロジェクトにおける分類群サンプリングの深さを拡張します。種の獲得は制限的なステップですが、このプロトコルを使用すると、歴史的なコレクションをこれらの研究に簡単に使用できます。液体窒素と30〜50ミリグラムの滅菌砂を加えて、事前に選択した植物標本組織の1センチメートル四方を事前に冷却した乳鉢と乳棒で微粉末に粉砕します。DNA単離を成功させるには、適切な粉砕が不可欠です。また、サンプルが完全に粉砕されるように注意する必要があります。次に、凍結粉末を2本の2ミリリットルのチューブに加え、チューブ容量の半分以下を満たします。次に、600マイクロリットルの温かいCTAB溶液を各チューブに加えます。粉末を反転させて渦巻きにして完全に混合します。次に、摂氏65度に維持された水浴でサンプルを1〜1.5時間インキュベートします。その間、15分ごとに渦を巻きます。次に、サンプルを室温で5分間10, 000gで遠心分離します。遠心分離後、約500マイクロリットルの上清を新しい標識チューブに移します。上清に、各曲にRNase Aの1ミリリットルあたり10ミリグラムの4マイクロリットルを追加します。.次に、チューブの内容物を反転またはピペッティングして混合します。37°Cに維持されたヒートブロックまたはウォーターバスでサンプルを15分間インキュベートします。チューブが室温になったら、約500マイクロリットルの25:24:1フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール混合物をサンプルに加えます。次に、チューブの内容物を反転させるか、ピペッティングを繰り返して混合します。次に、サンプルを室温で12, 000 gで15分間遠心分離します。上部水層(約400マイクロリットル)を新しいラベル付きチューブのセットに移します。各チューブの水性層に、約400マイクロリットルの24:1クロロホルム、イソアミルアルコール混合物を追加します。ピペッティングまたは反転を繰り返してサンプルを完全に混合します。次に、チューブを12, 000 gで5分間遠心分離し、約300マイクロリットルの上部水層を事前に冷却したラベル付きチューブに移します。次に、300マイクロリットルの予め冷却したイソプロパノールと12マイクロリットルの2.5モル酢酸ナトリウムを追加します。次に、チューブをマイナス20°Cで30〜60分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを冷凍庫から取り出します。次に、サンプルを室温で12, 000gで15分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットを約300〜500マイクロリットルの70%エタノールで洗浄します。再び、チューブを12, 000 gで10分間遠心分離します。次に、ペレットを乱さずに、上清を慎重に取り除きます。次に、ペレットを風乾し、DNAを50マイクロリットルの1X Tris-EDTAバッファーに溶解します。0.2ミリリットルのポリメラーゼ連鎖反応チューブに、1〜16マイクロリットルの単離DNAと2マイクロリットルの断片化反応バッファーを添加します。最終容量をヌクレアーゼフリーの水で18マイクロリットルに調整します。次に、2マイクロリットルの二本鎖DNA断片化酵素を加え、混合物を木の数秒間短時間ボルテックスします。次に、サンプルを摂氏37度でサーモサイクラーで8.5分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブに5マイクロリットルの0.5モルEDTAを追加します。25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えて、せん断されたDNAの総量を50マイクロリットルに調整します。次に、室温で維持された45マイクロリットルのSPRIビーズを50マイクロリットルのせん断DNAに加え、ピペッティングで上下させて2つを完全に混合します。チューブを含むサンプルを5分間放置します。次に、チューブを磁気プレートに移し、さらに5分間待ちます。上清を慎重に排出します。次に、磁気スタンドのチューブに200マイクロリットルの新鮮な80%エタノールを追加し、室温でさらに30秒待ちます。30秒後、上清を慎重に取り除きます。チューブの蓋を開けたままにして、磁気スタンドでビーズを5分間風乾します。次に、マグネットスタンドからチューブを取り外し、55マイクロリットルの0.1X Tris-EDTAバッファーでビーズからDNAを溶出します。ピペッティングを繰り返してDNAを十分に混合します。次に、サンプルを室温で5分間インキュベートします。再度、チューブを磁気スタンドに置き、約2分で溶液が透明になるのを待ちます。上清を52マイクロリットル除去し、テキストプロトコルに概説されているようにDNA定量分析を行います。洗浄および剪断したDNA50マイクロリットルに、エンドヌクレアーゼ3マイクロリットル、リン酸テーリング酵素、および反応緩衝液7マイクロリットルを添加します。DNAと他の成分をピペッティングで上下させて完全に混合します。次に、チューブを回転させて気泡を取り除きます。紡糸後、サンプルをサーモサイクラーに移し、プログラムを設定します。アダプターを25〜50倍に希釈して、0.6〜0.3マイクロモルの作業濃度を達成します。ハイスループットのショートリードシーケンシングを行うには、30 マイクロリットルのライゲーションマスターミックス、1 マイクロリットルのライゲーションエンハンサー、2.5 マイクロリットルのアダプターをチューブに加えます。チューブの内容物をピペッティングで上下させて完全に混合します。再度、チューブを回転させて気泡を取り除きます。次に、チューブを摂氏20度で15分間インキュベートします。ウラシル-DNAグリコシラーゼとDNAグリコシラーゼリアーゼエンドヌクレアーゼVIIIの市販混合物を3マイクロリットルチューブに加えます。総容量を96.5マイクロリットルに調整します。成分を十分に混合し、サーモサイクラーで摂氏37度で15分間インキュベートします。チューブ内で、洗浄したアダプターライゲーションされたDNAにすべての試薬を添加することにより、ポリメラーゼ連鎖反応ミックスを調製します。次に、ボルテックスによって反応をよく混合します。渦が終わったら、サンプルをサーモサイクラーに入れ、サーモサイクラーの増幅設定を開始します。室温で保たれた約25マイクロリットルの磁気ビーズをサンプルに加え、ピペッティングを繰り返して混合します。サンプルを5分間インキュベートします。次に、チューブを磁気スタンドに移し、さらに5分間待ちます。5分後、上清を新しいラベル付きチューブのセットに移します。次に、上清に室温で保たれた6マイクロリットルのSPRIビーズを加え、十分に混合します。サンプルを5分間インキュベートした後、チューブを磁気プレートに移し、さらに5分間待ちます。上清を取り除き、廃棄します。次に、マグネティックスタンドのチューブに200マイクロリットルの新鮮な80%エタノールを追加します。次に、チューブを室温で30秒間インキュベートします。30秒後、上清を慎重に取り除き、チューブの蓋を開けたまま、磁気スタンドに置いたままビーズを5分間風乾します。次に、磁石からチューブを取り外します。ビーズからターゲットDNAを33マイクロリットルの0.1X Tris-EDTAバッファーに溶出し、十分に混合します。適切に混合した後、室温で5分間インキュベートします。次に、チューブを磁気スタンドに移し、溶液が透明になるまで約2分間待ちます。上清30マイクロリットルを2ミリリットルのチューブにピペットで保存します。植物標本DNAの単離を示すために、異なる植物標本から単離された二本鎖DNAを用いてアガロースゲルを走査した。10ミリグラムの葉組織を用いて、単離された二本鎖DNAの約3.56〜2,610ナノグラムをアガロースゲルにロードした。ゲルは、すべてのレーンに劣化した植物標本DNAを塗抹標本の形で示しています。次に、10個の植物標本から単離されたDNAから高品質のシーケンシングライブラリの回収を示すために、アガロースゲルを泳動しました。アガロースゲルにロードする前に、単離された植物標本DNAの約1.26〜464ナノグラムを酵素的剪断にかけ、90%のビーズ量でクリーンアップしました。アガロースゲルは、10の植物標本のDNAから高品質のシーケンシングライブラリの回収を示しています。最終的なシーケンシングライブラリは、300〜500塩基対のプライマリバンドを示しています。次に、植物標本由来DNAのショットガン配列を示すために、TK 686葉緑体ゲノムの円形プロットを得た。この配列は、DNAの全長、逆リピート領域、および大小のシングルコピー領域の存在を示しています。この手法を習得すると、24のサンプルを13時間未満で実行でき、アクティブなハンズオン時間は約8時間しかありません。この手順の後、得られたライブラリに対してシーケンスキャプチャなどの他の方法を実行して、系統発生研究用の核データを生成できます。

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