定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量
2018年2月12日
このレポートでは、中古増幅の有無、定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたプラズマ miRNA の絶対レベルを測定するためのプロトコルについて説明します。このプロトコル プラズマ miRNAs の量のより良い理解とさまざまな研究や研究室から対応するデータの質的評価をことができます。
この手順の全体的な目標は、定量的リアルタイム逆転写PCRを使用して血漿マイクロRNAの絶対レベルを測定することです。この方法は、発現レベルが低い場合でも、血漿マイクロRNAの量を評価するのに役立ちます。この手法の主な利点は、測定されたデータをさまざまな研究や研究所の他のデータと比較できることです。
この手法の意味は、合成RNAまたはヌクレオチドを使用して標準曲線を生成できるため、他の分子種のサンプルにも及びます。この方法は、有望な安全性バイオマーカーを調査するためのトランスレーショナルリサーチへの洞察を提供します。まず、カニクイザルの大腿静脈から採取した凍結血漿サンプルを氷上で解凍します。
Lysis試薬をクロロホルムで氷上に移し、RNA抽出前に冷却します。次に、サンプルの200マイクロリットルに1, 000マイクロリットルの溶解試薬を追加します。そして、適切な混合を確保するために1分間渦を巻きます。
次に、5マイクロリットルの5ナノモル合成線虫マイクロRNAと200マイクロリットルのクロロホルムをサンプルに加えます。サンプルを1分間ボルテックスして適切に混合します。次に、サンプルを氷上に2〜3分間置きます。
次に、サンプルを12, 000Gで4°Cで15分間遠心分離します。次に、650マイクロリットルの水相を新しいマイクロチューブに慎重に移します。次に、975マイクロリットルのエタノールを水相に加え、ピペットで数回ピペットして完全に混合します。
サンプルを対応するカラムとアダプターに移し、バキュームマニホールドを使用して3分間真空乾燥します。次に、200マイクロリットルのエタノールをカラムに加え、1分間真空乾燥します。真空乾燥後、800マイクロリットルのRWTバッファーをカラムに加え、再度2分間真空乾燥します。
次に、800マイクロリットルのRPEバッファーをカラムに加え、2分間真空乾燥します。RPEバッファーを2回加え、続いて真空乾燥します。次に、300マイクロリットルのエタノールをカラムに加えます。
エタノールを加えた後、1分間真空乾燥させます。次に、カラムを新しいマイクロチューブに移し、室温で12, 000Gで1分間遠心分離します。遠心分離後、カラムを新しいマイクロチューブに移し、50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えます。
カラムを室温で3分間放置し、次に室温で8、000Gで1分間遠心分離します。最後に、溶出液を使用時までマイナス80°Cで保存します。標的マイクロRNAに対応する合成RNAオリゴヌクレオチド濃度を調製するには、ストック溶液を10倍に希釈して、標準曲線をプロットする最高濃度のワーキング溶液を実現します。
次に、逆転写プライマーのマルチプレックスプールを構成するために、標的マイクロRNA用の20強度プライマーを等量混合します。次に、逆転写反応ミックスを調製します。次に、10マイクロリットルの逆転写反応ミックスを5マイクロリットルのRNAサンプルに加えます。
ピペッティングで数回使用して2つを混合します。次に、混合物を氷上で5分間インキュベートします。サンプルをサーモサイクラーに入れた後、サイクルを開始します。
プログラムが終了したら、逆転写したサンプルを摂氏マイナス80度で保存します。マルチプレックスアッセイプライマープールを構成するには、ターゲットマイクロRNAに対応する5マイクロリットルのアッセイプライマーを、最終容量1, 000マイクロリットルのTris-EDTAバッファーを含むチューブに追加します。次に、プレアンプリフィケーション反応ミックスを構成する。
反応ミックスが完成したら、22.5マイクロリットルのプレアンプ反応ミックスを2点5マイクロリットルの逆転写サンプルに移します。次に、ピペットでサンプルを混合し、増幅マスターミックスを事前に混合し、氷上で5分間インキュベートした後、PCRチューブをサーモサイクラーに残してランを開始します。プログラムが終了したら、すべてのサンプルをマイナス80°Cで転送します。
事前に増幅されたサンプルまたは事前に増幅されていないサンプルを解凍した後、滅菌水で5倍に希釈します。標準曲線を生成するには、合成RNAオリゴヌクレオチドに由来するサンプルを10倍段階希釈します。次に、氷上に保持されたチューブ内で定量的PCR反応ミックスを構成します。
次に、定量PCR反応ミックスから18マイクロリットルをFast Optical 96ウェル反応プレートに加えます。次に、希釈したサンプルの2マイクロリットルをウェルに加えます。プレートを接着フィルムで密封した後、サンプルを500 Gで15秒間短時間遠心分離します。
次に、リアルタイムのThermocyclerプログラムを開始します。対応するリアルタイムサーマルサイクラーと連動するSDSソフトウェアバージョン2.4を使用して、各サンプルの生のコピー数を計算します。次に、Excelソフトウェアを使用して、生のコピー番号から絶対コピー数を計算します。
miR-122、miR-192、miR-133a の増幅効率は、標準曲線をプロットして分析しました。これにより、事前に増幅されていないサンプルの対数濃度と定量サイクルとの関係が説明されています。miR-122、miR-192、miR-133a の標準曲線は、定量サイクルとサンプルの対数濃度との間に線形関係を示しています。次に、miR-1、miR-499a、miR-206の増幅効率を、あらかじめ増幅したサンプルの標準曲線をプロットして解析しました。
増幅効率を分析するために、線形回帰を使用して傾きを計算しました。標準曲線Aの傾きは、miR-499aおよびmiR-206のマイクロリットル濃度あたり1, 000コピーで特定のアンプリコンが存在しないことを示しています。しかし、非特異的アンプリコンは、miR-1について1,000コピー/マイクロリットルで得られた。
ここでは、非事前増幅サンプルと事前増幅miR-206サンプルを重複して使用して、増幅プロットを導き出しました。非事前増幅および事前増幅されたmiR-206の定量サイクル値は、それぞれ39.9、プラスマイナス1ポイント9および27.0、プラスマイナス2ポイント2と推定され、プロットに示されているように、重複間のほぼ類似した値を表しています。次に、カニクイザルから得られた血漿マイクロRNAをプロファイリングし、その絶対値を算出しました。
マイクロRNAプロファイリングから得られたドットプロットは、それらの発現レベルを表しており、miR-122、miR-133a、およびmiR-192は事前に増幅しなくても検出可能であることを示しています。一方、miR-1、miR-206、および miR-499a は、発現レベルが低いため、事前増幅が必要になります。このビデオを見れば、RT-qPCRを使用して血漿microRNAの絶対レベルを測定する方法について十分に理解できるはずです。
そして、プリアンプリフィケーション。少量のマイクロRNAでの検出を改善することは有用です。
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概要
本レポートでは、定量リアルタイム逆転写PCRを用いて血漿中microRNAの絶対量を測定するためのプロトコルについて解説します。この手法により、発現レベルが低い血漿microRNAの評価が可能となり、異なる研究間での比較が容易になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- バイオマーカー研究
- 分子生物学
背景
- 血漿中のmicroRNAは、さまざまな生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。
- これらのレベルを把握することで、安全性バイオマーカーの特定に役立てることができます。
- 比較分析のために、標準曲線を作成することが可能です。
- この手法は、異なる種のサンプルにも適用できます。
研究の目的
- 血漿microRNAの絶対量を測定すること。
- 研究間でのデータの定性的な評価を可能にすること。
- トランスレーショナルリサーチへの知見を提供すること。
使用した手法
- 定量リアルタイム逆転写PCR。
- 前増幅法を用いる場合がある。
- カニクイザルの凍結血漿サンプルの融解。
- 標準曲線の作成のための合成RNAの使用。
主要な結果
- 血漿中microRNAの低発現レベルを効果的に測定できる。
- 異なる研究室間での結果の比較が容易になる。
- トランスレーショナルリサーチにおける安全性バイオマーカーを特定できる可能性がある。
- 様々な種のサンプルに適用可能である。
結論
- このプロトコルは、血漿中のmicroRNAレベルに関する理解を深めるものです。
- 比較のための標準化された手法の開発を支援します。
- バイオマーカー同定におけるさらなる研究への道を開きます。
よくある質問
産業界における重要性
血漿microRNAの絶対定量により、研究間での比較が可能となり、前臨床安全性評価におけるバイオマーカーのバリデーションが促進されます。本手法は、非臨床種における低存在量のターゲットを定量的かつ再現性高く測定することで、予測の信頼性を向上させます。これにより、相対定量では研究室間や種間でのデータ統合が制限されていたという、トランスレーショナルリサーチにおける重要な課題を解決します。
バイオ医薬品の研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： カニキグルミザル血漿中の絶対定量により、miRNAベースの安全性バイオマーカーの仮説検証を可能にする。
- 運用的価値： 合成cel-miR-238を外部コントロールとして使用し、サンプルバッチ間の標準化および品質評価を行う。
- 予測的価値： 前増幅により検出限界を102 copies/µLまで拡大し、miR-1、miR-206、miR-499aなどの低発現miRNAの測定を可能にする。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備：miRNA特異的プライマーおよびプローブを用いたプローブベースのRT-qPCRにより、血漿miRNAの特異的なマルチプレックス検出が可能です。
- 再現性：技術的変動が3倍未満と推定されており、信頼性の高い縦断的比較およびラボ間比較が可能です。
- 拡張性：合成RNAオリゴヌクレオチドによる標準曲線を用いて、ヒット検証のための濃度範囲全体における絶対定量が可能です。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳の連続性： カニクイザルにおける絶対定量は、ヒトの安全性バイオマーカー研究への外挿を支持します。
- バイオマーカーの適格性： 前増幅なしで検出可能なmiRNA（miR-122、miR-133a、miR-192）は、早期安全性スクリーニングの強力な候補となります。
- リスク軽減： 前増幅ワークフローにより、低存在量のmiRNAの検出が可能になり、バイオマーカーパネルにおける偽陰性が減少します。
パイプラインおよびワークフローへの統合
本手法は、ターゲットの選定およびアッセイの標準化に寄与する定量的なmiRNAプロファイリングを可能にすることで、創薬から前臨床試験に至る一連の流れ（discovery-to-preclinical continuum）に適合します。
- ディスカバリーバイオロジー：絶対定量によりmiRNAターゲットのバリデーションのためのコピー数データが提供され、メカニズム解明におけるリスク低減が支持されます。
- スクリーニング：102 copies/µLのLLOQにより、高発現および低発現の両方の血漿miRNAについて、スクリーニング可能な検出が可能です。
- 分析：標準曲線の作成とCqに基づく定量により、治療群間でのmiRNAレベルの統計的比較が可能になります。
- トランスレーショナルリサーチ：カニクイザルの血漿および合成コントロールの使用により、種間をまたいだバイオマーカーのトランスレーションが支持されます。
- エンタープライズ再利用：本プロトコルは、オプションのプレアンプリフィケーションを伴うRT-qPCRを用いた血漿miRNA定量の再利用可能なワークフローを定義しています。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 絶対定量により、miRNAバイオマーカー研究におけるメカニズムの曖昧さが軽減される。
- 運用の価値： 標準化されたRNA抽出およびqPCRワークフローにより、施設間での再現性が確保される。
- 戦略的価値： 前臨床モデルにおける定量的なmiRNA安全性シグナルに基づいた、Go/No-go判断が可能になる。
- ポートフォリオへの影響： 絶対コピー数の閾値を用いた、リスク調整後のmiRNAバイオマーカーの優先順位付けが可能になる。
実施上の考慮事項
- RNAの取り扱い、RT-qPCR、および前増幅技術の専門知識が必要である。
- サーモサイクラー、真空マニホールド、およびデータ解析用のSDSソフトウェアへのアクセスに依存する。
- 研究間の整合性を保つため、血漿量（200 µL EDTA）の標準化および外部コントロール（cel-miR-238）の使用が必要である。
- 偽陰性の結果を避けるため、Cq > 35のmiRNAには前増幅ステップが必要である。
- 増幅が検出可能なmiRNAに限定される。miR-208aおよびmiR-208bは、前増幅後でも検出できなかった。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
RNA Extraction
3:43
cDNA Synthesis
4:55
Pre-amplification
6:02
Quantitative Real-time PCR
7:05
Data Analysis
7:27
Results: Use of Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR with or without Pre-amplification to Measure the Absolute Levels of Plasma micro-RNAs
9:54
Conclusion
