西部のしみが付くプロトコル造血幹細胞の数が少ない
2018年8月22日
しみが付くプロトコル標準ウエスタンとして 500 造血幹前駆細胞の数を分析するため最適化を行った。最適化を含むセルのサンプルの処理、管の転送を制限して塩化物イオンとサンプル バッファー内セルを直接溶解に注意してください。
このウェスタンブロッティングプロトコールの目標は、少数の細胞でウェスタンブロットを行うことです。この方法は、特定のタンパク質の存在や存在量、シグナル伝達経路の活性化など、造血幹細胞領域における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、必要な細胞が20, 000個未満であるため、初代細胞の希少な集団を分析するために必要な動物が少なくて済むことです。
この方法のアイデアを思いついたのは、造血幹細胞解析に使用するマウスの数を減らす方法を見つけようとしていたときでした。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるXiongwei Caiです。スイングバケットローターを使用して、選別された造血幹細胞と前駆細胞を含む1.5ミリリットルのチューブを、摂氏4度で重力の500倍で5分間遠心分離します。
遠心分離が終了したら、細胞ペレットを乱さずに、100マイクロリットルの上清を除くすべての上清を廃棄します。細胞が5, 000個未満で、選別されたサンプルの量が0.2ミリリットル未満の場合は、まず細胞を低結合の0.2ミリリットルPCRチューブに移してから遠心分離します。ただし、細胞が5, 000個未満であるが、選別されたサンプルの量が0.2ミリリットルを超える場合は、細胞を重力の500倍で摂氏4度で5分間遠心分離します。
遠心分離後、200マイクロリットルの上清を除くすべての上清を廃棄します。次に、ペレットと残りの200マイクロリットルの上清を再懸濁します。次に、細胞懸濁液を0.2ミリリットルのPCRチューブに移し、再び遠心分離します。
次に、ペレットを20〜30マイクロリットルの上清に再懸濁し、残りを廃棄します。必要に応じて、2%ウシ胎児血清中のリン酸緩衝生理食塩水、または2%ウシ血清アルブミンを再懸濁細胞に加えます。次に、自動セルカウンターを使用して、2〜5マイクロリットルの再懸濁細胞を使用して細胞濃度を決定します。
次に、20または100マイクロリットルのピペットチップを使用して、500、1、000、および2、000の造血幹細胞と前駆細胞を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。スイングバケットローターを使用して、細胞を摂氏4度、重力500倍で5分間遠心分離します。次に、製造元の指示に従って、ホスファターゼとプロテアソーム阻害剤、およびDMSOを溶解し、100倍ストック溶液を調製します。
次に、4倍Laemmliサンプルバッファーを等量の蒸留水で希釈して、2倍Laemmliサンプルバッファーを作製します。次に、ホスファターゼとプロテアソーム阻害剤の100倍ストック溶液を適量加えて、最終濃度を2倍阻害剤と2倍Laemmliサンプルバッファーに調整します。ホスファターゼおよびプロテアソーム阻害剤とともに等量の2倍Laemli緩衝液を追加すると、マイクロリットルあたり500細胞および1倍Laemli緩衝液の最終濃度が達成されるように、チューブ内の残留上清の量を調整します。
次に、再懸濁してライセートを形成します。ゲルをロードする前に、サンプルライセートをヒートブロック内で摂氏95度で5分間加熱します。標準的なプロトコルの電気泳動を使用して、100ボルトでSDSページを通じて500〜20、000細胞に相当するライセート1〜40マイクロリットルを電気泳動します。
ポリビニリデンメンブレンをメタノールで数秒間処理した後、メンブレンを蒸留水で短時間洗浄します。次に、転写装置の製造業者の指示に従って、タンパク質をゲルからメンブレンに移します。移した後、2ミリリットルの2%ウシ血清アルブミンとリン酸緩衝生理食塩水でメンブレンを0.1%Tweenで、標準的なプロトコルに従って摂氏4度で一晩ブロックします。
メンブレンをブロッキングした後、希釈した抗体と4°Cで一晩インキュベートします。次に、0.1%Tween 20でリン酸緩衝生理食塩水を使用してメンブレンを室温で5回ずつ3回洗浄します。次に、メンブレンを2ミリリットルの増強化学発光バッファーと室温で1分間インキュベー
トします。イメージングシステムを使用して信号を検出します。βアクチンシグナルを比較するために、尿造血幹細胞および前駆細胞からライセートを調製し、ウェスタンプロット解析を行った。アミノブロットから、12%SDSページゲル上に1.5ミリメートルウェルにロードされた2, 000〜500個の造血前駆細胞および幹細胞から調製されたライセートからのベータアクチンシグナルが減少していることは明らかです。
さらに、ゲルにキャストされた異なるウェルサイズから得られたベータアクチンシグナルを比較する。ライセートをゲル上の1.5mmおよび3mmのウェルにロードし、ウェスタンブロット分析を行いました。このブロットは、1.5mmのウェルにロードされた500の造血前駆細胞から調製されたライセートから得られるベータアクチンシグナルが、3mmのウェルにロードした場合よりもはるかに強いことを示しています。
次に、真核生物開始因子4Gのシグナルを比較するために、得られたライセートをアミノブロットにより解析したサイトカイン幹細胞因子刺激に応答したリボソームタンパク質S6のアクチンおよびリン酸化を解析した。ブロットは、サイトカイン幹細胞因子刺激による造血反応の3つのタンパク質すべてについて、より強いシグナル強度の存在を示しています。in vitroでの対照と比較して、異なる造血幹細胞体積からの3つのタンパク質すべてにシグナル強度があり、増加していることも明らかです。
これを技術的にマスターすると、48時間で完了します。ちゃんと近づいていけば。この手順を試みる際には、細胞を正確にカウントし、ローディングバッファーでライセート細胞を指示することを覚えておくことが重要です。
この開発の後、幹細胞研究の分野の研究者は、少数の細胞のシグナル経路を探索するために技術的にペレット化されます。このビデオを見た後、少数のアドレスピースでウェスタンプロットを行う方法をよく理解しているはずです。SDS ページに使用しているリージョンに注意してください。
ご視聴いただきありがとうございました。あなたの実験に頑張ってください。
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概要
本記事では、わずか500個の造血幹細胞または前駆細胞の解析を目的とした、最適化されたウェスタンブロッティングプロトコルを紹介します。この手法では、サンプルの慎重な取り扱いと、Laemmliサンプルバッファーによる直接溶解を重視しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 造血幹細胞
- ウェスタンブロッティング法
- 細胞タンパク質分析
背景
- ウェスタンブロッティングは、タンパク質分析に広く用いられている手法です。
- 少数の細胞集団を分析することで、動物モデルの必要性を軽減できる可能性があります。
- プロトコルを最適化することで、タンパク質検出の効率を高めることができます。
- 本手法は、希少な細胞集団の研究における課題を解決するものです。
研究目的
- 最小限の細胞数でウェスタンブロッティングを行うためのプロトコルを開発する。
- 造血幹細胞における特定タンパク質の解析を容易にする。
- 研究に必要な動物個体数を削減する。
使用した手法
- 遠心分離へのスイングバケットローターの利用。
- ソート済み造血幹細胞および前駆細胞の遠心分離。
- Laemmliサンプルバッファーを用いた細胞の直接溶解。
- 損失を最小限に抑えるためのサンプルハンドリングの最適化。
主な結果
- このプロトコルにより、20,000個未満の細胞の解析が可能になります。
- 特定のタンパク質を確実に検出できます。
- 実験における動物個体数の削減に寄与します。
- シグナリング経路の研究において有効性が実証されています。
結論
- この最適化されたウェスタンブロッティングプロトコルは、少数の細胞集団に対して有効です。
- 動物の使用量を削減することで、より倫理的な研究実践に寄与します。
- この手法は、造血幹細胞分野における理解を深めることができます。
よくある質問
産業界における重要性
希少な造血幹細胞（HSC）の解析は、サンプルの可用性が限られており、多くの場合で大規模な動物コホートを必要とするため、ターゲット検証における大きなボトルネックとなっています。本プロトコルでは、わずか500個のHSCからの直接的なタンパク質解析を可能にし、検出精度を維持しながら、生物学的ばらつきと動物の使用数を大幅に削減します。細胞入力の閾値を下げることで、ターゲットの存在量やパスウェイの活性化を、生理学的に関連のある低収量集団において確認する必要がある創薬ワークフローの初期段階におけるメカニズム的なリスク低減を支援します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 最小限の投入量で、表現型が定義されたHSCにおける治療仮説の検証を可能にし、標的の存在およびパスウェイ活性化の評価をサポートします。
- 運用の価値： サンプルバッファー中で直接溶解させた、ソート直後の一次細胞を解析することで、細胞増殖に伴うアーティファクトへの依存を低減します。
- 予測的価値： サイトカイン刺激条件下におけるシグナリングノード（例：S6リン酸化、eIF4G）の機能的検証を容易にし、標的調節に対する信頼性を向上させます。
スクリーニングとアッセイ開発
- アッセイの準備状況：SDS-PAGEおよび免疫ブロット法に適合する標準化されたライセートを生成し、細胞入力量にかかわらず再現性のあるタンパク質検出を可能にします。
- 定量的出力：細胞数（500–15,000 cells）での標準化を可能にし、限定的なサンプルにおける用量反応および刺激の比較をサポートします。
- プラットフォームの適応性：標準的な試薬と設備を使用するため、特殊なインフラを必要とせずにラボ間での転用が容易です。
翻訳・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：疾患に関連する造血モデルにおいて、バイオマーカーのような読み取り（例：β-actin、phospho-S6）をサポートし、ex vivoでの知見をin vivoのシグナル伝達へと結びつけます。
- メカニズムによるリスク軽減：初代細胞におけるパスウェイの検証を可能にし、形質転換細胞株による偽陽性を減らし、ターゲット特異性の評価を向上させます。
- 前臨床段階との整合性：少数のHSCから得られたデータは、より大規模な前臨床モデルへスケールアップする前のターゲットエンゲージメント研究に役立てることができます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期の探索から前臨床への移行段階に適しており、特に、バルクまたは拡大集団ではモデル化できない一次細胞のシグナル伝達リードアウトにターゲットバリデーションが依存する場合に有用です。
- 探索生物学：培養によるアーティファクトを伴わずに直接的な溶菌および免疫ブロットを可能にすることで、希少な幹細胞/前駆細胞画分における仮説検証を支援します。
- スクリーニング：分取したHSCにおけるリン酸化状態やタンパク質発現に関する、再現性のあるウェスタンブロットベースのアッセイを可能にし、低スループットのバリデーションに適しています。
- 分析：定量可能で標準化可能な出力（例：細胞500個あたりの信号強度）を提供し、刺激条件や遺伝型間での比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：ex vivoでのシグナリングイベントを造血機能に関連付け、バイオマーカーに基づいた標的評価を支援します。
- 組織的な再利用：本プロトコルは標準的なウェスタンブロットのワークフローを使用しているため、希少な造血細胞群を研究する免疫学、腫瘍学、および再生医療のチームにおいて再利用可能な技術となります。
運用および企業への影響
- 科学的価値：増幅バイアスのない天然の低存在量造血細胞の解析を可能にすることで、ターゲットバリデーションの信頼性を向上させます。
- 運用的価値：低インプットのウェスタンブロッティングにおけるサンプル調製を標準化し、施設間の再現性を向上させ、技術的なばらつきを低減します。
- 戦略的価値：一次細胞におけるパスウェイ変調を確認することでターゲット選択のリスクを軽減し、ターゲットの不整合による後期の失敗を減少させます。
- ポートフォリオへの影響：生理学的に関連のある細胞から得られたメカニズムに基づいたデータによるgo/no-go判断を可能にし、ターゲット優先順位付けにおける資本効率を向上させます。
実施上の検討事項
- 造血細胞のソート、正確な計数、およびサンプルの損失を防ぐための穏やかな溶出に関する専門知識が必要です。
- スイングバケットローターを備えた遠心機、PCRチューブ、および標準的なウェスタンブロット装置（ゲル槽、転写システム、イメージャー）へのアクセスが必要です。
- ユーザー間で上清の除去量と再懸濁量を一定にするため、標準化された操作プロトコルが求められます。
- 他の一次造血細胞または非造血系の希少細胞タイプに適応させる際は、細胞生存率と回収率の変動を考慮する必要があります。
- 実用上の制限：シグナル検出は抗体の感度と標的の存在量に依存します。発現量が極めて低いタンパク質の場合、シグナル増幅やサンプルのプールが必要になることがあります。
