代謝のマッピング: 定量的酵素組織化学および組織化学細胞や組織における脱水素酵素の活性を決定するには

このビデオでは、メタボリックマッピングの実行方法を示します。デヒドロゲナーゼと呼ばれる特定の酵素の活性を定量する手順。細胞は顕微鏡スライドまたは凍結組織に接着します。

数十年前、私たちは、顕微鏡下で組織や細胞の活性を検出するために、当時は酵素化学と呼ばれていた一連の代謝マッピング技術を開発しました。しかし、前世紀末の遺伝的革命の間に代謝は時代遅れになりました。しかし今、代謝は再び熱くなっています。

例えば、がん細胞を見てください。この代謝は今や治療標的と考えられており、細胞や組織における活性測定が再び注目されています。反応バッファーの主要成分は、ポリビニルアルコール(PVA)です。

これは18%の濃度でリン酸塩緩衝液に溶解しますPVAは、吸入するとほこりっぽく有毒であるため、ヒュームフードの下でPVAを計量してください。リン酸緩衝液中のPVA濃度が高いため、攪拌しながら反応緩衝液ボトルaubain-marieを加熱します。キャップをボトルに緩くねじ込むと、ボトルが破裂する可能性があります。

PVAがリン酸緩衝液に完全に溶解するまでに最大15分かかる場合があります。もしそうなら、溶液は攪拌によって引き起こされた小さな気泡で透明でなければなりません。粘性のあるPVA溶液は、幅の広いピペットを使用して反応バッファーチューブにピペットで移すことができます。

PVAが固まらないように、チューブを摂氏40度以上に保ちます。1ミリリットルのPVA溶液は、約4つのサイトスピン、または2つの組織調製物に適しています。反応バッファーの他の成分については、黄色のニトロブルー塩化テトラゾリウム(ニトロBTとも呼ばれる)をエタノールとジメチルホルムアミドの混合物に溶解し、ブンゼンバーナーのガラスバイアルで加熱します。

溶液が沸騰しすぎたり、体積が減りすぎたりしてはいけません。したがって、バイアルを炎の中に長く放置しすぎず、定期的に振ってください。溶解した後は氷の上に置いておき、溶解したnitroBTが急速に死滅するため、すぐに次のステップに進みます。

NitroBTは、溶解していないとエタノールとDMFを含むガラスバイアルの底に横たわる黄色の粉末です。nitroBTが溶解しているかどうかを数回ごとに確認できます。その後、溶液は黄色、透明になります。

溶解したら、ニトロBTをPVA溶液を含むバイアルにピペットで移すことができます。細いスプーンまたは細いヘラを使用して穏やかにかき混ぜ、nitroBTとバッファーを混合します。これは、全文の表1にリストされている反応バッファーのすべての成分に対して段階的に行います。

反応成分をPVA溶液に攪拌しながら、気泡を作りすぎないようにしてください。秘訣は、スプーンやヘラを溶液から取り出さずに、絶えずかき混ぜることです。電子キャリアであるメトキシフェナジニウムメチル硫酸塩は、光から保護され、最後に反応バッファーに溶解されます。

MPMSの赤色は、すべての成分が正しく溶解しているかどうかを再確認するのに便利です。反応緩衝液を調製し、その中に成分を攪拌しながら、温水を含むインキュベーターでスライドを50分間予温します。インキュベーションチャンバー内の水位を低く保

蓋を閉めると、反応環境が湿度に保たれます。蓋を開けると、水がスライドを暖かい温度に保ちます。ガラスピペットを使用して、反応バッファーを細胞または組織調製物に塗布します。

小さな気泡は表面に流れ込み、細胞や組織での反応を妨げないため、心配する必要はありません。インキュベーション期間中は、インキュベーションチャンバーの蓋を閉めておいてください。これにより、PVAバッファーが乾燥するのを防ぐために、湿度の高い環境で反応が起こることが保証されます。

メタボリックマッピング実験におけるほとんどのデヒドロゲナーゼ反応は、摂氏37度で起こります。スライドを反応バッファー内で事前に指定された時間インキュベートします(これは全文記事の表1に記載されています)。デヒドロゲナーゼの活性により、細胞または組織が濃い青または紫に変わるため、反応が機能したかどうかを簡単に確認できます。

これは最終的に無色の不溶性ニトロBTに変わり、デヒドロゲナーゼ活性の部位に沈殿するダークブルーのホルマゾールになります。酵素反応は3つのステップで停止します。まず、余分なインキュベーション培地を組織に叩きつけます。

次に、インキュベーション培地を、PH5.3のリン酸緩衝液、摂氏60度で機械的洗浄を使用して顕微鏡スライドから洗い流します。第三に、顕微鏡スライドをPH 5.3の新鮮なリン酸緩衝液に摂氏60度で20分間放置します。第四に、リン酸塩緩衝液は水道水を使用して洗い流し、次に蒸留水で洗い流すことができます。

反応バッファーが剥がれ落ちるのがすぐにわかります。停止バッファーのPHが低いため、細胞内のデヒドロゲナーゼ反応を停止できます。一度に処理するスライドの量に応じて、スライドを新しい停止バッファーに1回または2回置きます。

また、スライドを水道水ですすぎ、蒸留水で仕上げます。これで、スライドをスライドウォーマーで乾燥させて密閉することができます。スライドの裏側を拭き取るように丁寧に乾かし、50〜60°Cに予熱したウォーマーの上に置きます。

スライドが乾いたら、グリセリングリセロール溶液とカバースリップを使用してスライドを封入し、保存することができます。画像取得に進むまで、スライドを冷蔵庫に保存します。この動画で紹介した実験で処理したスライドガラス上の代表的な組織切片のカラー顕微鏡写真です。

これは膠芽腫の切片であり、レプトデヒドロゲナーゼが調査された酵素です。すべてのデヒドロゲナーゼはエンティティPHを産生し、すべてのエンティティPH分子は、黄色のテトラゾリウム塩である1分子のnitroBTを、この画像に示されている紫色の沈殿物である1分子のホルマゾールに変換します。濃い紫色で示されている腫瘍細胞では、細胞内で高い乳酸デヒドロゲナーゼ活性が見られます。

血管の活動は低く、白いです。これは、スライドの同じ領域の単色画像です。これは、プロトコルに記載されているように酵素活性を定量化するために使用できます。

ホルマザンが多く生成されるほど、ピクセルは暗くなり、吸光度は高くなります。その後、吸光度は、生成されたエンティティphのピコモルに変換できます。したがって、代謝マッピングは簡単に行うことができます。

とても速くて安いです。ですから、あなたの研究に使ってください。