16S rRNA 増幅配列による糞便の微生物評価ガイドのプロトコル

このハイスループット16S rRNA-Amplicon Sequencingの全体的な目標は、糞便サンプルから始まるグローバルなマイクロバイオーム組成を特徴づけることです。この方法は、代謝、消化、腸および全身の炎症など、多くの関心分野に関連する全体的な微生物組成に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、培養が困難な細菌を含む糞便サンプルに存在する好気性および嫌気性の微生物群集のセンサスを提供することです。

この方法は、迅速な結腸フリー処理ポンプラインにより、大量の糞便サンプルを同時に処理でき、堅牢で再現性の高い16S rRNA-Ampliconシーケンシングが実現しました。このプロトコルでは、鉛筆の消しゴムとほぼ同じサイズの凍結糞便サンプルを用意します。サンプルは、コレクションスワブの先端を切り取った状態で2ミリリットルのチューブに保管する必要があります。

糞便のない綿棒と内部重複コントロールで構成されるネガティブコントロールを含め、サンプル元の便からのサンプル重複を内部コントロールとして使用します。まず、抽出液と希釈液を室温で解凍し、糞便サンプルとコントロールサンプルを解凍します。解凍後、各サンプルチューブに250マイクロリットルの抽出溶液を加え、渦を使用して糞便を溶液に混合します。

この時点で、バッファーのみの負のコントロールに導入します。次に、サンプルを沸騰水浴で10分間加熱します。沸騰水でのインキュベーション後、各サンプルに250マイクロリットルの希釈溶液を加え、サンプルをボルテックスして混合します。

その後、PCRが実施できるようになるまで、サンプルチューブを摂氏4度で保管します。テンプレートやアンプリコンなどの潜在的なDNA汚染物質が洗浄されたPCR前のワークステーションでPCRをセットアップします。プライマーをバーコードに従ってラベル付けし、二重蒸留水で50マイクロモルの濃度に希釈します。

希釈したプライマーのストックはマイナス20°Cで保管し、完全に解凍してから使用してください。各サンプルについて、32回の反応を3回行うための96ウェルプレートを調製します。室温に温めた後、フォワードプライマーと32リバースプライマーのアリコートをPCR用に5マイクロモルに希釈します。

その後、100回の反応に十分なベースPCRミックスを調製します。100マイクロリットルの5マイクロモルフォワードプライマーを1ミリリットルの2X PCRマスターミックスと400マイクロリットルの二重蒸留水と組み合わせます。この混合物をボルテックスし、次にこの混合物の15マイクロリットルを96ウェルのそれぞれにロードします。

次に、3つのウェルのセットに、それぞれ1マイクロリットルの5マイクロモルリバースプライマーをロードします。したがって、32種類のリバースインデックスすべてをプレートにロードします。次に、各プレートウェルに、抽出したDNAサンプルを4マイクロリットル加えます。

これはクリーンベンチで行われます。次に、3分間の初期変性でPCRを実行し、その後、1分間の変性と摂氏55度でのひざまずき、1分間の伸展で35サイクルを実行します。10分間の延長で終了します。

反応終了後は、PCR後の専用ワークベンチで作業します。そこで、トリプリケートPCR産物の各セットを1つのチューブに結合し、サンプルあたり60マイクロリットルにします。次に、各サンプルの4マイクロリットルを、1%アガロースゲルで染色したエチジウムブロマイド上で分析します。

正のAmpliconは、375〜425塩基ペアの間に表示されます。ネガティブコントロールが示され、研究のポジティブアンプリコンとともに処理されます。メーカーの指示に従って、陽性反応生成物のDNA濃度を定量します。

次に、各製品から採取した500ナノグラムのDNAを1本のチューブに結合します。この混合物をボルテックスし、前と同じように1%ゲルで200マイクロリットルを使い果たします。次に、ゲルから375〜425塩基対のバンドを抽出します。

次に、シーケンシング用のライブラリを準備します。メーカーの指示に従って高感度の二本鎖DNA検出キットを使用して濃度を測定し、その後、高感度の分離および分析キットを使用します。次に、ライブラリを7ピコモルに希釈し、コントロールライブラリと4対1で組み合わせます。

サンプルをシーケンシングする準備ができたので、シーケンシングマシンに移します。便サンプルからのライブラリー調製について記載された方法を用いて、感染性下痢が疑われる入院患者のマイクロバイオームを解析した。並行して、糞便サンプルも微生物学研究室で従来の培養にかけられました。

健康な成人の糞便サンプルを比較のために配列決定しました。いくつかのネガティブコントロールサンプル、テンプレートなしのPCR、抽出および希釈溶液中の清潔で滅菌済みの綿棒でのPCR、および混合抽出および希釈溶液でのPCRが含まれていました。これらのそれぞれは、主にマイコプラズマ分類群である合計読み取りが118未満でした。

標準サンプルは平均 10 、 000 リードを超え、品質管理後にマイコプラズマが同定されませんでした。サンプルの一貫性と変動性は、2つの異なるバーコードプライマーで調製した16の便サンプルを使用して測定したため、各サンプルから2つの異なるライブラリを構築しました。サンプルの半分は、従来の培養技術でカンピロバクターサルモネラ菌または赤痢菌に陽性でした。

16Sシーケンシングの結果を使用して、系統レベルでの面積プロットは、従来の培養結果とは無関係に、同じサンプルから作られたライブラリ間の一貫性を示しています。この 16 個のペアのサンプルのプールから、主座標分析により、サンプルペアは密接に整列しており、ポジティブ培養サンプルの PC1 値はネガティブ培養サンプルと有意に異なることが明らかになりました。サンプルをさらに分析すると、高レベルのプロテオバクテリアが入院患者にのみ見つかったことが明らかになりました。

このビデオを見れば、結腸フリーのDNA抽出とPCRを使用して大量の糞便サンプルを同時に処理し、微生物変数V4領域のバーコードシーケンシングライブラリを生成する方法について十分に理解できるはずです。この手順を試行する際は、特にライブラリを準備するときは、整理されたクリーンな環境で作業することを忘れないでください。人間の糞便サンプルを扱うことは危険であり、この手順を実行するときは常に個人用保護具を着用する必要があることを忘れないでください。