定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量

この手順の全体的な目標は、定量的リアルタイム逆転写PCRを使用して血漿マイクロRNAの絶対レベルを測定することです。この方法は、発現レベルが低い場合でも、血漿マイクロRNAの量を評価するのに役立ちます。この手法の主な利点は、測定されたデータをさまざまな研究や研究所の他のデータと比較できることです。

この手法の意味は、合成RNAまたはヌクレオチドを使用して標準曲線を生成できるため、他の分子種のサンプルにも及びます。この方法は、有望な安全性バイオマーカーを調査するためのトランスレーショナルリサーチへの洞察を提供します。まず、カニクイザルの大腿静脈から採取した凍結血漿サンプルを氷上で解凍します。

Lysis試薬をクロロホルムで氷上に移し、RNA抽出前に冷却します。次に、サンプルの200マイクロリットルに1, 000マイクロリットルの溶解試薬を追加します。そして、適切な混合を確保するために1分間渦を巻きます。

次に、5マイクロリットルの5ナノモル合成線虫マイクロRNAと200マイクロリットルのクロロホルムをサンプルに加えます。サンプルを1分間ボルテックスして適切に混合します。次に、サンプルを氷上に2〜3分間置きます。

次に、サンプルを12, 000Gで4°Cで15分間遠心分離します。次に、650マイクロリットルの水相を新しいマイクロチューブに慎重に移します。次に、975マイクロリットルのエタノールを水相に加え、ピペットで数回ピペットして完全に混合します。

サンプルを対応するカラムとアダプターに移し、バキュームマニホールドを使用して3分間真空乾燥します。次に、200マイクロリットルのエタノールをカラムに加え、1分間真空乾燥します。真空乾燥後、800マイクロリットルのRWTバッファーをカラムに加え、再度2分間真空乾燥します。

次に、800マイクロリットルのRPEバッファーをカラムに加え、2分間真空乾燥します。RPEバッファーを2回加え、続いて真空乾燥します。次に、300マイクロリットルのエタノールをカラムに加えます。

エタノールを加えた後、1分間真空乾燥させます。次に、カラムを新しいマイクロチューブに移し、室温で12, 000Gで1分間遠心分離します。遠心分離後、カラムを新しいマイクロチューブに移し、50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えます。

カラムを室温で3分間放置し、次に室温で8、000Gで1分間遠心分離します。最後に、溶出液を使用時までマイナス80°Cで保存します。標的マイクロRNAに対応する合成RNAオリゴヌクレオチド濃度を調製するには、ストック溶液を10倍に希釈して、標準曲線をプロットする最高濃度のワーキング溶液を実現します。

次に、逆転写プライマーのマルチプレックスプールを構成するために、標的マイクロRNA用の20強度プライマーを等量混合します。次に、逆転写反応ミックスを調製します。次に、10マイクロリットルの逆転写反応ミックスを5マイクロリットルのRNAサンプルに加えます。

ピペッティングで数回使用して2つを混合します。次に、混合物を氷上で5分間インキュベートします。サンプルをサーモサイクラーに入れた後、サイクルを開始します。

プログラムが終了したら、逆転写したサンプルを摂氏マイナス80度で保存します。マルチプレックスアッセイプライマープールを構成するには、ターゲットマイクロRNAに対応する5マイクロリットルのアッセイプライマーを、最終容量1, 000マイクロリットルのTris-EDTAバッファーを含むチューブに追加します。次に、プレアンプリフィケーション反応ミックスを構成する。

反応ミックスが完成したら、22.5マイクロリットルのプレアンプ反応ミックスを2点5マイクロリットルの逆転写サンプルに移します。次に、ピペットでサンプルを混合し、増幅マスターミックスを事前に混合し、氷上で5分間インキュベートした後、PCRチューブをサーモサイクラーに残してランを開始します。プログラムが終了したら、すべてのサンプルをマイナス80°Cで転送します。

事前に増幅されたサンプルまたは事前に増幅されていないサンプルを解凍した後、滅菌水で5倍に希釈します。標準曲線を生成するには、合成RNAオリゴヌクレオチドに由来するサンプルを10倍段階希釈します。次に、氷上に保持されたチューブ内で定量的PCR反応ミックスを構成します。

次に、定量PCR反応ミックスから18マイクロリットルをFast Optical 96ウェル反応プレートに加えます。次に、希釈したサンプルの2マイクロリットルをウェルに加えます。プレートを接着フィルムで密封した後、サンプルを500 Gで15秒間短時間遠心分離します。

次に、リアルタイムのThermocyclerプログラムを開始します。対応するリアルタイムサーマルサイクラーと連動するSDSソフトウェアバージョン2.4を使用して、各サンプルの生のコピー数を計算します。次に、Excelソフトウェアを使用して、生のコピー番号から絶対コピー数を計算します。

miR-122、miR-192、miR-133a の増幅効率は、標準曲線をプロットして分析しました。これにより、事前に増幅されていないサンプルの対数濃度と定量サイクルとの関係が説明されています。miR-122、miR-192、miR-133a の標準曲線は、定量サイクルとサンプルの対数濃度との間に線形関係を示しています。次に、miR-1、miR-499a、miR-206の増幅効率を、あらかじめ増幅したサンプルの標準曲線をプロットして解析しました。

増幅効率を分析するために、線形回帰を使用して傾きを計算しました。標準曲線Aの傾きは、miR-499aおよびmiR-206のマイクロリットル濃度あたり1, 000コピーで特定のアンプリコンが存在しないことを示しています。しかし、非特異的アンプリコンは、miR-1について1,000コピー/マイクロリットルで得られた。

ここでは、非事前増幅サンプルと事前増幅miR-206サンプルを重複して使用して、増幅プロットを導き出しました。非事前増幅および事前増幅されたmiR-206の定量サイクル値は、それぞれ39.9、プラスマイナス1ポイント9および27.0、プラスマイナス2ポイント2と推定され、プロットに示されているように、重複間のほぼ類似した値を表しています。次に、カニクイザルから得られた血漿マイクロRNAをプロファイリングし、その絶対値を算出しました。

マイクロRNAプロファイリングから得られたドットプロットは、それらの発現レベルを表しており、miR-122、miR-133a、およびmiR-192は事前に増幅しなくても検出可能であることを示しています。一方、miR-1、miR-206、および miR-499a は、発現レベルが低いため、事前増幅が必要になります。このビデオを見れば、RT-qPCRを使用して血漿microRNAの絶対レベルを測定する方法について十分に理解できるはずです。

そして、プリアンプリフィケーション。少量のマイクロRNAでの検出を改善することは有用です。