Name: ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 D イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学ぶ パッシブ光学クリアリング法を用いた人膵臓の高解像度3Dイメージング。膵島の自律神経と感覚神経ネットワークを可視化し、糖尿病神経生物学研究に貢献します。

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著者は、博士アン フーとジョセフ Canzano のテクニカル サポートと貴重なアドバイスの博士ジェニファー Treweek、博士クリスティン オーバートン、博士 Karl Deisseroth スタンフォード大学わかりやすくワーク ショップを通じて MCT に訓練のためにありがとうございます。JDRF nPOD と臓器調達機関は、組織サンプルを提供しました。この作品は、JDRF (47-2014-1)、ヘルムスレー公益信託 (HCT 2015-PG-T1D052)、MCT に NIDDK 1OT2 TR001773 によって賄われていた。

フロリダ大学治験審査委員会と連邦政府のガイドラインに従ってすべての実験を行った。
注意: パラホルムアルデヒド、アクリルアミドは、有害刺激です。適切な個人用保護具 (白衣、手袋、眼の保護) と発煙のフードで試薬を処理します。
1. ホルマリン固定組織の deparaffinization (新鮮な組織で作業する場合は手順 2 に進みます)
<ol><li>新しいかみそりの刃やメスを使用して、組織の表面に垂直なパラフィンをカットします。それを緩めるまで組織の端にパラフィンをカットします。軽く緩めてをクリアする光学的組織を削除する鉗子やヘラを使用します。へら (図 1 a) を使用して組織から余分なパラフィンを優しくこすり取る。</li>
	<li>キシレン (組織部 3 mm x 3 x 3 約 30 mL) でガラス容器を満たし、室温 (RT) で 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい。</li>
	<li>1.2.1 と同じボリュームと新鮮なキシレンで別のガラス容器を満たしなさい。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい</li>
	<li>1.2.1 と同じボリュームでの円錐管に 100% エタノールを配置します。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい</li>
	<li>1.2.1 と同じボリュームでの円錐管に 95% エタノールを配置します。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい</li>
	<li>1.2.1 と同じボリュームでの円錐管に 70% エタノールを配置します。転送し、室温 24 時間このソリューションで組織を孵化させなさい</li>
	<li>リンスで 0.01 M リン酸組織緩衝生理食塩水 (PBS) と組織、パラフィン (図 1 b、右側のパネル) がしたことを確認、24 時間平衡に円錐管で 0.01 M の PBS の場所。</li>
</ol>2. 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の定着剤を準備します。
<ol><li>16 %10 mL のピペット 50 mL の円錐管に PFA 4 mL 0.1 M PBS を追加し、26 mL 脱イオン蒸留水 (ddH2O) を追加。キャップを閉じるし、一時的に混ぜます。</li>
	<li>4% の大量先行と因数で冷凍は、PFA が行うことができます。4 ° C で 1 週間、-20 ° C で 1 ヶ月、因数は室温 (RT) で 1 日良い</li>
</ol>3. 膵臓固定
<ol><li>作りたての 4% 膵臓サンプル (≤ 1 × 1 × 2 cm) を修正 48 h の 4 ° C で PFA。サンプルが 1 × 1 × 2 cm、小さいに解剖するメスや剃刀の刃を使用するよりも大きい場合は厚さが 1 cm 以上の部分します。少なくとも 15 分 0.01 M PBS の 3 つの変更で組織サンプル各洗浄を洗浄し、0.01 %pfa/0.01 M PBS または 0.5% ナトリウム アジ化/0.01 M PBS で 15 mL 遠心管に使用するまでを格納します。</li>
	<li>固定後に、、さらなる処理のための 1-2 mm 厚いセクションに組織をセクションします。断面も支援するために、vibratome を使用します。 注: セクションの最終的な数が開始のサンプルのサイズによって異なります。</li>
</ol>4. ハイドロゲルにティッシュを埋め込む
<ol><li>次のとおりの 4% アクリルアミド/1% パラホルムアルデヒド (A4P1) ハイドロゲル モノマー溶液 200 mL を準備します。<ol>
<li>電磁攪拌プレートの上にバケツに氷にフラスコを配置します。フラスコは平らに座っているかどうかを確認し、電磁攪拌棒を追加します。</li>
		<li>順序で、次を追加: 250 mg VA 044 イニシエーター、12.2 mL 16 %pfa 溶液、20 mL 冷 (4-8 ° C) 40% アクリルアミド溶液 20 mL 0.1 M PBS 147.8 mL 冷たい (4-8 ° C) ddH2O。少なくとも 10 分のための磁気攪拌棒全体ハイドロゲル ソリューションをミックスし、次のステップのための氷にソリューションを残します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>15 mL コニカル管氷で横に配置ゲル溶液フラスコ。管にピペットのモノマー液 14 mL と 1-2 mm 厚固定ティッシュ サンプルの一枚を追加します。チューブをキャップします。</li>
	<li>モノマー溶液サンプルをインキュベート 4 ° C で 3 日間、光から保護します。割り切れる任意の残りのモノマー ソリューションと将来の使用のための-20 ° C でストア。</li>
</ol>5. ドガ モノマー ソリューションと、ゲルの重合
<ol><li>ガス N28を使用してゲル モノマー溶液から酸素を取り除きます。<ol>
<li>氷のバケツを準備し、氷上ハイドロゲル モノマー溶液サンプルを配置します。</li>
		<li>サンプル、パラフィンの膜、およびタイマーごと 2-3、18 ゲージ注射針を収集します。窒素タンクにチューブを接続し、窒素が流れることができるようにします。氷のサンプルを保ちながら慎重に 1 つの側面のサンプルを含む円錐管のキャップに穴を開けるし、それまでを通して注射針は液体モノマー溶液の表面の下を押します。</li>
		<li>キャップの反対側を穿刺する別の注射針を使用、浸水になることはできません。 注: 2 番目の針はチューブにはけ口をつけるでしょう。</li>
		<li>ヒドロゲルの下に沈め注射針に窒素タンクからチューブを接続し、それが液体を着実にバブルまで窒素ゆっくりに入れます。</li>
		<li>10 分の液体をバブルに窒素を許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>酸素を削除すると、すぐに両方の針を削除し、ガス管と環境の間の任意の一層の交流を防ぐためにパラフィン フィルムとキャップをカバーします。3 h、ゲルの重合を 37 ° C でインキュベーターで脱サンプルを配置します。</li>
</ol>6. 組織クリア
<ol><li>クリア ソリューション (ph 8.5 4 %sds) 500 mL を準備します。DdH2O の ~ 300 mL、電磁攪拌棒で攪拌しながら、50 mL の 0.1 M PBS と 20 g SDS 粉末を追加します。水酸化ナトリウムと塩酸 8.5 を使用してソリューションを調整します。最終巻が 500 mL になるまでは、ddH2O を追加します。</li>
	<li>重合後余分なゲルを垂れ流し、化学廃棄物容器に捨てます。優しくサンプルから離れてハイドロゲルを一掃し、化学廃棄物容器に捨てる紙タオルを使用します。</li>
	<li>0.01 M PBS の 3-5 交流 (化学廃棄物に捨てる洗浄液) のサンプル 15 分各洗浄ステップを洗います。バッファーをクリア 40 mL と 50 mL の円錐管にサンプルを転送します。</li>
	<li>37 ° C でクリア バッファーにサンプルをインキュベートし、他の毎日新鮮なクリア バッファーにサンプルを変更します。<ol>
<li>適切な決済を確保するためにサンプルのサイズ (3 mm × 3 mm × 3 mm サンプル 〜 8 週間) に応じて 2-8 週間のクリアリング バッファー内のサンプルをままにします。</li>
		<li>組織の清算を監視し、完了を停止します。適切な決済を確認する光まで保持することによって、サンプルが十分に透明であることを確認 (通常いくつかの日焼け着色は外分泌腺領域で維持されます)。 注: 過剰消去されたサンプルが端擦り切れ表示され、テクスチャーが鉗子で拾ったとき非常に柔らかくなります。均等にないをクリアするサンプルが一般的です。また、組織は完全に透明 (挿入、図 1) メディアのマウントに配置されるまでできません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 複数の蛍光
<ol><li>40 mL 0.01 M PBS 新鮮なバッファー頻繁 (4-5 バッファー変更、合計 40 mL で洗うたび、最終的な洗浄まですべての時間を変更する) に変更すると RT で 1 日 60 rpm でシェーカーでサンプルを洗います。一晩室温に続ける最終的な洗浄をしましょう</li>
	<li>協定染色バッファーを準備します。500 mL の 0.01 M PBS、アジ化ナトリウム 50 mg、0.5 mL TritonX 100 を追加します。よく混ぜます。</li>
	<li>一次抗体とサンプルをインキュベートします。<ol>
<li>2 mL 平底チューブ内のバッファーを染色基本協定に 2% 正常な血清 (二次抗体として同じ種) を追加 (サンプル/チューブあたり少なくとも 1 mL 容量を推奨)。</li>
		<li>染色バッファー 2% 血清/協定に一次抗体を追加します。(つまり場合は、抗体はの標準的な免疫組織化学、協定の汚損のための使用 1: 100 希釈 1: 500) 標準的な免疫組織化学に使用できる協定の汚損のため約 5 x の一次抗体の量を使用します。</li>
		<li>ヘラを使用すると、洗浄バッファーからサンプルを削除オフ紙タオルの上に余分なバッファーを軽くたたくと一次抗体溶液をチューブ内に配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-4 日 60 rpm でシェーカーの RT で孵化させなさい。0.01 M PBS 新鮮なバッファーを 4-5 回の変更手順 7.1 のように一晩で最終的な洗浄に出入りで 60 rpm でシェーカーの RT でサンプルを徹底的に洗います。</li>
	<li>二次抗体のサンプルをインキュベートします。<ol>
<li>2 mL 平底チューブ内のバッファーを染色基本協定に 2% 正常な血清 (二次抗体として同じ種) を追加 (サンプル/チューブあたり 1 mL 容量を推奨)。</li>
		<li>1: 200 (1 mL バッファーで 5 μ l) の濃度で二次抗体を追加します。 注: 複数の一次抗体を使用している場合、小さいフォーマットの抗体は最寄りと高いクロス吸着抗体です。</li>
		<li>ヘラを使用すると、洗浄バッファーからサンプルを削除オフ紙タオルの上に余分なバッファーを軽くたたくと二次抗体溶液をチューブ内に配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 日間 60 rpm でシェーカーの RT でインキュベートし、光からサンプルを保護します。</li>
	<li>サンプルを徹底的に洗って、一晩で洗う手順 7.1 では、新鮮なバッファーを 4-5 回の変更と決勝を残して 0.01 M PBS で 60 rpm でシェーカーで常温のように、洗浄中に光から守る。</li>
</ol>8. 画像のサンプルを実装
<ol><li>屈折率整合ソリューション (リム) バッファーを準備します。<ol>
<li>非イオン性の密度勾配媒体 (例えば、Histodenz) の 11 g を量りし、慎重に 50 mL の円錐管に転送します。</li>
		<li>〜 5 mL 0.02 M リン酸バッファー (PB)8をへらを使用して粉体非イオン密度勾配媒体から空気を解放するを追加します。 注: ソリューションは非常に粘りがある、よく混ぜます。</li>
		<li>多くの鉛を使用して 10 の mL にボリュームをもたらす、ヘラで混ぜるし、チューブにヘラを過剰をこすり。</li>
		<li>37 ° C 溶解するまでインキュベート リム、反転、優しく混ぜる必要に応じて。</li>
	</ol>
</li>
	<li>リムにサンプルを転送します。これを行うには、1 mL をピペット 2 mL 平底チューブにリムします。ヘラを使用すると、洗浄バッファーからサンプルを削除オフ紙タオルの上に余分なバッファーを軽くたたくとリム ソリューションとチューブ内に配置します。<ol>
<li>リムのサンプルが水没するチューブが軽きます。リムのイメージングの前に 2-4 日間常温の光から保護されてベンチにサンプルを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>画像、8 ウェル coverslip 下部チャンバー スライドにリムの少量を配置します。だけだけで十分なコートの下を追加しよりフローティング逆スコープの画像がより困難にするサンプルの原因となります。井戸の中にサンプルを追加し、イメージング用スライド キャップします。</li>
</ol>9。 画像
<ol><li>共焦点顕微鏡とイメージング ソフトウェア<ol>
<li>使用協定サンプルを染色する蛍光物質の発光スペクトルの励起の適切なレーザーを選択します。チャンネル間のすべての重複が排除され、集録ソフトウェアの設定を調整します。(2 つ fluorophores が付いている同様の励起スペクトル) は、必要に応じて個別のトラックを使用します。</li>
		<li>画像の取得を設定します。<ol>
<li>最大集録速度、16 ビット、4 つ以上の平均値および 1024 × 1024 の解像度を選択するかより良い。</li>
			<li>イメージを作成するオブジェクトをズームインします。 注: これは写真漂白を削減し、ファイル サイズと下流編集減らすも集録時間を減らします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Z スタックをセットアップします。<ol>
<li>使用されている目的のために最適な断面を選択します。デコンボリューションは、後で必要な場合は、z ステップを 1 μ m など最適なより小さいの使用にします。</li>
			<li>Z スタック補正を使用します。<ol>
<li>組織の表面に最も近い開始目的を z 平面を通る焦点を当て、利得を上げるし、訂正を追加します。補正のためのレーザーの設定を変えてはいけない!</li>
				<li>1 つの平均、512 x 512 の解像度、最大集録速度のテスト スタックを取得します。最終的な高解像度の z スタックを取得する前に各色のスタック全体で均一な輝度があることを確認する 3 D でイメージを確認します。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lightsheet イメージング<ol>
<li>サンプルはイメージングの商工会議所で新鮮なリムにサンプルを転送、少なくとも 1 日の商工会議所で平衡することができること、理想的には、少なくとも 24 時間のイメージングのリムで平衡されているを確認します。</li>
		<li>イメージングのサンプルをマウントします。<ol>
<li>サンプルをマウントする最小 (黒) 毛細血管を選択します。</li>
			<li>使用するパテまたは毛細血管の最後にスーパー接着剤を塗布しながらサンプルを保持するために料理します。少しとして可能な限り組織の表面に触れる毛細血管に組織を接着します。</li>
			<li>イメージングのサンプルを挿入します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>5 X、25 X 目標適切なピボットを使用して光学的にクリアされたサンプル スキャン オプションを使用してイメージ。シャドウやぼかしが発生した場合、サンプルを回転やり直して、や続きをリムで平衡にサンプルを聞かせてください。 注: 1 mm スタックは、設定によっては 5 分未満で一般的に取得できます。</li>
		<li>表示および画像解析ソフトウェアを使用して画像のスタックを編集します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

新しい光の清算方法の可用性は、動物モデルで中央の前例のない大規模な試験と末梢神経系を許可しています。ひと膵臓の全体的な神経支配のパターンが主として未踏査組織密度と高品質 biospecimens の取得の難しさのためです。このプロトコルでは、固定またはパラフィン埋め込まれたアーカイブのサンプルからのひと膵臓組織のためのプロトコルをクリア最適化された組織を提供しています。
クリア サンプル サイズ、固定型、期間、保存期間に依存し、次の考慮事項が重要ですので、1-8 週間を必要があります。長期的なストレージ クリア時間が長くなりますので可能であれば 4 %pfa 固定後すぐに組織をクリアすることをお勧めします。クリア時間を最小限に抑えるためハイドロゲル モノマーの PFA の量はひと膵臓に 1% 固定ステップで使用される 4% から減少しました。PFA は、抗原を維持するために十分なゲル剛性を提供するために必要な量、その他の組織、特にマウス臓器の経験的に決定する必要があります。抗体の浸透が悪いクリア組織縮小され二次抗体による染色表面が増加するので、十分なクリアも不可欠です。クリア ソリューションを変更する他のすべての日 (またはも毎日) pH 定数と洗剤を新鮮に保つために最適です。逆に、悪影響をクリア過剰細胞形態に影響を与えるし、組織壊が増加します。以来、いくつかの膵臓サンプルはオフに均等に慢性膵炎の線維化の領域など固有の病態や他の疾患のためには、このプロセスを頻繁に監視することが重要です。Vibratome 厚いセクションの厚さの均一にも使えますまだ必須ではありません。光はサンプルでは、簡単に通過するとすぐにサンプルが洗剤から削除されますので、クリア処理を監視には、サンプルが十分にクリアされることが保証されます。
抗体の侵入と表面の汚損は、協定サンプルで考慮すべき重要な問題です。良い抗体浸透するように、少なくとも 2 日間の一次抗体のサンプルをインキュベートするが重要です。様々 な抗体が異なる拡散率がある個別に最適化する必要があります、ほとんどの抗体の 4 日間は 1 mm3サンプルの完全溶込みの十分な期間。表面の汚損は、問題は場合、Lightsheet イメージングの特にサンプルは、半分にカットする可能性があります。 または染色後表面を離れて解剖。小さなフォーマット抗体利用可能な場合は組織浸透8を支援するために期待されます。Preconjugated 抗体は同じ非クローンだけでなく、動作するように表示されない、非特異的な結合および貧しい組織侵入から高い背景は、まったく動かないかどうかを観察。Preconjugated 抗体を用いた改善成功のため増加血清と染色の TritonX 100 濃度バッファーし長い孵化を使用 (> 4 日間)。汚損の後数日間リムでサンプルの培養が重要です。PBS とリム孵化クリア組織膨潤は、縮小する元のサイズに戻るようになります。Lightsheet イメージングと特にサンプルは、イメージングの前に完全に平衡する必要があります。
イメージングの共焦点顕微鏡のサンプルとき、補正は新しい位置を選択するたびに設定する必要があります。さまざまな買収深さの染色組織全体の変化は、最適なイメージを作成する組織の各領域の調整を必要とします。同様に、使用される二次抗体を慎重に考慮する必要があります。共焦点顕微鏡での排出量をフィルター処理するときに明るい信号を確保するための低励起または排出の重複、fluorophores が付いてを適切に選択する必要がありますスペクトル分離協定のサンプルでは困難です。各アプリケーションの写真漂白なし最高品質の画像を得ることができるように、解像度、イメージング速度とノイズ低減のバランスを打たれなければなりません。1024 x 1024 より高い解像度は人間の目によって検出されていないが、汚れの定量化が必要な場合特定のアプリケーションの必要があります。
光消去技法を選択するとき、他のより伝統的な方法を介して光をクリアを選択するときに考慮すべき多くのものがあります。豊富な低抗原は、抗原の検出に限界がある協定メソッドを使用して検出できない場合があります。免疫学的抗原 (CD3, CD4, CD8,など) などの特定の抗原協定法によって破壊される、にもかかわらず、それらを検出する使用可能な高品質の抗体検出されません。このメソッドのもう一つの制限は、染色をクリア後まで見分けることは困難であるドナーの膵臓間自然な可変性です。オフにし、プロシージャ間同様に汚れがちである各ドナー組織が異なるドナー組織広く様々 なクリア時間と組織形態品質クリア後。これ徹底的に調査されていないが患者の膵臓サンプル数が多いへの十分なアクセスを持つことができます 1 つ場合、アーカイブの組織を使用する能力はこの制限を軽減可能性があります。ここ報告協定プロトコルが安価で容易に標準的な実験装置を使って実装する見つかりました。クリアのサンプル Lightsheet 技術と従来の共焦点顕微鏡と同様 2 光子イメージングに適した、高解像度の神経と人間の膵臓の大部分に島の 3 D 画像を提供します。この手順の将来のアプリケーションには、2 型糖尿病と 1 型の膵島研究外分泌と内分泌の両方のコンパートメントの胎児の膵臓の発達に関する研究が含まれます。

最近まで、大規模な組織や全臓器の 3次元 (3 D) 復興を骨の折れるシリアルセクショニング、染色、および複数のセクションの再構成を行った。これらのメソッドは、大量の連続切片、抗体、および散乱防止組織内深部イメージングの貧しい人々 の組織浸透への依存を含むいくつかの欠点を持っていた。大きい光と抗体浸透できるように、研究者は光散乱の脂質の大部分を除去しながら蛋白質の抗原を維持するために化学的方法を開発しました。複数の関連するメソッドは、堅いイメージング組織の Clear Lipid-Exchanged アクリルアミド ハイブリダイズ ハイドロゲル (透明度)、受動的な明快さテクニック (協定) と灌流支援エージェント リリース原(PARS) (文献1,2 ,3,4,5,6)。わかりやすくメソッドは、ホルムアルデヒド、アクリルアミド、SDS ソリューション2で電気泳動を用いた脂質除去に続いて bis ハイドロゲルを用いたタンパク質の安定化に基づいています。このアプローチ後クリア パッシブ修正され画像7を高度な。さらに最適化は、協定8と呼ばれる手法の最短クリア時間と最適な抗原の安定化を取得する bis の除去とゲル溶液 (1-4%) のパラホルムアルデヒドをさまざまな割合につながった。これらの光クリアの技術を開発する初期の試みには、トランスジェニック マウス モデルで焼入れの内因性蛍光タンパク質や作品に困難であった有機または他の化合物が関与しています。これらの追加メソッドは、スケール、遮るもののない脳/体カクテルおよび計算の分析 (キュービック)、スイッチと Dimensional Imaging of Solvent-Cleared の器官 (ディスコ) メソッドは、さまざまな長所と短所9とすべて含まれて 10、11,12。脂質豊富なマウス脳組織の元の明快さのメソッドを開発し、光の清算方法は、ヒト組織7,8,11,13,14 テスト限られました。.
光の清算方法は、そのままマウスの中枢神経系のように長距離にわたってトレース神経に最適です。膵臓は自律神経・感覚神経系によっても支配されています。膵内分泌コンパートメント、ランゲルハンス島、全体の器官 (1-2%) の非常に小さい部分を構成して、小島はサイズ (50-250 μ m)、内分泌細胞比率と糖尿病 ( 15 の見直しを中心に密度の不均一性を知られています。 ,16)。プロトコルを開発する上でいくつかの光の清算方法は、ひと膵臓を調べたし、協定プロシージャは神経と島の優れた形態温存 (〜 2 週間) をクリアする時間の最適なバランスを提供するために発見されました。最後の最適化手順が記載されて神経島国的なネットワークの大規模な (ミリ波距離) やそのまま複数の膵島の高解像度の 3 D イメージング。手法は、サンプルと同様に、ストレージ中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込まれた後直後固定ひと膵臓または適してです。サンプルは共焦点イメージングのために適しているまたは lightsheet 顕微鏡。

<table><tbody><tr><td>10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>緩衝液</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水ナトリウム</td><td>Fisher</td><td>S375-500</td><td>PB 緩衝液 (RIMS)</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物</td><td>Sigma</td><td>71507-250</td><td>PB 緩衝液 (RIMS)</td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15714-5</td><td>液浸固定、ヒドロゲル、貯蔵solution</td></tr><tr><td>40% アクリルアミド</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>ハイドロゲル</td></tr><tr><td>2% ビスアクリルアミド</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>ハイドロゲル</td></tr><tr><td>VA-044 開始剤</td><td>和光純薬工業(株)</td><td>VA044</td><td>ヒドロゲル</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>フィッシャー</td><td>BP166-5</td><td>クリアリングバッファー</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S8032</td><td>サンプル保存バッファー</td></tr><tr><td>18ゲージ針</td><td>フィッシャー</td><td>14-840-91</td><td>脱気ヒドロゲル溶液</td></tr><tr><td>N2タンク</td><td>エアガス</td><td>各種</td><td>脱気ヒドロゲル溶液</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>100 ml</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>ヤギ、正常血清</td><td>ベクター</td><td>S-1000</td><td>ブロッキングバッファーで 2% として使用</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma</td><td>D2158-100G</td><td>RIMS</td></tr><tr><td>8 ウェルチャンバースライド</td><td>同上</td><td>80827</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>710</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>ライトシート顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>Z1</td><td>イメージング</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Primary Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>Bioss</td><td>bs-4820R-A488</td><td>Host: Rabbit Dilution: 1:100 コメント:</td></tr><tr><td>CD45</td> DAKO が動作しませんでした<td></td><td>M0754</td><td>宿主: Mouse 希釈: 1:200 コメント:</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td>宿主: Rabbit 希釈: 1:50 コメント:</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>BD Biosciences</td><td>565891</td><td>宿主: Mouse 希釈: 1:50 コメント:</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Cell Signaling</td><td>2760S</td><td>ホスト:Rabbit 希釈率:1:200 コメント:動作しなかった</td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>ホスト:Mouse 希釈率:1:200 コメント:作用</td></tr><tr><td>したインスリン</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td>ホスト:モルモット 希釈率:1:200 コメント:作用</td></tr><tr><td>したNCAM (CD56)</td><td>DAKO</td><td>M730429-2</td><td>ホスト:Mouse 希釈率:1:50 コメント: 動作しなかった</td></tr><tr><td>NCAM (CD56)-FITC コンジュゲート</td><td>DAKO</td><td>M730429-2</td><td>ホスト: Mouse 希釈: 1:50 コメント:</td></tr><tr><td>動作しなかった Peripherin</td><td>EnCor</td><td>RPCA-Peri</td><td>ホスト: Rabbit 希釈: 1:100 コメント:</td></tr><tr><td>動作 PGP9.5</td><td>DAKO</td><td>Z5116</td><td>ホスト: Rabbit 希釈: 1:50 コメント: Secretogranin 3 は動作しませんでした</td></tr><tr><td></td><td>シグマ</td><td>HPA006880</td><td>宿主:ウサギ 希釈:1:200 コメント:働いた</td></tr><tr><td>平滑筋アクチン</td><td>シグマ</td><td>A5228;C6198 (Cy5)</td><td>宿主: Mouse 希釈: 1:200; 1:200 コメント: 動作しました。抱合型は非抱合</td></tr><tr><td>型物質P</td><td>BioRad</td><td>8450-0505</td>よりも効果が良かった <td>宿主:Rat 希釈:1:200 コメント:働いた</td></tr><tr><td>チロシンヒドロキシラーゼ</td><td>ミリポア</td><td>AB152</td><td>宿主:Rabbit 希釈率:1:200 コメント:働いた</td></tr><tr><td>チロシンヒドロキシラーゼ</td><td></td><td>Abcam Ab76442</td><td>宿主:Chicken 希釈:1:100 コメント:働いたが、働いた弱い染色</td></tr><tr><td>血管作用性腸管ペプチド (VIP)</td><td>Immunostar</td><td>20077</td><td>宿主: Rabbit 希釈: 1:100 コメント: 働き</td></tr><tr><td>たべく小胞性アセチルコリントランスポーター (VAChT)</td><td>シナプス系</td><td></td><td>139103 宿主: Rabbit 希釈: 1:50 コメント: 働き</td></tr><tr><td>二次抗体</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ギニアブタIgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>各種</td><td>宿主: ヤギ 希釈率: 1:200 コメント: AlexaFluor コンジュゲート</td></tr><tr><td>マウス IgG</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>各種</td><td>宿主: ヤギ 希釈率: 1:200 コメント: AlexaFluor コンジュゲート</td></tr><tr><td>ウサギ IgG</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ック <td>各種宿主: ヤギ 希釈率: 1:200 コメント: AlexaFluor コンジュゲート</td></tr><tr><td>ラットIgG</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>各種</td><td>宿主:ヤギ、ロバ 希釈率:1:200 コメント:AlexaFluorコンジュゲート</td></tr><tr><td>チキンIgG</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>各種</td><td>宿主:ヤギ 希釈率:1:200 コメント:AlexaFluorコンジュゲート</td></tr></tbody></table>

ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 d イメージング

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

従来の組織学的方法を使用して、研究者はイメージ全体に彼らの能力で妨げられる組織や臓器大規模 3 D で。組織切片は、< 20 μ m としてホルマリン固定パラフィン切片スライド ガラスのまたは < 浮遊固定セクション 500 μ m。したがって、広範な努力、シリアルセクショニングとサンプルの 3 D を再現する大規模な画像再構成法に必要な > 500 μ m の従来の方法を使用します。さらに、高分子、特に脂質の組織内からの光の散乱により深度イメージング > 最も共焦点顕微鏡で 150 μ m。光の拡散を抑えると単純な共焦点顕微鏡を用いた深部組織イメージングを可能にするのには、さまざまな光の清算方法が齧歯動物および人間のティッシュのサンプルに関連する固定である浸漬によって開発されています。いくつかの方法は、関連し、アクリルアミドとドデシル硫酸ナトリウム (SDS) とクリア組織タンパク質架橋を使用します。他光クリア技術は、さまざまな長所と短所、各変更に各種溶剤を使用しました。ここでは、ひと膵臓の神経支配の研究、特に膵島の神経支配の尋問、最適化されたパッシブ光クリアする方法を説明します。

これらの染色の手順は、小島と関連付けられたネットワーク自律神経と感覚を調べる人間の膵臓の大規模な検討を提供するために開発されました。透明度7、iDISCO17, を含むいくつかのプロシージャがテストされた、ひと膵臓と共焦点イメージング協定8最高見られる協定方法が適しています。
一次抗体最初でテストされた適切な正と負のコントロールのサンプルとひと膵臓サンプルを固定 (マウスの脳、その他)。一次抗体と推奨希釈は、多くの数および組織のソースによって抗体の希薄を最適化するために各研究室が期待できる、材料表に表示されます。一次抗体のロットごとに変動できる染色強度と、特異性に影響を与えるし、旧試薬と同程度の汚れ輝度を達成するために検証を必要とします。
ひと膵臓の小島が線引きインスリン, グルカゴンおよび secretogranin 3 (図 2)。シュワン細胞はグリア線維性酸性蛋白 (GFAP、図 2および図 3 a) を使用して区切られただった。Lightsheet (図 3 b) の神経副交感神経マーカー血管作動性腸管ペプチド (VIP) に対する抗体で染色をイメージしました。交感神経は、チロシン水酸化酵素 (図示せず) 染色と見ることができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig1.jpg"> 図 1。ひと膵臓の光クリア。(A)かみそりの刃を使用カットしてティッシュ セクションを削除して、(底面) の組織から離れて余分なパラフィンをこする前にパラフィン包埋組織 (最上位のパネル) のセクションを緩めます。(B 左 C 上)前に、とプロトコル] セクションに記載されている、パラフィン埋め込まれたティッシュの(B の右、C の中間)の光クリア後、代表組織サンプルが表示されます。クリア、固定組織は、 (B C トップ)とよく組織をクリアした後は完全に透明ではない腫れすることができます感謝(C、中央のパネル)。クリアされた組織は、リム(C, 下部のパネル)の平衡の後完全に透明になります。スケール バー: 500 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig2.jpg"> 図 2。人間の神経島嶼ネットワーク。ひと膵臓サンプルは、前述の nPOD ドナーやアーカイブのパラフィン包埋組織からクリアされました。(A ~ D)シュワン細胞 (GFAP + 白) と内分泌細胞がステンド グラス (赤) インスリンおよびグルカゴン (緑) で表示されます。(A)共焦点顕微鏡と最大強度投影法 (MIP) 膵周囲血管の横に走ることと、島に拡張の神経シュワン細胞 (GFAP +) のトレースが表示されます。はめ込みは、高解像度, GFAP + シュワン細胞と内分泌細胞間の接触を示しますを示します。(B)パネルの 3 D 画像 (スケール: x = 50 μ m、y = 20 μ m、z = 25 μ m) a.共焦点顕微鏡を介してイメージにパラフィン協定のサンプルと最大強度投影(C)と 3 D (D)を提示、スケール: x, y = 50 μ m、z = 25 μ m)。スケール バー 、C: 50 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56859/56859fig3.jpg"> 図 3. 3次元可視化とステッチします。3 つのステッチの画像のスタックは、シュワン細胞 GFAP と共焦点顕微鏡を用いた染色し、画像解析ソフトウェアで突起トレーサー プラグインを使用してトレースの買収されました。(A)トレースの 3 D の塗りつぶしが表示されます (バーをスケール: x = 150 μ m、y = 200 μ m (0.2 mm)、z = 120 μ m) (B) A 協定サンプル VIP 抗体で染色された、lightsheet 顕微鏡を使ってイメージ化します。スタックが &gt; 高解像度 1 ミリメートルの深さと神経線維が見えます。ダクト (D、フォア グラウンド) と神経節 (G, 背景) を包む繊維を見ることができる (大規模なグリッド: x、y、z = 200 μ m; 目盛: x、y、z = 40 μ m)。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56859/56859fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

クリア方法最適化されたプロトコルを使用して 3 次元 (3 D) 画像ひと膵臓セクションにパッシブを紹介します。この原稿は、複数の蛍光染色膵島を支配する自律神経・感覚神経回路網の重要な要素を識別するために続いてパッシブ光クリアの手順を示します。

ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 D イメージング

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

このプロトコルの全体的な目標は、ヒト膵臓組織での使用に適した最適化されたパッシブ光学クリア法を実証することです。この方法は、膵島の神経支配に関する詳細を提供することにより、糖尿病に関連する神経生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、クリアリング法により、高解像度の共焦点イメージングで使用するためのヒト膵臓組織の透明性が確保されることです。まず、膵臓サンプルを新たに調製した4%パラホルムアルデヒドに入れて固定し、サンプルを摂氏4度で48時間インキュベートします。次に、フラスコを氷の入ったバケツに入れて冷やします。次に、バケツを磁気攪拌板の上に置きます。フラスコが平らに座っていることを確認し、マグネチックスターバーを追加します。147.8ミリリットルの氷冷蒸留脱イオン水をフラスコに注ぎます。次に、20ミリリットルの0.1モルPBS、20ミリリットルの氷冷40%アクリルアミド溶液、12.2ミリリットルの16%パラホルムアルデヒド溶液、および250ミリグラムのVA-044開始剤を追加します。ヒドロゲル溶液全体を少なくとも10分間混合します。次に、ヒドロゲル溶液が入ったフラスコの隣の氷に15ミリリットルの円錐管を置きます。14ミリリットルのモノマー溶液をチューブにピペットで移します。固定および切片化された組織サンプルを1個加えます。次に、チューブにキャップをします。試料をモノマー溶液中で4°Cで3日間インキュベートし、光から保護します。インキュベーション後、サンプルを氷の上に置きます。次に、ストップコックを介してチューブを窒素タンクに接続します。サンプルを氷上に置いたまま、18ゲージの皮下注射針を慎重に使用して、サンプルの片側が入った円錐形のチューブのキャップを貫通します。針を液体モノマー溶液の表面の下に来るまでチューブに挿入します。次に、別の18ゲージの皮下注射針を使用してキャップの反対側に穴を開けますが、溶液に沈めないようにして、通気口として機能するようにします。窒素タンクからのチューブをハイドロゲルの下に沈められた皮下注射針に接続し、窒素が液体中を着実に泡立つまでゆっくりとオンにします。脱酸素されたら、両方の針をすばやく取り外し、キャップをパラフィンフィルムで覆って、チューブと環境との間でガスがさらに交換されないようにします。最後に、サンプルを摂氏37度のインキュベーターに3時間置き、ヒドロゲルを重合します。重合後、残りのヒドロゲルのいずれかを注ぎます。次に、0.01モルPBSを3〜5回交換して、各洗浄ステップで15分間サンプルを洗浄します。洗浄したら、サンプルを40ミリリットルの入った50ミリリットルのコニカルチューブまたはクリアバッファーに移します。サンプルを37°Cの透明化バッファーでインキュベートし、サンプルを1日おきに新鮮な透明化バッファーに交換します。適切なクリアリングを確認するには、サンプルを光にかざし、サンプルが光を透過するが、外分泌領域に黄褐色が保持されていることを確認します。クリアされすぎたサンプルは、端がほつれて見え、鉗子でつまむとテクスチャーが非常に柔らかくなります。サンプルが不均一にクリアされるのはよくあることです。クリアリングバッファーを40ミリリットルの0.01モルPBSと交換し、サンプルを室温で1日60RPMのシェーカーに置きます。バッファーの交換を4〜5回行い、最終的な洗浄を一晩中続けます。次に、2ミリリットルの平底チューブにPACT染色バッファーを調製し、ベースPACTバッファー1ミリリットルに2%正常血清を加えます。次に、標準量の一次抗体を約5倍に添加して染色バッファーに添加します。スパチュラを使用して、サンプルを洗浄バッファーから取り出し、余分なバッファーをペーパータオルに軽くたたきます。サンプルを一次抗体溶液の入ったチューブに入れ、室温で60 RPMのシェーカーで溶液中で2〜4日間インキュベートします。インキュベーション後、抗体溶液を取り出し、0.01モルPBSを添加します。サンプルを60 RPMでシェーカーで完全に洗浄し、新鮮なバッファーに4〜5回交換し、最終洗浄をシェーカーで一晩放置します。次に、2%の血清を添加したPACT染色バッファーに二次抗体を1〜200で添加します。スパチュラを使用してサンプルを洗浄バッファーから取り出し、余分なバッファーをペーパータオルで軽くたたきます。次に、サンプルを二次抗体溶液の入ったチューブに入れます。サンプルを光から保護しながら、室温のシェーカーで60 RPMの2日間インキュベートします。インキュベーション後、抗体溶液を取り出し、0.01モルのPBSと交換します。サンプルを60 RPMのシェーカーで十分に洗浄し、新鮮なバッファーに4〜5回交換し、最終洗浄をシェーカーで一晩放置します。まず、まず11gの非イオン性密度勾配培地を秤量し、50ミリリットルの円錐管に慎重に移して、屈折率一致溶液バッファーを調製します。次に、スパチュラを使用して 5 ミリリットルの 0.02 モルリン酸緩衝液を添加し、粉末状の非イオン性密度勾配媒体から空気を放出します。必要に応じて、0.02モルのリン酸緩衝液をさらに使用して容量を最大10ミリリットルに上げ、スパチュラで混合し、スパチュラから余分なものをチューブにこすり落とします。バッファーを完全に溶解するまで摂氏37度でインキュベートし、反転させ、定期的に穏やかに混合します。サンプルを屈折率一致溶液バッファーに移し、光から保護されたベンチで2〜4日間インキュベートしてからイメージングします。イメージングの直前に、少量の屈折率一致溶液を8ウェルカバースリップボトムチャンバースライドに入れます。次に、サンプルをウェルに加え、スライドにキャップをします。ヒトの膵臓では、膵島は、ベータ細胞、アルファ細胞、またはすべての内分泌細胞について、それぞれインスリン、グルカゴン、および分泌グラナスリーによって描写できます。シュワン細胞は白く見え、内分泌細胞はインスリンまたはグルカゴンのいずれかで染色されていることが示されています。膵島周辺部の血管の横を走る神経は、白い線として浮かび上がり、膵島に伸びています。ここでは、シュワン細胞と内分泌細胞との接触がはっきりとわかります。ここでは、このビデオに示されている方法で調製したサンプルを血管作用性腸管ペプチドについて染色し、ライトシート顕微鏡を使用してイメージングしました。神経線維は高解像度ではっきりと見られ、手前には管を、背景には神経節を包み込んでいます。この手順を試みるときは、主要な管や血管がない膵臓腺房領域を使用することを忘れないでください。

high-resolution-3d-imaging-of-the-human-pancreas-neuro-insular-network

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 D イメージング

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