線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

この手順の全体的な目標は、C.elegansの生殖細胞からニューロンへの変換を誘導することです。この方法は、細胞運命のリプログラミングの制御におけるシグナル伝達経路やエピジェネティクスなどの生物学的プロセスの意味を調査するのに役立ちます。このビデオで説明されている方法の主な利点は、生きている動物では、運命を誘発する転写因子の過剰発現によって生殖細胞が挑戦される可能性があることです。

並行して、RNAiスクリーニングなどの遺伝子スクリーニングを実施して、細胞のリプログラミングの調節に関与する新規因子を特定することができます。この技術の意味するところは、再生治療にも及びます。なぜなら、このin vivo法は、さまざまな発生条件や環境条件下での細胞のリプログラミングを研究するために使用できるからです。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、再プログラミング手順を学ぶのが難しいため、非常に重要です。なぜなら、生殖細胞からニューロンへの変換表現型は、lin-53が枯渇すると、慎重に制御された条件下でのみ起こるからです。RNAiプレートには、IPTGとカルベニシリンを含むNGM寒天を6cmプレートにロードします。

暗所で室温で24〜48時間乾燥させます。その後、最大14日間、摂氏4度に移します。次に、カルベニシリンとテトラサイクリンを含む線条選択プレートに、lin-53遺伝子を運ぶL4440プラスミドを持つRNAi細菌クローンを作製します。

三相ストリーキングパターンを使用し、空のベクトルコントロールを必ずプレートしてください。次に、プレートを摂氏37度で一晩成長させます。翌日、少なくとも3つの単一コロニーを選び、それぞれを2ミリリットルのLBを別々の培養チューブに接種し、カルベニシリンを補充しますが、テトラサイクリンは補充しません。

条件ごとに3つの健康な培養物を持つことを計画します。次に、培養物を摂氏37度で一晩成長させ、600ナノメートルで0.6〜0.8の光学密度に達するまで成長させます。次に、各細菌培養物500マイクロリットルを6cmのNGM寒天RNAiプレートに加えます。

プレートを室温で暗所で一晩インキュベートします。このプロトコールは、導入遺伝子が最も安定している摂氏15度に保たれたBAT28株の線虫に最適化されています。系統遺伝学の詳細については、本文に記載されています。

ワームの年齢同期は重要です。漂白技術を使用してください。成虫と卵が入った6cmのNGM寒天プレートを800マイクロリットルのM9を使用して洗浄します。次に、遠心分離によってワームをペレット化し、上清を取り除きます。

次に、ワームに1/2〜1ミリリットルの漂白液を追加します。そして、ステレオスコープでワームを観察しながら、成虫が破裂し始めるまでチューブを振ってから、卵を集めます。次に、卵から廃棄物を分離します。

まずチューブを遠心分離し、上清を廃棄します。次に、ティッシュのペレットを800マイクロリットルのM9で3回洗浄します。洗浄の間に組織をプールするために、必ず遠心分離を使用してください。

次に、洗浄した卵をOP50バクテリアを播種した新鮮なNGMプレートに移します。胚の単離が成功し、NGMプレートに移されたかを簡単に確認します。動物を摂氏15度で育てます。

lin-53の枯渇時に生殖細胞からニューロンへの変換を達成するためには、枯渇は親世代から開始する必要があります。lin-53を枯渇させるには、L4動物をRNAiにさらします。1回の複製につき50匹のL4線虫を、バクテリアなしでNGM RNAiプレートに手動で移します。

プラチナ線を使用してください。L4線虫は、腹側の約半分に白い斑点があることで認識できます。次に、ワームを摂氏15度の暗闇で約7日間インキュベートします。

IPTGは光に敏感です。F1の子孫がL3およびL4段階に到達したら、それらをより大きくて厚い親動物から分離します。この時点で、F1で突出した外陰部の表現型をスクリーニングし、lin-53に対するRNAiが成功したことを示します。

RNAi活性は致死率も引き起こし、摂氏15度を超えると増加します。che-1を活性化し、F1子孫の生殖細胞からニューロンへの変換を誘導するために、暗闇の中で摂氏37度で30分間線虫に熱ショックを与えます。ベント式インキュベーターを使用すると、より効率的なヒートショックが可能になります。

ヒートショック後、プレートを25°Cで暗所で一晩インキュベートします。動物がL3中期に達する前に、熱ショックによるche-1の過剰発現を誘発しないことが重要です。これにより、非標的組織にche-1タンパク質が発現する可能性があります。

翌日、蛍光光源とGFPフィルターを設置して、動物が体の中央領域で導入遺伝子由来の蛍光を発しているかどうかを調べます。表現型の浸透度を評価するには、蛍光シグナルを放出する動物の比率を見つけます。通常、約30%は離散的なGFPシグナルを示します。

これに対し、空のベクターRNAiを保有する動物では、生殖細胞系のびまん性シグナルでさえ、集団の5%以上では見られません。突出した外陰部表現型を示すF1動物は、lin-53 RNAiの成功した適用を示しています。これらの動物では、che-1の熱ショック誘導時に生殖細胞がASEニューロン様細胞に転換されるのが一般的です。

綿密な調査では、生殖細胞からのニューロンに典型的なニューロン様の突起が明らかになります。対照的に、空のベクターコントロールはGFPの発現を最小限に示し、せいぜい拡散性でした。これらの動物の生殖細胞には、ニューロンのような特徴がありませんでした。

che-1過剰発現誘導時に動物が若すぎる場合、発育中の外陰部など、体の他の領域で異所性導入遺伝子の発現を示すことがよくありました。このビデオを見れば、生殖細胞をニューロンに再プログラムするために、生きた線虫を用いた実験を慎重に計画し、実施する方法を十分に理解できるはずです。このビデオで説明する方法により、細胞のリプログラミングの制御におけるさまざまな要因の影響を調査することができます。

習得すれば、この手順は10日で完了します。実験を試みる際には、リプログラミングを誘導する前に動物を慎重にステージングし、BAT28株を15度に保つことが重要です。この手順に続いて、ダブルRNAiなどの他の方法を実行して、細胞運命変換中に役割を果たす根本的なメカニズムは何かという追加の問題に対処することができます。