Name: 西部のしみが付くプロトコル造血幹細胞の数が少ない (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学ぶウェスタンブロッティング法で造血幹細胞のタンパク質解析を行います。500細胞から20,000細胞までの少量サンプルに対応し、動物実験の削減に貢献します。シグナル伝達経路の研究に最適です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

健康の国民の協会付与 R01 CA149976 (N.A.S) はこの仕事を支えた。

すべてのプロシージャは、制度上の動物の使用およびケアのガイドラインに従って行われなければなりません。プロシージャは、マウス造血幹・前駆細胞 (造血および HPs) の解析用に開発されたが、他のセル人口の分析のため適応することができます。
1. マウス造血および HPs の流れフローサイトメトリー分離
<ol><li>文学6で説明するように、マウス骨髄細胞を収穫します。 注:図 1と図 2に示したデータ、骨髄が c57bl/6 j マウスから収穫されました。</li>
	<li>製造元の指示に従って、マウス系統の枯渇キットを使用して骨髄細胞の血統の枯渇を実行します。</li>
	<li>説明7として興味のセル表面のマーカーに対する抗体と細胞を孵化させなさい。図 1および図 2に示すように実験、Sca 1、キット、Flt3、Mac1、Gr1、CD3e、B220、Ter119 系統 (Lin) マーカーに対する抗体を使用します。</li>
	<li>2,000 20,000 林- Sca1 の並べ替え+キット+ Flt3-細胞 (造血) または Lin-Sca1-キット+細胞 (HPs) リン酸の 0.1 mL を含む 1.5 mL エッペン チューブに緩衝生理食塩水 (PBS) 2% 胎児ウシ血清 (FBS)。 注意: データは、図 1および図 2に示すように、セル ソートされた 70 μ M ノズル流れの Cytometer を使用します。コレクションの最大ボリュームは、1.4 mL です。</li>
</ol>2. サンプル準備
注: この手順は重要です。サンプルを非常に慎重に処理します。上清を取り外す場合は、細胞ペレットを邪魔しないように非常に注意します。
<ol><li>遠心分離機、1.5 mL チューブが 4 ° C でスイング バケツ ローターの並べ替えセルを含む、500 x g、5 分削除以外のすべての約 100 μ L のセルから上澄みのペレット ピペットと 20 μ L ピペット チップを使用して非常に穏やか。ペレットが不可でした。<ol>
<li>サンプルは、5,000 未満のセルを含む、並べ替えられたサンプルの合計量は 0.2 mL 未満、最初低結合 0.2 mL PCR チューブ遠心分離前にセルを転送します。</li>
		<li>サンプルには、5,000 未満のセルが含まれています、量は 0.2 mL 以上、4 ° C、500 × g で 5 分間遠心分離機でセルをスピンダウンします、上清 200 μ L がすべて削除します。再培養上清の残りの 200 μ L の小球形にされたセルを中断し、0.2 mL PCR チューブにセルを転送、再びスピンダウンします。2 番目のスピンの後ペレットからすべてが 20-30 μ L を削除し、再度セルを中断します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>チューブに上清左の細胞を再懸濁します。必要であれば 2% 追加 PBS を追加 FBS/PBS (2% ウシ血清アルブミン (BSA) を使用することもできます/PBS、または単独で PBS)、濃度が 5 x10 5 x 105セル/mL に4 。 注: セルをカウントの使用セルを中断するために使用量を推定するためのフローサイトメトリーによって収集されます。</li>
	<li>再浮遊細胞の 2-5 μ L を使用すると、(製造元の指示に従って) 自動化された細胞カウンターまたは検定9を使用して正確な細胞濃度を決定します。</li>
	<li>必要な新しい 1.5 mL チューブに細胞数を含む再浮遊細胞の量を転送します。図 1に実験のため、1,000、2,000、または 500 の HSCs または HPs に移した。必要な細胞数は西部のしみ、によって得られる信号強度に依存し、は、経験的に決定します。20 μ L または 100 μ L エッペン ピペット チップを使用して転送を実行します。</li>
	<li>スイング バケツ ローター 4 ° C、500 × g で 5 分で細胞を遠心します。</li>
	<li>原液 x 100 を生成するための製造元の指示に従って DMSO にプロテアソームとホスファターゼ阻害剤を溶解します。</li>
	<li>2 x Laemmli サンプル バッファーを準備するには、蒸留水の相当量を製造元から提供された 4 x Laemmli サンプル バッファーを希釈します。阻害剤 x 2 2 x Laemmli サンプル バッファー内の最終的な集中を取得するホスファターゼとプロテアソーム阻害剤の 100 x の在庫の適切な量を追加します。 注: 2 x Laemmli サンプル バッファー、事前に行うことが、プロテアソームとホスファターゼ阻害剤は、次の手順で説明するように、2 x Laemmli サンプル バッファー (プラス阻害剤) 細胞ペレットに細胞を溶解するを追加する前にすぐに追加必要があります。</li>
	<li>慎重に細胞ペレットおよび細胞ペレットをチューブに残って上清に上澄みの部分を削除、2 の x Laemmli サンプル バッファー プラス 500 の最終的な集中を達成するためにプロテアソームとホスファターゼ阻害剤の等量を追加細胞/μ l 1 x Laemmli サンプル バッファー内。 注: たとえば、ステップ 2.5 でチューブ、ペレットから上澄みの 18 μ L を削除する必要があります (ステップ 2.6) 細胞を遠心分離後、残りは上澄みの 2 μ L に 20 μ L の総ボリュームで 2,000 のセルを転送する場合は追加の等しいボリューム (2 μ L) 2 x 500 細胞/μ L 1 x Laemmli サンプル バッファー内の最終的な集中を達成するために塩化物イオン サンプル バッファー。</li>
	<li>できるだけ早く、ライセートを生成するペレットを再懸濁します。この時点で、サンプルは SDS ページのゲルを通ってすぐに electrophoresed することができます。 またはスナップがリキッド N2でフリーズし、将来使用するため-80 ° C で保存することがことができます。</li>
</ol>3. 電気泳動
<ol><li>95 ° C で熱ブロック内、または 5 分間水を沸騰の溶解液を加熱します。</li>
	<li>標準プロトコル10を使用して 100 v で SDS ページのゲルを通って (20,000 セル同等まで 500 から含む) 溶解液の 1 40 μ L を electrophorese します。 メモ: ライセートのゲルにロードのボリュームは、望ましい信号の生成に必要なセルの数によって決まります、利子および抗体の品質の蛋白質の豊富さによって異なります。図 1のデータは、2,000、1,000、500 セル相当ライセートと得られました。井戸の幅切られるべき 3 mm に 1.5 mm. 歯をすることができます 1.5 mm の範囲で市販の櫛から広い歯のはさみを使用しています。</li>
</ol>4. 転送し、ブロック
注: は、次の標準的なプロトコル11西部のしみを実行します。手順は簡単にここで記載されています。
<ol><li>10 s、それから簡単に膜の洗浄に蒸留水、メタノールとポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜を前処理します。</li>
	<li>転送装置の製造元から提供されるマニュアルの指示に従って膜に SDS ページのゲルからタンパク質を転送します。</li>
	<li>2 ml の 5% ウシ血清アルブミン (BSA) PBST の膜をブロック転送を以下 (0.1% と PBS トゥイーン) 4 ° C 以下の標準プロトコル11で一晩。</li>
</ol>5. 抗体の分類
<ol><li>ベンダーによって推奨の抗体希釈を使用して 4 ° C で一晩シェーカーで抗体を膜を孵化させなさい。 注: 材料表 HSCs と HPs と対応する抗体の希薄を検証しましたが、抗体が表示されます。標準的な手順8を使用して抗体の分類を実行します。</li>
</ol>6. 検出
<ol><li>3 回、室温で PBST で各洗浄のため 5 分、膜を洗浄します。</li>
	<li>2 mL の部屋の温度で 1 分の化学発光のバッファーを持つ膜を孵化させなさい。次の製造元の指示、またはオートラジオグラフィー フィルムとフィルムのプロセッサ イメージング システムを使用して信号を検出します。</li>
</ol>

<ol><li>Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+analysis+of+murine+immune+cell+surface+markers+and+intracellular+phosphoproteins+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry.</a> J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+profiling+at+the+single-cell+level+identifies+a+distinct+signaling+signature+in+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+require+a+highly+regulated+protein+synthesis+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate.</a> Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation+checkpoint+limits+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage.</a> Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).</li>
<li>Hoshii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+is+essential+for+leukemia+propagation+but+not+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal.</a> J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).</li>
<li>Signer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+protein+synthesis+in+hematopoietic+stem+cells+is+limited+partly+by+4E-BPs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs.</a> Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+deficiency+decreases+ribosome+biogenesis+and+confers+stress+resistance+to+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. , (2015).</li>
<li>Loven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+global+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting global gene expression analysis.</a> Cell. 151 (3), 476-482 (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">Using a Hemoacytometer to Count Cells.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> J Vis Exp. (93), e52099(2014).</li>
</ol>

著者は宣言する利害の衝突があります。

西部にしみが付くことは、組織や細胞の特定の蛋白質とシグナル伝達経路の活性化を検出するための一般的な手法です。一般的に使用されるプロシージャを微調整を導入し、15,000 HSCs と 500 HSCs として、いくつかのいくつかのケースで日常的に 15 の異なった蛋白質 (資材表) を検出することができました。The most このプロトコルの重要なステップは、: 1) 正確にセルをカウント、2) 転送管の数を最小限に抑え、3) 塩化物イオン サンプル バッファーに直接細胞を溶解します。細胞ペレットから上澄みのすべてを削除して再代わりにチューブに上清の小さいボリュームを左し、同等のものを追加、塩化物イオンとサンプル バッファー内に中断はなく、わかったときに塩化物イオン サンプル バッファーを持つ細胞ペレットを溶解、塩化物イオン サンプル バッファー x 2 のボリュームは、我々 は、セル損失を回避できました。スイング バケツ ローターで細胞を遠心分離と、セル損失のリスクも減少しました。検出の感度を改善櫛歯をトリミングすることによって井戸の幅を減らします。
<p class="jove_conte...

造血幹細胞 (造血) は、すべての血液系統に上昇を与えることができる自己更新のセルです。比較的希少な細胞の骨髄、生化学的解析を困難にレンダリングしています。アプローチ フローサイトメトリーなどの希少な細胞の解析に適しては、セル表面のマーカー、細胞内タンパク質の相対的な量を定量化するために非常に有用されています。細胞内タンパク質の解析抗体アクセスを有効にするセル透過手順の使用を必要とし、すべてではない細胞表面抗原生き残るこれら手順1,2。さらに、異なるタンパク質アイソ フォームや胸の谷間の製品を区別する抗体が多い、フローサイトメトリー用利用可能なしたがって調査官まだに依存西部のしみ特定のタイプの解析。
セル lysates の西部のしみの分析は、ほとんどの実験室の定期的なプロシージャです。細胞表面抗原のエピトープを保持するネイティブの条件下で細胞を浄化することが、セル lysates の準備および分析できる後。ただし、まれな一次電池しみの西部で人口におけるタンパク質の解析は十分なセルを取得する動物の数が多いを安楽死させる要求できます。いくつかの手順を微調整すること、によって、従来の西部のしみが付くプロトコル HSCs (500-15,000、興味の蛋白質によって) の比較的少数の蛋白質を検出することができた。調整は、セル、セルのセル損失を最小限に抑えるためのチューブ間の移管を軽減、細胞ペレットを慎重に処理を正確にカウントし、バッファー含むプロテアソームの集中載荷時とセルの定義された数を溶解し、ホスファターゼ阻害剤。パブリッシュされたレポートの多くは、20,000 以上 HSCs3,4,5,6,7で得られた西部のしみこの簡単な手順は、セルと 4 と 40 倍の間で相当のデータを生成するために必要な実験動物の数を減らすは。プロトコルは、内部統制ではなく、セルごとに結果を正規化する設計されています。これは、内部のコントロールにデータが正規化された場合に見落とすことができる蛋白質のレベルの全体的な削減の検出を可能。 にします。セルごとに正規化の重要性は、遺伝子発現データ8の分析について説明された、西部のしみによって蛋白質を定量化する同じ原則が適用されます。この最適化されたプロトコルは、細胞の小さな数字を分析する必要がある誰にとっても便利でする必要があります。

<table><tbody><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>30% アクリルアミドル Bis 溶液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.5M Tris-HCl pH8.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1588</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.0M Tris-HCl pH6.8</td><td>TEKNOVA</td><td>T1068</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP179-25</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ミニプロティアン 3 コーム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1653360</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ミニプロティアン テトラセル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1658005EDU</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>トランスファー システム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1704155EDU</td><td>トランスファー</td></tr><tr><td>PowerPac HC 電源</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1645052EDU</td><td>電気泳動</td></tr><tr><td>イメージングシステム</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td>シグナル検出</td></tr><tr><td>4x Laemmli サンプルバッファー</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747EDU</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS 電気泳動バッファー</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732EDU</td><td>電気泳動</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710EDU</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>RTA Mini PVDF Transfer Kit、40 個用ブロット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1704272</td><td>転写</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>シグマ</td><td>11697498001</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤 カクテル</td><td>ゴールド バイオテクノロジー</td><td>GB-450-1</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>EIF4G</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2469</td><td>WB 抗体、1000 細胞で検証済み 抗体濃度: 1:1000 参照(図): 図2</td></tr><tr><td>p-Rps6</td><td>Cell signaling</td><td>4858</td><td>WB 抗体、1000 cells 抗体濃度:1:1000 参照(図):Fig2</td></tr><tr><td>actin(HRP conjugated)</td><td>abcam</td><td>ab49900</td><td>WB 抗体、500 cells で検証 抗体濃度:1:5000 参照(図):Fig1、Fig2</td></tr><tr><td>LC-3</td><td>Abcam</td><td>ab48394</td><td>WB抗体、15000細胞で検証済み 抗体濃度:1:1000 参照(図):ref5(図5)</td></tr><tr><td>S6</td><td>Cell Signaling</td><td>2317</td><td>WB抗体、15000細胞で検証済み 抗体濃度:1:1000 参照(図):ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>9644</td><td>WB抗体、15000細胞で検証済み 抗体濃度: 1:1000 参考文献(図): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>p-4EBP1</td><td>Cell Signaling</td><td>2855</td><td>WB 抗体,15000 cells で検証済み 抗体濃度: 1:1000 参考文献(図): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>TSC2</td><td>Cell Signaling</td><td>4308</td><td>WB 抗体,15000 cells 抗体濃度: 1:1000 参考文献(図): ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>HSP90</td><td>Cell Signaling</td><td>4877</td><td>WB抗体、15000細胞で検証済み 抗体濃度:1:1000 参照(図):ref5(図5)</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>Cell Signaling</td><td>9188</td><td>WB抗体、15000細胞で検証済み 抗体濃度:1:1000 参照(図):ref5(図S1)</td></tr><tr><td>mTOR</td><td>Cell Signaling</td><td>2983</td><td>WB抗体、15000細胞で検証済み 抗体濃度:1:1000 参照(図):ref5(図S1)</td></tr><tr><td>p-mTOR</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>5536</td><td>WB抗体、15000細胞で検証済み 抗体濃度:1:1000 参照(図):ref5(図S1)</td></tr><tr><td>PP2AB</td><td>Cell Signaling</td><td>4953</td><td>WB抗体、15000細胞で検証済み 抗体濃度: 1:1000 参考文献(図):ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>p-AMPKa</td><td>Cell Signaling</td><td>2535</td><td>WB 抗体、15000細胞で検証済み 抗体濃度:1:1000 参考文献(図):ref5 (FigS1)</td></tr><tr><td>actin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47778</td><td>WB 抗体、15000細胞で検証済み 抗体濃度:1:3000 参考文献(図):ref5 (Fig4)</td></tr><tr><td>系統枯渇キット(マウス)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td>造<td>血幹細胞および前駆細胞精製</td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-305</td>造<td>血幹細胞および前駆細胞精製</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>250-03</td><td>リン酸化刺激</td></tr><tr><td>APC-Cy7 c-kit抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>A15423</td><td>細胞選別</td></tr><tr><td>抗B220</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0452-82</td><td>細胞選別</td></tr><tr><td>抗CD3e</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0031-82</td><td>細胞選別</td></tr><tr><td>反Mac1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-0112-82</td><td>細胞選別</td></tr><tr><td>反Gr1</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5931-82</td><td>細胞選別</td></tr><tr><td>反Ter119</td><td>ThermoFisher</td><td>48-5921-82</td><td>細胞選別</td></tr><tr><td>1.0mm一体型スペーサープレートスペーサー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1653311</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>BSA</td><td>研究製品 国際</td><td>A30075</td><td>膜ブロッキング</td></tr><tr><td>血清</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>A12450</td><td>培地サプリメント</td></tr><tr><td>細胞カウンター</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td>細胞計数</td></tr><tr><td>用血球計算盤</td><td>サーモフィッシャー</td><td>&nbsp;S17040</td><td>細胞計数</td></tr><tr><td>flim</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>E3012</td><td>信号検出</td></tr><tr><td>医療フィルムプロセッサ</td><td>コニカ</td><td>SRC-101A</td><td>信号検出</td></tr><tr><td>スーパーシグナル ウェストフェムト 最大感度 基板</td><td>セロムサイエンティフィック</td><td>34096</td><td>信号検出</td></tr><tr><td>アレグラ X-15R 遠心分離機(ローター SX4750A)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>X-15R</td><td>サンプル準備</td></tr><tr><td>BLUEstain タンパク質ラダー</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>P007-500</td><td>電気泳動</td></tr><tr><td>細胞選別機</td><td>BD</td><td>FACSAria II</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>Incublock</td><td>Denville Scientific</td><td>I0510</td><td>電気泳動</td></tr></tbody></table>

西部のしみが付くプロトコル造血幹細胞の数が少ない

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

造血幹細胞 (造血) 希少な細胞は、長い間 25,000 〜 表現型を含むマウス骨髄再 HSCs を長期的です。西部のしみが付くプロトコルの最適化され、造血 (500-15,000 細胞) の小さな数字の解析に適した。表現型の HSCs 精製、正確にカウント、塩化物イオンとサンプル バッファーに直接分離します。同じ数の細胞の溶解液はナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分析されたとしみが準備され、次の標準的な西部のしみが付くプロトコルを処理します。このプロトコルは、2,000-5,000 を使用して HSCs を定期的に分析して 500 セル、ほとんどの出版物で報告される 20,000 に 40,000 セルと比較して少ないからいくつかのケースでデータを取得できます。このプロトコルは、その他の造血細胞に一般に適用されるべきし、少数の標準的な検査手順を使用してセルのルーチン分析が可能します。

500-2,000 精製造血および HPs の代表的な結果は、図 1と図 2のとおりです。500 HSCs から図1 β-アクチン信号を検出できるし、HPs が 1 つのマウスの骨髄から精製しました。Lysates を読み込んで 1.5 mm 井戸生産 3.0 mm 井戸への読み込みよりも 500 HPs から非常に強い信号であることに注意してください。図 2は EIF4G の西部のしみ、Rps6 のリン酸化 (p Rps6)、どちらのタンパク質翻訳12の星細胞の調節に関与しているし、HPs と幹細胞による刺激なしで体外(SCF) 要因。
<img a...

しみが付くプロトコル標準ウエスタンとして 500 造血幹前駆細胞の数を分析するため最適化を行った。最適化を含むセルのサンプルの処理、管の転送を制限して塩化物イオンとサンプル バッファー内セルを直接溶解に注意してください。

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

このウェスタンブロッティングプロトコールの目標は、少数の細胞でウェスタンブロットを行うことです。この方法は、特定のタンパク質の存在や存在量、シグナル伝達経路の活性化など、造血幹細胞領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、必要な細胞が20, 000個未満であるため、初代細胞の希少な集団を分析するために必要な動物が少なくて済むことです。この方法のアイデアを思いついたのは、造血幹細胞解析に使用するマウスの数を減らす方法を見つけようとしていたときでした。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるXiongwei Caiです。スイングバケットローターを使用して、選別された造血幹細胞と前駆細胞を含む1.5ミリリットルのチューブを、摂氏4度で重力の500倍で5分間遠心分離します。遠心分離が終了したら、細胞ペレットを乱さずに、100マイクロリットルの上清を除くすべての上清を廃棄します。細胞が5, 000個未満で、選別されたサンプルの量が0.2ミリリットル未満の場合は、まず細胞を低結合の0.2ミリリットルPCRチューブに移してから遠心分離します。ただし、細胞が5, 000個未満であるが、選別されたサンプルの量が0.2ミリリットルを超える場合は、細胞を重力の500倍で摂氏4度で5分間遠心分離します。遠心分離後、200マイクロリットルの上清を除くすべての上清を廃棄します。次に、ペレットと残りの200マイクロリットルの上清を再懸濁します。次に、細胞懸濁液を0.2ミリリットルのPCRチューブに移し、再び遠心分離します。次に、ペレットを20〜30マイクロリットルの上清に再懸濁し、残りを廃棄します。必要に応じて、2%ウシ胎児血清中のリン酸緩衝生理食塩水、または2%ウシ血清アルブミンを再懸濁細胞に加えます。次に、自動セルカウンターを使用して、2〜5マイクロリットルの再懸濁細胞を使用して細胞濃度を決定します。次に、20または100マイクロリットルのピペットチップを使用して、500、1、000、および2、000の造血幹細胞と前駆細胞を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。スイングバケットローターを使用して、細胞を摂氏4度、重力500倍で5分間遠心分離します。次に、製造元の指示に従って、ホスファターゼとプロテアソーム阻害剤、およびDMSOを溶解し、100倍ストック溶液を調製します。次に、4倍Laemmliサンプルバッファーを等量の蒸留水で希釈して、2倍Laemmliサンプルバッファーを作製します。次に、ホスファターゼとプロテアソーム阻害剤の100倍ストック溶液を適量加えて、最終濃度を2倍阻害剤と2倍Laemmliサンプルバッファーに調整します。ホスファターゼおよびプロテアソーム阻害剤とともに等量の2倍Laemli緩衝液を追加すると、マイクロリットルあたり500細胞および1倍Laemli緩衝液の最終濃度が達成されるように、チューブ内の残留上清の量を調整します。次に、再懸濁してライセートを形成します。ゲルをロードする前に、サンプルライセートをヒートブロック内で摂氏95度で5分間加熱します。標準的なプロトコルの電気泳動を使用して、100ボルトでSDSページを通じて500〜20、000細胞に相当するライセート1〜40マイクロリットルを電気泳動します。ポリビニリデンメンブレンをメタノールで数秒間処理した後、メンブレンを蒸留水で短時間洗浄します。次に、転写装置の製造業者の指示に従って、タンパク質をゲルからメンブレンに移します。移した後、2ミリリットルの2%ウシ血清アルブミンとリン酸緩衝生理食塩水でメンブレンを0.1%Tweenで、標準的なプロトコルに従って摂氏4度で一晩ブロックします。メンブレンをブロッキングした後、希釈した抗体と4°Cで一晩インキュベートします。次に、0.1%Tween 20でリン酸緩衝生理食塩水を使用してメンブレンを室温で5回ずつ3回洗浄します。次に、メンブレンを2ミリリットルの増強化学発光バッファーと室温で1分間インキュベートします。イメージングシステムを使用して信号を検出します。βアクチンシグナルを比較するために、尿造血幹細胞および前駆細胞からライセートを調製し、ウェスタンプロット解析を行った。アミノブロットから、12%SDSページゲル上に1.5ミリメートルウェルにロードされた2, 000〜500個の造血前駆細胞および幹細胞から調製されたライセートからのベータアクチンシグナルが減少していることは明らかです。さらに、ゲルにキャストされた異なるウェルサイズから得られたベータアクチンシグナルを比較する。ライセートをゲル上の1.5mmおよび3mmのウェルにロードし、ウェスタンブロット分析を行いました。このブロットは、1.5mmのウェルにロードされた500の造血前駆細胞から調製されたライセートから得られるベータアクチンシグナルが、3mmのウェルにロードした場合よりもはるかに強いことを示しています。次に、真核生物開始因子4Gのシグナルを比較するために、得られたライセートをアミノブロットにより解析したサイトカイン幹細胞因子刺激に応答したリボソームタンパク質S6のアクチンおよびリン酸化を解析した。ブロットは、サイトカイン幹細胞因子刺激による造血反応の3つのタンパク質すべてについて、より強いシグナル強度の存在を示しています。in vitroでの対照と比較して、異なる造血幹細胞体積からの3つのタンパク質すべてにシグナル強度があり、増加していることも明らかです。これを技術的にマスターすると、48時間で完了します。ちゃんと近づいていけば。この手順を試みる際には、細胞を正確にカウントし、ローディングバッファーでライセート細胞を指示することを覚えておくことが重要です。この開発の後、幹細胞研究の分野の研究者は、少数の細胞のシグナル経路を探索するために技術的にペレット化されます。このビデオを見た後、少数のアドレスピースでウェスタンプロットを行う方法をよく理解しているはずです。SDS ページに使用しているリージョンに注意してください。ご視聴いただきありがとうございました。あなたの実験に頑張ってください。

a-western-blotting-protocol-for-small-numbers-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

造血幹細胞の分離と移植（造血幹細胞）

このビデオでは、ヒト免疫系(HIS)マウスを生成する技術を示しています。CD34+造血幹細胞(HSC)は、抗体被覆磁気ビーズを用いてヒト臍帯血バフィーコート細胞から単離されます。CD34+...

臍帯血造血幹細胞を分離してヒト免疫系マウスを作製

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。...

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。...

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

細胞内の体性変異パターンは、以前の変異型暴露を反映し、発達系統の関係を明らかにすることができる。ここでは、個々の造血幹細胞および前駆細胞における体細胞変異をカタログ化および分析する方法論を示す。...

ヒト血液の突然変異負荷とクローン組成の特徴付け

造血幹細胞(HSPC)は、血液形成中の代謝可塑性による静止状態から分化状態に移行します。ここでは、HSPCのミトコンドリア呼吸と糖状化を測定するための最適化された方法を提示する。...

造血幹細胞細胞代謝の解析

ここでは、生体内培養造血幹細胞およびT細胞におけるミトコンドリア質量および膜電位を測定する信頼性の高い方法について説明する。...

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

このプロトコルは、豊富な脂肪酸、コレステロール、サイトカインの低濃度、および低酸素症を使用して骨髄微小環境を模倣することによって、体外の静止したヒト造血幹細胞の維持を可能にする。...

静止ヒト造血幹細胞を維持する培養法

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

Hoxb5レポーターシステムを使用して、長期造血幹細胞(LT-HSC)および短期造血幹細胞(ST-HSC)を分離するための段階的なプロトコルを提示します。...

長期および短期造血幹細胞の単離方法

本研究では、骨形成タンパク質-2をロードしたゼラチン足場をトリガーとする in vivo...

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

学ぶウェスタンブロッティング法で造血幹細胞のタンパク質解析を行います。500細胞から20,000細胞までの少量サンプルに対応し、動物実験の削減に貢献します。シグナル伝達経路の研究に最適です。

西部のしみが付くプロトコル造血幹細胞の数が少ない

さらに動画を探す