ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 D イメージング

クリア方法最適化されたプロトコルを使用して 3 次元 (3 D) 画像ひと膵臓セクションにパッシブを紹介します。この原稿は、複数の蛍光染色膵島を支配する自律神経・感覚神経回路網の重要な要素を識別するために続いてパッシブ光クリアの手順を示します。

このプロトコルの全体的な目標は、ヒト膵臓組織での使用に適した最適化されたパッシブ光学クリア法を実証することです。この方法は、膵島の神経支配に関する詳細を提供することにより、糖尿病に関連する神経生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、クリアリング法により、高解像度の共焦点イメージングで使用するためのヒト膵臓組織の透明性が確保されることです。

まず、膵臓サンプルを新たに調製した4%パラホルムアルデヒドに入れて固定し、サンプルを摂氏4度で48時間インキュベートします。次に、フラスコを氷の入ったバケツに入れて冷やします。次に、バケツを磁気攪拌板の上に置きます。

フラスコが平らに座っていることを確認し、マグネチックスターバーを追加します。147.8ミリリットルの氷冷蒸留脱イオン水をフラスコに注ぎます。次に、20ミリリットルの0.1モルPBS、20ミリリットルの氷冷40%アクリルアミド溶液、12.2ミリリットルの16%パラホルムアルデヒド溶液、および250ミリグラムのVA-044開始剤を追加します。

ヒドロゲル溶液全体を少なくとも10分間混合します。次に、ヒドロゲル溶液が入ったフラスコの隣の氷に15ミリリットルの円錐管を置きます。14ミリリットルのモノマー溶液をチューブにピペットで移します。

固定および切片化された組織サンプルを1個加えます。次に、チューブにキャップをします。試料をモノマー溶液中で4°Cで3日間インキュベートし、光から保護します。

インキュベーション後、サンプルを氷の上に置きます。次に、ストップコックを介してチューブを窒素タンクに接続します。サンプルを氷上に置いたまま、18ゲージの皮下注射針を慎重に使用して、サンプルの片側が入った円錐形のチューブのキャップを貫通します。

針を液体モノマー溶液の表面の下に来るまでチューブに挿入します。次に、別の18ゲージの皮下注射針を使用してキャップの反対側に穴を開けますが、溶液に沈めないようにして、通気口として機能するようにします。窒素タンクからのチューブをハイドロゲルの下に沈められた皮下注射針に接続し、窒素が液体中を着実に泡立つまでゆっくりとオンにします。

脱酸素されたら、両方の針をすばやく取り外し、キャップをパラフィンフィルムで覆って、チューブと環境との間でガスがさらに交換されないようにします。最後に、サンプルを摂氏37度のインキュベーターに3時間置き、ヒドロゲルを重合します。重合後、残りのヒドロゲルのいずれかを注ぎます。

次に、0.01モルPBSを3〜5回交換して、各洗浄ステップで15分間サンプルを洗浄します。洗浄したら、サンプルを40ミリリットルの入った50ミリリットルのコニカルチューブまたはクリアバッファーに移します。サンプルを37°Cの透明化バッファーでインキュベートし、サンプルを1日おきに新鮮な透明化バッファーに交換します。

適切なクリアリングを確認するには、サンプルを光にかざし、サンプルが光を透過するが、外分泌領域に黄褐色が保持されていることを確認します。クリアされすぎたサンプルは、端がほつれて見え、鉗子でつまむとテクスチャーが非常に柔らかくなります。サンプルが不均一にクリアされるのはよくあることです。

クリアリングバッファーを40ミリリットルの0.01モルPBSと交換し、サンプルを室温で1日60RPMのシェーカーに置きます。バッファーの交換を4〜5回行い、最終的な洗浄を一晩中続けます。次に、2ミリリットルの平底チューブにPACT染色バッファーを調製し、ベースPACTバッファー1ミリリットルに2%正常血清を加えます。

次に、標準量の一次抗体を約5倍に添加して染色バッファーに添加します。スパチュラを使用して、サンプルを洗浄バッファーから取り出し、余分なバッファーをペーパータオルに軽くたたきます。サンプルを一次抗体溶液の入ったチューブに入れ、室温で60 RPMのシェーカーで溶液中で2〜4日間インキュベー

インキュベーション後、抗体溶液を取り出し、0.01モルPBSを添加します。サンプルを60 RPMでシェーカーで完全に洗浄し、新鮮なバッファーに4〜5回交換し、最終洗浄をシェーカーで一晩放置します。次に、2%の血清を添加したPACT染色バッファーに二次抗体を1〜200で添加します。

スパチュラを使用してサンプルを洗浄バッファーから取り出し、余分なバッファーをペーパータオルで軽くたたきます。次に、サンプルを二次抗体溶液の入ったチューブに入れます。サンプルを光から保護しながら、室温のシェーカーで60 RPMの2日間インキュベー

インキュベーション後、抗体溶液を取り出し、0.01モルのPBSと交換します。サンプルを60 RPMのシェーカーで十分に洗浄し、新鮮なバッファーに4〜5回交換し、最終洗浄をシェーカーで一晩放置します。まず、まず11gの非イオン性密度勾配培地を秤量し、50ミリリットルの円錐管に慎重に移して、屈折率一致溶液バッファーを調製します。

次に、スパチュラを使用して 5 ミリリットルの 0.02 モルリン酸緩衝液を添加し、粉末状の非イオン性密度勾配媒体から空気を放出します。必要に応じて、0.02モルのリン酸緩衝液をさらに使用して容量を最大10ミリリットルに上げ、スパチュラで混合し、スパチュラから余分なものをチューブにこすり落とします。バッファーを完全に溶解するまで摂氏37度でインキュベートし、反転させ、定期的に穏やかに混合します。

サンプルを屈折率一致溶液バッファーに移し、光から保護されたベンチで2〜4日間インキュベートしてからイメージングします。イメージングの直前に、少量の屈折率一致溶液を8ウェルカバースリップボトムチャンバースライドに入れます。次に、サンプルをウェルに加え、スライドにキャップをします。

ヒトの膵臓では、膵島は、ベータ細胞、アルファ細胞、またはすべての内分泌細胞について、それぞれインスリン、グルカゴン、および分泌グラナスリーによって描写できます。シュワン細胞は白く見え、内分泌細胞はインスリンまたはグルカゴンのいずれかで染色されていることが示されています。膵島周辺部の血管の横を走る神経は、白い線として浮かび上がり、膵島に伸びています。

ここでは、シュワン細胞と内分泌細胞との接触がはっきりとわかります。ここでは、このビデオに示されている方法で調製したサンプルを血管作用性腸管ペプチドについて染色し、ライトシート顕微鏡を使用してイメージングしました。神経線維は高解像度ではっきりと見られ、手前には管を、背景には神経節を包み込んでいます。

この手順を試みるときは、主要な管や血管がない膵臓腺房領域を使用することを忘れないでください。