高スループット、定量的なドットを使用して組織レベルで選択されたタンパク質の含有量の絶対測定のしみの分析 (おっ)
2018年8月21日
ここゲルゾリンのようなの (の CAPG)、3 つの異なるマウス組織におけるアクチン タンパク質をキャッピング標的蛋白質の絶対的なコンテンツを決定することにより定量点のしみの分析 (おっ) の詳細なプロセスを示します。高スループット、定量的、便利 immunoblot 細胞およびティッシュのレベルでのバイオ マーカーの検証法を紹介しています。
この方法は、組織レベルでのELISAと呼ばれることができ、現在の研究室や臨床診断分野で標準となっている、細胞および組織レベルでのタンパク質含有量の従来の相対的な半定量的定量化から距離を置くことができます。この手法の主な利点は、ハイスループット、定量的、絶対の3つの言葉で説明できます。もう一つ言葉を加えるとしたら、それは簡単です。
この手法の意味はプロテオミクス分野にまで及び、バイオマーカーの検証はハイスループット形式で達成できます。この方法は、研究および臨床分野全体に広く応用されています。細胞レベルや組織レベルでのタンパク質量の定量化は、現時点ではまだ原始的な段階にあります。
一般的に言えば、この方法に不慣れな個人は、この技術を学ぶのに問題に直面しず、それは非常に基本的であり、実行するには最小限のラボスキルが必要です。動物モデルを使用して、その信頼性、シンプルさ、および技術の精度を実証できることを嬉しく思います。サンプルは、MP40やTritonなどの界面活性剤の有無にかかわらず、研究室で一般的に使用される任意の溶解バッファーを使用して、従来のサンプル調製方法で調製できます X.In、Triton X溶解バッファーを使用します。
5〜100ミリグラムの組織のスライスを1.5ミリリットルのチューブに入れます。次に、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加した200マイクロリットルの溶解緩衝液を添加します。次に、ホモジナイザーで組織を氷上で1分間均質化します。
次に、サンプルを摂氏4度で8, 000倍gで10分間遠心分離します。上清を新しいチューブに集め、BCAアッセイなどのタンパク質測定キットを使用してタンパク質溶解物中の総タンパク質量を測定するために1マイクロリットルを取り出します。摂氏37度で30分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで562ナノメートルの吸光度を測定します。
このステップでは、標準として既知の濃度の組換えタンパク質を使用して、タンパク質をストック溶液としてマイクロリットルあたり12, 000ピコグラムの濃度に希釈します。その間、調製したサンプルライセートを1マイクロリットルあたり4マイクログラムに希釈します。より信頼性の高い結果を得るには、個々のサンプル間での違いを避けるために、サンプルライセートの混合物を使用することをお勧めします。
標準的なタンパク質と調製したサンプルの両方を、標準的な用量試験のために連続希釈します。BSAは、各サンプルにロードされるタンパク質の量がほぼ等しくなるように補充されました。その後、10マイクロリットルの段階希釈した標準タンパク質またはサンプルライセートを10マイクロリットルの2Xローディングバッファーと混合します。
次に、混合物を摂氏85度で5分間加熱します。この手順では、プレートの底がテーブル表面に触れないように、空のピペットチップボックスをQDBプレートの下に置きます。最大2マイクロリットルのサンプルを、QDBプレートの個々のユニットの下部にあるメンブレンセンターにロードします。
ロード中にQDBプレートの底が表面に触れないようにし、個々のウェルに負荷をかけすぎないようにしてください。私たちの経験では、井戸あたり4マイクロリットル以下です。次に、負荷をかけたQDBプレートを室温で1時間放置するか、負荷を摂氏37度で15分間換気の良い場所に置いておきます。
プレートをブロックするには、QDBプレートをトランスファーバッファーに浸し、10秒間静かに振とうします。その後、QDBプレートをTBSTで3回優しくすすぎ、TBSTでプレートを絶えず振とうしながら5分間洗浄します。その後、QDBプレートをブロッキングバッファーで1時間、絶えず振とうしながらブロックします。
次に、ブロッキングバッファー中の一次抗体を選択した濃度で希釈し、通常の96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルを加えます。QDBプレートを96ウェルプレートに挿入し、組み合わせたプレートを室温で2時間、または摂氏4度で一晩、絶えず振とうしながらインキュベートします。その後、プレートをTBSTで3回やさしくすすいでから、TBSTで毎回3回、絶えず振とうしながら5分間洗浄します。
次に、ブロッキングバッファー中の二次抗体を選択した濃度で希釈し、96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルを分注します。次に、ロードした96ウェルプレート内のQDBプレートを室温で1時間、一定の振とう下でインキュベートします。QDBプレートをTBSTで3回優しくすすぎ、次にTBSTでプレートを3回5分ずつ洗います。
定量のために、ECL基質を調製し、ウェルあたり100マイクロリットルで96ウェルプレートに分注します。次に、QDBプレートを96ウェルプレート内に2分間挿入し、絶えず振とうします。その後、96ウェルプレートからQDBプレートを取り外し、短時間振とうして余分な液体を取り除きます。
その後、プレートを白いマイクロタイタープレートに置きます。次に、マイクロプレートリーダーの電源を入れ、ユーザーインターフェースでカバー付きプレートを選択してから、組み合わせたプレートをマイクロプレートリーダー内に置いて定量化します。間違いを避けるために、カバー付きのプレートを選択してください。
この図は、脾臓、心臓、筋肉、腎臓、肝臓、および前立腺から調製したマウス組織ライセートを用いたウサギ抗CAPG抗体の特異性を示しており、ウェスタンブロット解析を行っています。前立腺、腎臓、脾臓から調製したライセートを使用し、精製された組換えCAPGタンパク質標準を使用したウサギ抗CAPG抗体のQDB分析の線形範囲を定義しました。結果は平均三重でした。
そして、ここに示されているのは、マウスの腎臓、脾臓、および前立腺から調製されたライセート中のCAPGレベルの絶対的な測定です。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、4時間から24時間で完了します。この手順を試みる際には、手順全体で所定の特異的抗体を使用することを忘れないでください。
この手順に続いて、細胞または組織レベルでの個々のタンパク質含有量の絶対測定によってのみ達成可能な追加の質問に答えるために、生物統計分析などの他の方法を実行できます。この技術は、その開発以来、プロテオミクス研究の分野の研究者が、タンパク質バイオマーカーとさまざまな疾患との推定上の関係を集団レベルで探求する道を開いてきました。このビデオを見れば、ハイスループット形式でQDB解析を実行する方法について十分に理解できるはずです。
人間や動物の組織を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に手袋の使用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
概要
この記事では、様々なマウス組織におけるキャッピングアクチンタンパク質、ゲルソリン様（CAPG）の絶対量を決定するための定量的ドットブロット分析（QDB）法を提示します。この技術は、高い処理能力、簡便性、定量的正確性によって特徴づけられ、バイオマーカー検証に適しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- プロテオミクス
背景
- タンパク質定量の従来の方法は多くの場合、半定量的です。
- バイオマーカー検証に効果的な高処理能力技術が必要です。
- QDBは絶対的タンパク質測定のための信頼できる代替手段を提供します。
- 簡単なプロトコルにより、最小限の実験室スキルを持つ研究者にとってアクセスしやすいです。
研究の目的
- 絶対的タンパク質定量のための高処理能力法を示すこと。
- マウス組織におけるCAPGをバイオマーカーとして使用し、技術を検証すること。
- 分野の研究者向けに簡単なプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 従来の溶解バッファーを使用したサンプル準備。
- 組織サンプルのホモジナイゼーションと遠心分離。
- 定量のための組換えタンパク質標準の使用。
- QDBプレートへのサンプルの連続希釈とロード。
主な結果
- マウス組織におけるCAPGレベルの定量に成功しました。
- 様々な組織溶解液を使用したQDB分析の直線的範囲を示しました。
- 結果は複数のサンプルにわたって信頼性と正確性を示しました。
- 正しく実行された場合、技術は数時間以内に完了できます。
結論
- QDBは絶対的タンパク質定量の価値あるツールです。
- この方法はシンプルで、新しいユーザーが素早く習得できます。
- 研究および臨床設定の両方で幅広い応用があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative dot blot analysis (QDB) addresses a critical gap in proteomics by enabling absolute, high-throughput protein quantification at the tissue level, which is essential for biomarker validation and pathway verification. The method provides reliable, reproducible data that supports cross-study comparison and large-scale analysis, reducing mechanistic ambiguity in target validation. Its simplicity and minimal skill requirements facilitate enterprise-wide adoption across discovery and translational workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables absolute quantification of target proteins like CAPG, supporting therapeutic hypothesis interrogation and biological de-risking.
- Operational Value: Uses simple lysis buffers and standard lab equipment, requiring minimal training for consistent execution.
- Predictive Value: Generates linear range data from recombinant standards, improving confidence in target engagement and pathway modulation assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, absolute protein measurements that enable reliable compound screening and dose-response analysis.
- Operational Value: Compatible with 96-well plate formats and microplate readers, supporting high-throughput screening scalability.
- Reuse Potential: Establishes a standardized, transferable assay platform for longitudinal protein monitoring across sample sets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical stages by providing tissue-level protein data relevant to disease models.
- Risk Mitigation: Supports biomarker validation with absolute values, enhancing confidence in target-disease relationships.
- Continuity: Enables consistent protein tracking from early discovery through preclinical validation using the same quantitative method.
Pipeline & Workflow Integration
QDB fits within the discovery continuum by providing absolute protein quantification that informs target validation, enables assay-ready screening, and supports translational continuity through reproducible, quantitative outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through absolute measurement of target protein levels in disease-relevant tissues.
- Screening: Produces standardized, quantitative readouts compatible with high-throughput compound evaluation and hit confirmation.
- Analytics: Generates absolute concentration data (e.g., pg/µL) that allows direct comparison across samples, conditions, and studies.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by providing tissue-level protein data that correlates with phenotypic or clinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable, platform-agnostic capability for protein quantification across projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating semi-quantitative variability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized protocols, blocking, washing, and detection steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing absolute protein data for target prioritization and portfolio triage.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on verified target expression levels in relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoblotting, antibody validation, and protein standard handling.
- Depends on access to microplate readers, incubators, and standard lysis buffers (e.g., Triton X).
- Necessitates cross-team standardization of antibody dilution, loading volumes, and incubation times.
- Adaptation across model systems depends on tissue-specific lysis efficiency and antigen accessibility.
- Practical limitations include the need for validated antibodies and optimization of blocking and washing steps to minimize background.
