Name: 化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶ化学誘導型DNAヒドロキシメチル化とエピジェネティック改造のための分割型TET2酵素CiDERを用いた手法。この方法は哺乳類細胞における時間的制御を可能にし、エピゲノム研究に貢献します。

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1. 細胞培養、プラスミド トランスフェクションと化学的誘導
<ol>
	<li>文化、付着性のセル (例えば、ヒト胚の腎臓 HEK293T 細胞) の行ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 熱不活化牛胎児血清、100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン 5% CO2と 37 ° C で補われます。</li>
	<li>サイダーのプラスミドを持つセルを transfect します。
	<ol>
		<li>トランスフェクション前に少なくとも 18 h、につき適切な DMEM の 2.5 mL の種子 0.3 x 106セル 6 ウェル プレートでよく、60-80% の confluency に到達する 37 ° C は一晩でセルを孵化させなさい。</li>
		<li>事前のトランスフェクション試薬を使用する前に室温を暖めます。</li>
		<li>生殖不能の管に無血清培地の場所 250 μ L。 注: この金額が 80% の confluency に 6 ウェル プレートに合わせて調整されます。必要な場合、板や細胞数のサイズによると培地量は比例的に調整します。</li>
		<li>サイダー18または TET2 の触媒ドメイン エンコード プラスミドの 2.5 μ g を追加 (肯定的な制御として TET2CD)12,13無血清培地にゆっくりとピペッティングで混ぜます。</li>
		<li>希薄化後の DNA の混合物にトランスフェクション試薬の 7.5 μ L を追加し、軽くピペッティングで混ぜます。</li>
		<li>20-30 分の室温で混合物を孵化させなさい。</li>
		<li>予め温めておいたメディアを変更したり、drop-wise、井戸に混合物を追加し、トランスフェクション試薬と DNA の混合物を均等に分散させる細胞培養プレートを軽く振る。</li>
		<li>細胞との混合物を一晩インキュベートし、2 ml の新鮮な完全な DMEM のメディアを含むトランスフェクション試薬を置き換えます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化学的誘導
	<ol>
		<li>ラパマイシン株式 (DMSO に溶解) 適切な完全培地で 20 μ M の濃度の希釈の 2 mM。</li>
		<li>2 mL 中 200 の最終濃度に到達する維持 transfected セルに希薄ラパマイシンの 20 μ L を追加 nM。 注: 48 時間培養後の細胞、5hmC 世代の定量化や他のダウン ストリーム アプリケーションの準備ができて。必要な場合、誘導効率を細胞以下のとおりさらに 5hmC 定量化のためのすべての 3 h を取ることによって監視および図 1に示すようにできます。</li>
		<li>5hmC 誘導効率のよりよい定量化のため種子は 3 時間おきにセルを監視する井戸を区切ります。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫染色によるラパマイシン誘導 5hmC 生産の定量化
<ol>
	<li>5hmC 免疫蛍光染色 注: は、プレートのすべてのセルをカバーする 3 N HCl で PBS で (トリトン X-100) など 0.2% を界面活性剤 4% パラホルムアルデヒドの固定の解決の十分な量を追加します。たとえば、ソリューションの 500 μ L は 6 ウェル プレートでも十分でしょう。室温ですべての手順を実行します。<ol>
		<li>セルを修正するには、周囲温度で 15 分間ラパマイシン処理細胞を PBS で 4% パラホルムアルデヒドを追加します。コントロール グループのラパマイシン標的治療せず mCherry サイダーを発現する細胞を使用します。揺り動かしてはいけない。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な保護具を着用します。</li>
		<li>固定液を破棄します。細胞膜を permeabilize の 30 分間、PBS の 0.2% を界面活性剤で固定セルを孵化させなさい。</li>
		<li>透過ソリューションを破棄します。グリセリンのセルに 3 N 塩酸を追加し、DNA を変性する 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>PH の中和のため 10 分のセルに対する塩酸追加 100 mM トリス塩酸バッファー (pH 8.0) を破棄します。</li>
		<li>すべてのソリューションを破棄します。洗浄セル、PBS で徹底的に 3-5 回。PBS を徹底的に削除します。 注: は、すべて洗浄ステップの PBS の十分な量を追加します。たとえば、1 mL の PBS は、十分 6 ウェル プレートです。</li>
		<li>穏やかな揺れで 1 時間 PBS で (トゥイーン 20) など界面活性剤の 0.05% 1 %bsa を有しブロック バッファーを追加してセルをブロックします。</li>
		<li>ブロッキング液を破棄します。セルに希釈 5hmC 抗体 (レバレッジ) を追加し、室温で 2 時間または 4 ° C で一晩インキュベート</li>
		<li>3 回 15 分間 PBS のセルを洗浄します。</li>
		<li>希釈した蛍光体 (FITC) を追加-共役二次抗体 (レバレッジ) セルに、1 時間インキュベートします。</li>
		<li>洗浄は PBS のセル 3 回広範囲に残留抗体を削除します。</li>
		<li>5 分削除染色液 250 ng/mL の 4', 6-diamidino-2-phenylindole 核を染色する (DAPI) を追加します。</li>
		<li>共焦点レーザー顕微鏡のための immunostained 細胞をスライドまたはガラス底培養皿をマウントします。代表的な結果は、図 1 bに示されました。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>フローサイトメトリー 注: は、次のプロシージャを汚すの 96 ウェル丸底プレートを使用します。通常、試薬の 150 μ L の各ウェルに十分です。<ol>
		<li>FACS バッファー (1 %bsa、2 ミリメートルの EDTA を用いた PBS) のトランスフェクションとラパマイシン誘導細胞を再懸濁します。コントロール グループのラパマイシン標的治療せずサイダー発現細胞を使用します。</li>
		<li>修正し、手順 2.1 で説明されるように、セルを permeabilize します。</li>
		<li>2 N 塩酸を 10 分の DNA を変性するセルに追加します。</li>
		<li>塩酸 Neutralize を破棄し、ステップ 2.1 で説明されているように、細胞をブロックします。</li>
		<li>セルに希釈の抗 5hmC 抗体 (レバレッジ) を追加し、室温でまたは一晩 4 ° C で 1 時間インキュベート</li>
		<li>FACS バッファーを持つセルを 3 回洗浄します。徹底的に FACS バッファーを削除します。</li>
		<li>希釈した蛍光体 (FITC) を追加-共役二次抗体 (1: 400) 蛍光活性化セル (FACS) 分析を並べ替えのため、室温で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>FACS バッファーを持つセルを 3 回洗浄します。</li>
		<li>サンプルは、FACS 解析のため準備ができています。図 1-Dの代表的な結果を示した。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. ドット ・ ブロット分析 5hmC、5-メチルシトシン (5mC) を定量化する金額
<ol>
	<li>商業 DNA 抽出キットを使用して transfected およびラパマイシン誘導細胞からゲノム DNA を分離します。コントロール グループのラパマイシン標的治療せずサイダー transfected セルを使用します。</li>
	<li>ダブル蒸留 H2O にし、10 分のクエン酸塩ナトリウム (SSC) バッファー x 6 の 80 ° C および事前ソーク硝酸セルロースの膜を真空のオーブンを熱します。</li>
	<li>96 ウェル PCR プレートに等しい量の DNA (TE バッファーの合計 2 μ g) の 60 μ L をロードします。残りの井戸に TE バッファー (10 mM トリス塩酸、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) の 30 μ L を追加します。</li>
	<li>行 1 の行 2 の列の同じ位置に転送してソリューションの 30 μ L で、96 ウェル プレートで垂直方向に 2 倍シリアル希薄を作る。再び混ぜるし、30 μ L のソリューションを境界に達するまで、後続の行で井戸に転送します。</li></ol>最後に 30 μ L を削除します。
	<li>各ウェルに 1 M 水酸化ナトリウムと 10 mM EDTA の 20 μ L を追加、プレート シール、完全に dna を変性する 95 ° C で 10 分間の混合物を加熱します。</li>
	<li>すぐに氷のサンプルを冷やす冷たい 2 M 酢酸アンモニウム (pH 7.0) の 50 μ L を追加し、氷上で 10 分間加温します。 注: 手順 3.7 3.10 は、真空の使用を含みます。</li>
	<li>漬け膜とドットのしみ装置を組み立てるし、完全な真空を使用して残留バッファーを削除します。</li>
	<li>ドットのしみ装置の各ウェルに TE バッファーの 200 μ L を追加することによって、膜を洗浄します。TE バッファーを削除するために真空をオンにします。</li>
	<li>ドットのしみ装置の各ウェルに変性 DNA (前の手順 3.1 3.6 で準備) をロードします。ソリューションを削除するために真空をオンにします。</li>
	<li>真空を使用して完全に SSC と削除の残留ソリューション x 2 の 200 μ L を追加することによって、膜を洗浄します。</li>
	<li>ドットのしみ装置を分解、膜を取り出し、すすぎを 20 mL 2 の全体の膜 x SSC。</li>
	<li>20 分間膜を空気乾燥します。</li>
	<li>2 時間のための真空下 80 ° C で膜を焼きます。</li>
	<li>膜にブロッキング液 (TBST で 5% 脱脂乳) を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>ブロッキング液を破棄します。希釈 5hmC (1:5, 000) または 5mC (1:1, 000) 追加膜に対する抗体と 4 ° C で一晩インキュベート</li>
	<li>残留抗体を削除する 10 分間 3 回 tbst 膜を洗浄します。TBST を徹底的に削除します。</li>
	<li>HRP 標識二次抗体を追加 (1:10, 000 抗家兎 HRP(5hmC) または膜に抗マウス HRP(5mC)) の 1:3,000 し、室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>10 分間 3 回 tbst 膜を洗います。</li>
	<li>ECL ウェスタンブロッティング化学発光検出器を用いた 5hmC 信号の可視化用の膜基板を追加します。図 1Eの代表的な結果を示した。</li>

<ol><li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectv+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133(2014).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li>
<li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+readers+for+5-%28hydroxy%29methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li>
<li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290(2016).</li>
<li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li>
<li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li>
<li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET+family+proteins%3A+oxidation+activity%2C+interacting+molecules%2C+and+functions+in+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex%3A+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15796538">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li>
<li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li>
<li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

ここで我々 は DNA hydroxymethylation の時間的制御を達成するために設計された分割型 TET2 酵素の使用を説明しています。5 methycytosine ジオキシゲナーゼのテト家族の発見、多くの研究を行った TET タンパク質とその主要な触媒製品 5hmC1,2,の3、生体の機能を解読するには 4,5,6,7,8,9,10,<...

DNA のメチル化は大抵 5-メチルシトシン (5mC) を形成するシトシンの炭素 5 位置へメチル グループの付加を指し、DNA メチルのトランスフェラーゼ (種) によって触媒されます。5mC は、しばしば信号転写抑制、x 染色体不活性化とトランスポゾンのサイレンシング1哺乳類のゲノムの主要なエピジェネティックなマークとして機能します。DNA のメチル化の逆転は、10 エルフ転座 (テト) 蛋白質家族によって媒介されます。テト酵素は鉄 (II) に属する、2-オキソグルタル酸依存 dioxygenases 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxycytosine (5caC) 5mC の連続的な酸化を触媒します。テトを介した 5mC 酸化は、哺乳類のゲノム上のエピジェネティックな制御の追加層を課しています。テトの発見は、TET タンパク質の生物学的機能とその主要な触媒製品 5hmC を発表するエピジェネティックな分野に強い関心を呼んでいます。5hmC はテトを介したアクティブな DNA 脱メチル化2,3,4中の中間だけではないが、安定したエピジェネティックな行為が5,6,7,8 をマークするも.DNA hydroxymethylation の変更がいくつかの人間の疾患9,10,11, 因果関係に関連付けられている DNA hydroxymethylation 遺伝子の発現と相関性の異常がエピジェネティック修飾 dna と表現型の間おく確立への挑戦、時空に定義されて正確にゲノムの DNA の変更を削除追加する信頼性の高いツールの不足にすることができます部分的に帰される解像度。
ここで化学誘導性エピゲノム DNA hydroxymethylation および遺伝子のトランスクリプションの間ツールの因果関係の研究が直面しているハードルを克服するために (サイダー) を改造の使用を報告します。デザインが仮定に基づいている TET2 の触媒ドメイン (TET2CD) は、哺乳類細胞で発現したとき 2 つのアクティブでないフラグメントに分割でき、酵素としての働きを化学的に誘導性二量体化アプローチ (によって復元できます図 1 a)。分割 TET2CD システムを確立するには、システイン豊富な地域と二重鎖 β ヘリックス (DSBH) 倍、低複雑さ領域12を欠いている TET2 DNA 複合体の報告された結晶構造から成る TET2CD の六つのサイトを選択します。合成遺伝子ラパマイシン誘導二量体化モジュール FK506 結合タンパク質 12 (FKBP12) およびラパマイシン14,の15割自己ペプチド T2A とともに哺乳類ターゲットの FKBP ラパマイシン結合ドメイン (FRB)ポリペプチド順序16,17は、TET2CD 内の選択した分割のサイトに個別に挿入されました。当社のエンジニア リングの対象として TET2 の選択は、次の考慮事項に基づきます。骨髄性疾患癌10、使用を避けるために敏感なサイトに有用な情報を提供するなどの人間の疾患でしばしば DNA hydroxymethylation の併用削減と TET2 最初、体細胞変異が観測されます。挿入。第二に、複雑性が低い地域では特に TET2 触媒ドメインの大部分は酵素の機能12、こうして誘導エピジェネティック修飾の最小分割 TET2 をクラフトする私たちを有効にするために不可欠です。以上 15 構造をスクリーニングした後哺乳類システムでその酵素活性の高いラパマイシン誘導復元を展示構成は選択、サイダー18に指定します。ここ誘導型 DNA hydroxymethylation およびラパマイシンのエピジェネティックな改造を達成するためにタグ付きの mCherry サイダーの使用を記述し、HEK293T 細胞系における 5hmC のサイダーを介した生産を検証するための 3 つの方法を提示します。

<table><tbody><tr><td>リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>サイエン</td>ティフィック 11668027 <td></td></tr><tr><td>ラパマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37094</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、16% 溶液</td><td>VWR</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Amresco</td><td>0369-500ML</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン、ウシ</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>5-ヒドロキシメチルシトシン (5-hmC) 抗体 (pAb)</td><td>活性モチーフ</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 交差吸着二次抗体、アレクサフルオ 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールド (DAPI)</td><td>ビオチウム</td><td>40043</td><td></td></tr><tr><td>SVAC1E SHEL LABエコノミー真空オーブン、0.6 Cu.Ft.(17リットル)</td><td>SHEL LAB</td><td>SVAC1E</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SSC, 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15557036</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus</td><td>BIO-RAD</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3</td><td>Millipore</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG,HRP結合抗体</td><td>細胞シグナル技術</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td><td>Gendepot</td><td>W3653-100</td><td></td></tr></tbody></table>

化学誘導型 dna hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 tet2 酵素

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA メチル化は、哺乳類のゲノムの安定性と遺伝性のエピジェネティックな修飾と細胞機能を制御する遺伝子発現の調節に関与しています。DNA のメチル化や DNA 脱メチル化の逆転は、dioxygenases の 10-11 転流 (テト) 蛋白質家族によって媒介されます。異常な DNA のメチル化および脱メチル化、発育障害や癌に関連付けられて広く報告されたが、どのようにこれらのエピジェネティックな変化に直接貢献遺伝子発現や疾患の進行の後の変化正確に定義された時間的・空間的解像度でゲノムの DNA の変更を削除追加する信頼性の高いツールの不足が主原因、不明のまま。このハードルを克服するためには、5-メチルシトシン (5mC) の酸化反応の時間的制御と化学物質を追加するだけで哺乳類細胞におけるエピジェネティックな状態のそれに続く改造する分割型 TET2 酵素を設計されています。ここで、哺乳類細胞との 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) の化学誘導生産の定量化に設計された分割型 TET2 酵素に基づく化学誘導性エピゲノム改造ツール (サイダー) を導入するための方法を説明します。免疫染色、フローサイトメトリーやドット ・ ブロット分析。遺伝コードを変更することがなくセルラー システムを尋問でだけでなく、epigenotype−phenotype の関係を様々 な生物系の調査に、この化学誘導性エピゲノムの改造ツールは広い使用を見つけます。

化学誘導 5mC-5hmC 変換は、単一細胞レベルや流れフローサイトメトリー解析 (mCherry 陽性) 細胞集団により定量ドット ・ ブロット法図 1に示すように免疫染色によって検証できます。TET2、または TET2CD の触媒ドメインは、研究を通して肯定的な制御として使用されました。5hmC とクロマチンのアクセシビリティの参照 18 20 ラパマイシンによる変化のゲノム マッピングに関する詳細についてを参照してください。
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図 1: HEK293T 細胞における誘導型 DNA hydroxymethylation のサイダーを介した。分割に基づく化学誘導性エピゲノム (サイダー) を改...

哺乳類細胞化学誘導型 DNA hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素 (サイダー) を導入するための詳細なプロトコルが表示されます。

化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

この一連の実験の全体的な目標は、CiDERと呼ばれる人工的なスプリットTET2酵素を哺乳動物細胞に導入し、ヒドロキシメチル化やエピジェネティックなリモデリングなどのDNA修飾を誘導することです。この手法の主な利点は、操作されたsplit-TET2酵素が5-メチルシトシン酸化の時間的制御と、その後の化学添加物による哺乳類細胞のエピジェネティックな状態のリモデリングを可能にすることです。この手順を開始するには、10%熱不活化FBSと100単位/ミリリットルのペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したDMEMで接着細胞株を培養します。細胞を摂氏37度で5%CO2とインキュベートし、テキストプロトコールに記載されているように、細胞にCiDERプラスミドをトランスフェクションします。次に、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、トランスフェクション試薬含有培地を新鮮で完全なDMEMと交換します。細胞を化学的に誘導するには、2ミリリットルの培地に維持されたトランスフェクション細胞に希釈したラパマイシン20マイクロリットルを加えて、最終濃度200ナノモルに到達します。フローサイトメトリーを行うには、トランスフェクションした細胞とラパマイシン誘導細胞をFACSバッファーに再懸濁します。対照群には、ラパマイシン処理を行わずにCiDER発現細胞を使用します。テキストプロトコルに記載されているように細胞を固定し、透過処理します。次に、2つの正常塩酸を細胞に加えて、DNAを10分間変性させます。テキストプロトコールに記載されているように細胞を中和およびブロックした後、希釈した抗5hmC抗体を細胞に加えます。細胞を室温で1時間、または摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、細胞をFACSバッファーで3回洗浄します。FACSバッファを完全に取り外します。FACS解析用に希釈したフルオロフォア標識二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートします。その後、細胞をFACSバッファーで3回洗浄します。洗浄後、サンプルはFACS分析の準備が整います。市販のDNA抽出キットを使用して、トランスフェクション細胞およびラパマイシン誘導細胞からゲノムDNAを単離します。対照群には、ラパマイシン処理を行わずにCiDERトランスフェクト細胞を使用してください。真空オーブンを摂氏80度に加熱します。ニトロセルロースメンブレンを二重蒸留水に事前に浸し、次に6X SSCバッファーに10分間浸します。次に、60マイクロリットルの等量のDNAを96ウェルPCRプレートにロードします。30 マイクロリットルの TE バッファーを残りのウェルに加えます。96ウェルプレート上で縦に2倍に段階希釈を行い、1行目の30マイクロリットルの溶液を2行目の同じ列位置に移します。再度混合し、境界に達するまで30マイクロリットルの溶液を次の列のウェルに移します。次に、最後の30マイクロリットルをウェルから取り出します。次に、20マイクロリットルの1モルの水酸化ナトリウムと10ミリモルのEDTAを各ウェルに加えます。プレートを密封し、混合物を摂氏95度で10分間加熱して、DNA二本鎖を完全に変性させます。すぐにサンプルを氷の上で冷まします。50マイクロリットルの氷冷した2モル酢酸アンモニウムを各ウェルに加え、氷上で10分間インキュベートします。その間、ドットブロット装置をあらかじめ浸したメンブレンで組み立てます。完全な真空を使用して残留バッファーを除去します。200 μリットルのTEバッファーをドットブロット装置の各ウェルに添加して、メンブレンを洗浄します。真空装置をオンにして、TEバッファを取り外します。次に、変性したDNAをドットブロット装置の各ウェルにロードします。バキュームをオンにして溶液を取り除きます。200マイクロリットルの2X SSCを加えてメンブレンを洗浄し、真空を使用して残留溶液を完全に除去します。ドットブロット装置を分解します。次に、メンブレンを取り出し、20ミリリットルの2X SSCでメンブレン全体をすすぎます。メンブレンを20分間風乾します。膜をさらに乾燥させるには、真空下で80度で2時間焼きます。ブロッキング溶液をメンブレンに加え、室温で1時間インキュベートします。ブロッキング溶液を廃棄した後、希釈した5-hmCまたは5-mC抗体をメンブレンに加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。メンブレンをTBSTで10分間3回洗浄し、残留抗体を除去します。TBSTを完全に除去した後、HRP標識二次抗体をメンブレンに添加します。メンブレンを室温で1時間インキュベートします。メンブレンをTBSTで10分間3回洗浄します。最後に、ECLウェスタンブロッティング基質をメンブレンに添加し、化学発光検出器を使用して5-hmCシグナルを可視化します。ここでは、CiDER を介したフローサイトメトリーによる 5-hmC 産生の代表的な定量結果を示します。ラパマイシン処理条件下でCiDERを発現する細胞のみが、5-hmCレベルの有意な増加を示します。ドットブロットアッセイによる全細胞集団における5-hmCレベルの全球的な変化の代表的な結果をここに示します。ローディング制御は、インプットDNAの総量のエチレンブルー染色によって視覚化されます。この結果は、ラパマイシン処理がCiDER発現HEK293T細胞において5-hmCの強力な産生を誘導し、バックグラウンド活性が無視できることを示しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば1週間で行うことができます。その開発後、この技術は、エピジェネティクスの分野の研究者が遺伝暗号を変更することなく細胞機能を探索し、さまざまな生物学的システムにおけるエピジェネタイプと表現型の関係を調査するための道を開きました。

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EpiMark 5 - HMCおよび5 - MCの分析キットは、5 - メチルシトシンとSPE cific座内5 - hydroxymethylcytosineを分析し、定量するために使用することができます。キットには、（T4 - BGT）β-グルコシルトランスフェラーゼを利用した酵素反応を介して5 - HMCの水酸基にグルコースを添加することによって5 - HMCから5 - MCを区別します。 5 -...

のBalb / Cの脳組織の高感度5 hydroxymethylcytosine検出

説明は簡単で、密度に依存しない濃縮のためのビオチンリンカーを転送するために、クリックケミストリー、続いて5-HMCにアジド-グルコースを転送するために、β-グルコシルトランスフェラーゼ（β-GT）を用いた二段階ラベリングプロセスである。この効率的で特異的標識法は、次世代シーケンシングを介して非常に低いバックグラウンドと高いスループットepigenomicマッピングで5-HMCの濃縮を可能にします。...

ゲノムDNAから5  - ヒドロキシの選択的捕獲

DNA及びタンパク質は、配列特異的親和性またはDNAまたはタンパク質トランスフェラーゼおよび合成補因子類似体を用いた蛍光レポーター基で標識される。酵素の補因子特異​​性に応じて、アジリジンまたは二活性化補助因子アナログは、一次元または二段階標識のために用いられる。...

メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

ここで、紹介タグの付いていない人間の活動の効率的な単一ステップ浄化のためのプロトコル 10 11 転流 2 (TET2) イオン交換クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィー-タンデム質量を使用しての試金を使用して 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼ分析...

10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製

クロマチン環境規制、適切な遺伝子発現に必要な重要なプロセスです。ここでは、クロマチン修飾の採用によって遺伝子発現を制御する手法について述べる遺伝子特異的かつ可逆的に機械。...

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン...

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

新しい配列特異性を有する制限エンドヌクレアーゼは、部分的に縮退配列を認識する酵素から開発することができる。ここでは、NlaIV酵素の配列特異性を変更するために使用した詳細なプロトコルを提供します。プロトコルの主な成分は、転写/翻訳反応のインビトロ区画化と新しい配列特異性を有するバリアントの選択である。...

より厳格な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのインビトロ指向進化

DNAメチルトランスフェラーゼは、潜在的な抗がん剤標的です。ここでは、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害について低分子を評価するためのプロトコルが提示されています。このアッセイでは、エンドヌクレアーゼを利用してDNAメチル化と蛍光生成を結合させ、酵素活性をリアルタイムでモニタリングすることができます。...

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

ここでは、高い、長期にわたる、安定したオンターゲットサイレンシング効率と、低いゲノムワイドなオフターゲット活性を持つ、遺伝子操作された転写抑制因子(ETR)の in vitro...

イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

ここでは、NgTET酵素を使用してバクテリオファージのDNA修飾を低減し、効率的で瘢痕のないCRISPR-Cas変異誘発を可能にするプロトコルを提示します。この方法は、バイオテクノロジーやファージ治療への応用のためのファージの遺伝子工学を容易にします。...

NgTET支援CRISPR-Casシステムによる正確なファージ変異誘発

このプロトコルは、K562細胞における標的エピジェネティック編集のための非統合型エピソームCRISPR/dCas9ベースのシステムを記述し、dCas9-DNMT3AおよびdCas9-HDAC1エフェクターを特定のsgRNAと組み合わせて、遺伝子座特異的DNAメチル化を正確に誘導し、オフターゲット効果を低減します。...

K562細胞のエピジェネティック工学:dCas9-DNMT3Aおよび-HDAC1融合タンパク質を用いた安定な標的DNAメチル化のためのデュアルベクターエピソーム戦略

学ぶ化学誘導型DNAヒドロキシメチル化とエピジェネティック改造のための分割型TET2酵素CiDERを用いた手法。この方法は哺乳類細胞における時間的制御を可能にし、エピゲノム研究に貢献します。

化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素

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