Name: 線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 学ぶ C. elegans の生殖細胞をニューロンに再プログラムする方法。RNAiによるLIN-53除去と熱衝撃誘導型CHE-1発現を用いて、細胞運命転換のメカニズムをin vivoで解明する技術です。

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テクニカル サポート、アリナ ・ ハリーリとマルチナ Hajduskova に感謝します。コメントの Tursun グループのメンバーは、原稿に感謝いたします。この仕事は ERC StG-2014 637530 し ERC CIG PCIG12-ジョージア州-2012-333922 が主催した、ヘルムホルツ協会における分子医学のマックス Delbrueck センターとしています。

動物のケアに関してここで説明したすべてのメソッドは、LaGeSo ベルリン、ドイツによって承認されています。
1. ソリューションの準備
<ol>
	<li>NGM 寒天 (1 L)
	<ol>
		<li>塩化ナトリウム 3 g、ペプトン メディア (例えば、バクト-ペプトン)、2.5 g、寒天 20 g を追加します。コレステロール (95% エタノール入荷 5 mg/mL) の 1 mL を 1 mL の 1 追加、オートクレーブから出した後 M MgSO41 M CaCl2 の 1 mL、1 M K2PO4、25 mL、1 mL アムホテリシン B (2.5 mg/mL 在庫) の。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NGM 寒天 RNAi プレート (1 L)
	<ol>
		<li>塩化ナトリウム 3 g、ペプトン メディアの 2.5 g、寒天 20 g を追加します。オートクレーブ後追加、コレステロール (95% エタノール入荷 5 mg/mL) の 1 mL 1 M MgSO4の 1 mL、1 mL 1 M CaCl2 の 1 M K2PO4の 25 mL、1 mL アムホテリシン B (2.5 mg/mL 在庫) の 1 M IPTG の 1 mL、と 1 mL carbenicillin (50 mg/mL)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 寒天培地 (1 L)
	<ol>
		<li>ペプトン メディアの 10 g を加えて、5 グラム酵母エキス、, 塩化ナトリウム 5 g 寒天、1 M トリス pH 8.0 の 10 mL の 20 g。1 l H2O を追加します。オートクレーブ後、50 mg/mL carbenicillin 1 mL と 5 mg/mL テトラサイクリンの 2.5 mL を追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 培地 (1 L)
	<ol>
		<li>ペプトン メディアの 10 g を加えて、5 グラム酵母エキス、, 塩化ナトリウム 5 g 及び 10 mL 1 M トリス pH 8.0 の。1 l H2O を追加します。オートクレーブ後、50 mg/mL carbenicillin の 1 つの mL を追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>M9-バッファー (1 L)
	<ol>
		<li>ゼラチンの 50 mg, 塩化ナトリウム 5 g、KH2PO4の 3 g の Na2HPO46.0 g を追加します。使用する前に 1 M MgSO4の 1 mL を追加します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>漂白液 (10 mL)
	<ol>
		<li>1 mL NaClO と 5 N NaOH の 2 mL を追加します。10 ml の H2O を追加します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. RNAi プレートの準備
注: c. の elegans線虫成長培地寒天培地 (NGM 寒天)10,11の 7.5 mL を含む 6 cm ペトリ プレートに研究室で培養通常。このプロトコルはワーム 15 ° C で保管に最適です。NGM のプレートを準備、真菌や細菌の汚染を防ぐために標準的な滅菌技術を使用します。以下は、RNAi の試薬を添加した NGM プレートを準備するためのプロトコルです。
<ol>
	<li>1 mM イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) および 50 μ G/ml carbenicillin を含む 6 cm NGM 寒天 RNAi プレートを準備します。暗い12に室温で 24-48 時間乾燥させます。
	<ol>
		<li>暗闇の中で 4 ° C で RNAi プレートを保ちます。14 日を過ぎた場合は使用しないでください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LB 寒天培地プレート 50 μ g/mL を含む利用可能な RNAi ライブラリ13から冷凍のグリセロール ストックから林 53遺伝子の dna 塩基配列と L4440 プラスミッドを含んでいる RNAi 細菌 (大腸菌 HT115) クローンを選択します。carbenicillin と三相光線パターンを使用して 12.5 μ g/mL テトラサイクリン。37 ° C 夜間12時細菌を育てます。このクローンは、IPTG による産生細菌の林 53 dsRNA をことができます。
	<ol>
		<li>さらに、空のベクター コントロール14として任意の遺伝子順序なし L4440 プラスミドを含む RNAi 細菌を育てます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次の日林 53から単一コロニーを選択化やチップ 200 μ L ピペットを使用して空のベクター LB 寒天培地プレート 50 μ G/ml carbenicillin を補充する液体 LB 中14の 2 mL を含む別の文化管にそれらのそれぞれを接種します。600 で光学濃度 (OD) に達するまでに 37 ° C で一晩文化を成長 nm の 0.6-0.8。分光光度計15を使用して外径を測定します。 注意: 液体の LB 媒体は、減少の RNAi 効率12リードを給餌中にテトラサイクリンの包含以来グリセロール ストックから細菌をストリー キング用 LB 寒天培地プレートと対照をなしてテトラサイクリンを含めないでください。</li>
	<li>6 cm RNAi NGM 寒天プレートに、multipipette を使用して各培養 (林 53または空のベクター) 500 μ L を追加します。一晩常温乾燥する暗闇の中で閉じた蓋付きプレートを孵化させなさい。この時間の間に NGM プレートに IPTG は細菌の dsRNA の生産を誘発します。
	<ol>
		<li>細菌培養実験あたりにつき少なくとも 3 プレートを使用します。これは、各実験の 3 技術をレプリケートが提供されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>暗闇の中 2 週間乾燥 NGM 寒天 RNAi 板 4 ° C で細菌を格納します。</li>
</ol>
3.線虫株 BAT28 の作製
<ol>
	<li>ワームひずみ BAT288遺伝子otIs305を含むを維持 [hsp-16.2prom::che-1、rol-6(su1006)] とntIs1 [gcy 5prom::gfp] OP50 細菌 15 ° C で標準 NGM 寒天を使用 注: 線虫文化に詳しいプロトコルは、10を参照してください。Rol-6(su1006)は支配的な対立遺伝子を一般的に使用される典型的なローリング運動を引き起こす表現型インジェクション マーカー16 。OtIs305遺伝子の追跡に使用されますhsp-16.2prom::che-1。<ol>
		<li>維持される活性化を防ぐためにすべての回で 15 ° C で BAT28 株、 hsp-16.2prom::che-1遺伝子。可能な限り多くのひずみを処理しながら 15 ° C 以上の高温への露出を減らします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ワームを年齢同期するには、漂白法17を使用します。
	<ol>
		<li>大人と 900 μ L M9 バッファーを使用して BAT28 の卵を含む 6 cm NGM 寒天プレートを洗浄します。1 分の 900 × g で遠心分離によってペレットのワームは、上澄みを除去します。</li>
		<li>0.5-1 mL のソリューションを漂白を追加、大人のワームが開いてバーストを開始するまで約 1 分の管を振る。標準的な顕微鏡を使用して監視します。</li>
		<li>1 分の 900 × g で遠心分離によってペレットのワームは、上澄みを除去します。</li>
		<li>M9 バッファーの 800 μ L を追加し、900 × g で遠心分離によってワーム餌 3 回を洗浄します。</li>
		<li>新鮮な NGM プレート OP50 細菌とシードに掃除の卵を配置します。15 ° C で OP50 細菌に漂白された人口は、L4 段階 (約 4 日) に達するまでに成長します。L4 の幼虫は、標準的な顕微鏡を使用してワーム18の腹側の約半分の位置の白いパッチが認識できます。 注:林 53の枯渇時にニューロンの変換の表現型の胚細胞を成し遂げるためには、それは親の世代 (P0) に枯渇する必要です。</li></ol></li></ol>次世代 (F1 雑種世代) をうけて変換表現型の得点します。P0 で既に破壊林 53を成し遂げるためには、L4 動物は RNAi にさらされます。
	
	
	<li>あたり NGM プレートに白金線を使用して任意の細菌を含むしないと転送 OP50 細菌からワームを聞かせてする 50 の L4 段階ワームを手動で転送します。ワームの約 5 分のプレートの移動ができます。NGM 寒天 RNAi プレートから使用細菌は以前それぞれの RNAi プレートに転送する林 53 RNAi 細菌 (または空のベクトル制御) でシード。
	<ol>
		<li>実際の RNAi プレートに OP50 細菌を転送しないようにします。15 ° C 以上の高温ひずみの露光時間を最小限に抑えるために高速動作します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>15 ° C で RNAi NGM 寒天プレート上でワームは、ワームの F1 子孫 L3-L4 段階に到達するまで約 7 日間インキュベートします。彼ら明確に分離できる P0 動物から彼らは大きく、F1 子孫よりも厚いので。
	<ol>
		<li>視覚的に標準的な顕微鏡の下で図 1に示すように F1 子孫ワームが突出の外陰部 (pvul) の表現型を示すかどうかを確認します。林 53に対する RNAi が有する多面的効果あり林 53に対する RNAi が成功しているかどうかを評価するために使用できるpvulの表現型を引き起こします。 注:林 53に対する RNAi の F1 胎児の致死率もあります。板が 15 ° C よりも高度にさらされている動物 L3-L4 段階に達した前にこの効果が増大します。死胚は、阻止された開発と孵化の欠如によって認識できます。</li>
		<li>IPTG は光に敏感なので、暗闇の版を孵化させなさい。</li>
	</ol>
	</li>

4. 生殖細胞リプログラミングの誘導
<ol>
	<li>林 53を含んでいる検討の RNAi 版を孵化させなさいチェ 1 をアクティブに暗闇の中で 37 ° C で 30 分間ベクトル RNAi 扱われた F1 子孫を空にします。効率的な熱衝撃を与えるのために出されたインキュベーターを使用します。</li>
	<li>暗闇の中で部屋の温度で 30 分間回復し、暗闇の中で一晩 25 ° C でプレートをインキュベーションして熱ショックによる動物を許可します。</li>
	<li>Gcy 5prom::gfpの GFP フィルターの下の動物を調べる蛍光光源に結合された標準的な顕微鏡を使用して-ワームの中間の本体領域の信号を図 2に示すように、派生します。GFP 信号セット顕微鏡: 励起 488 で最大放出 509 で nm nm。</li>
	<li>寒天パッド含む顕微鏡スライド19の中間体領域に GFP 信号取り付け動物によって生殖細胞ニューロンへの変換からの程度を評価します。
	<ol>
		<li>表現型浸透度を評価するために暗い動物対ニューロン変換する胚細胞を示す動物の数をカウントします。通常、約動物の 30% 離散 GFP 信号で表示林 53枯渇時に生殖動物の 5% 以上空のベクター RNAi に生殖細胞のびまん性 GFP シグナルを表示するのに対し。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), (1987).</li>
<li>Ebrahimi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+barriers+and+enhancers%3A+strategies+to+enhance+the+efficiency+and+kinetics+of+induced+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regen%22%5BJournal%5D)">Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency.</a> Cell Regen. , 1-12 (2015).</li>
<li>Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3-Dependent+Heterochromatin%3A+Barrier+to+Cell+Fate+Changes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Gent%22%5BJournal%5D)">H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes.</a> Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).</li>
<li>Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+C.+elegans+Germ+Cells+into+Specific+Neuron+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types.</a> Science. 331 (6015), 304-308 (2011).</li>
<li>Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+Makes+C.elegans+Germ+Cells+Susceptible+to+Direct+Conversion+into+Specific+Somatic+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types.</a> Cell Rep. , 1-9 (2012).</li>
<li>Etchberger, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+signature+and+cis-regulatory+architecture+of+a+C.+elegans+gustatory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron.</a> Genes Dev. 21 (13), 1653(2007).</li>
<li>Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanylyl+cyclase+expression+in+specific+sensory+neurons%3A+a+new+family+of+chemosensory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors.</a> Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).</li>
<li>Seelk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Notch+signaling+antagonizes+PRC2-mediated+silencing+to+promote+reprograming+of+germ+cells+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Patel, T., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+control+of+terminal+differentiation+and+restriction+of+cellular+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity.</a> eLife. 6, e24100(2017).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4366476">The Genetics of Caenorhabditis Elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71(1974).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Worm+Lab%3A+from+Culturing+Worms+to+Mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), e2293(2011).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_introreversegenetics/introreversegenetics.html">Reverse genetics.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 18 (1), 419357(2000).</li>
<li>Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulators+maintain+totipotency+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Science. 311 (5762), 851-853 (2006).</li>
<li>Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+type-D+GABAergic+neuron+differentiation+by+C.+elegans+UNC-30+homeodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein.</a> Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).</li>
<li>Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+and+the+specification+of+muscle+and+non-muscle+fates+during+postembryonic+development+of+the+C.+elegans+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm.</a> Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).</li>
<li>Ullrich, M., Liang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal+labeling+as+a+tool+to+visualize+and+identify+newly+synthesized+proteins+in+Caenorhabditis+elegans++%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans .</a> Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).</li>
<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_intromethodscellbiology/intromethodscellbiology.html">Methods in cell biology.</a> WormBook. , 1-75 (2006).</li>
</ol>

著者は、競合する利益がないことを宣言しています。

遺伝子組換え線虫を使用して記述されているプロトコル中 BAT28 をひずみし、林 53に対する RNAi は簡単です、一連の手順が順序で重要な神経細胞のリプログラミングに生殖細胞の期待される結果を確保するため。BAT28 ひずみが実験の前にすべての回で 15 ° C で保管されていることが重要です。ひずみの中の処理および保守、15 の ° C の上の温度で時間を可能な限り最小化する必要。適切な熱ショック条件は ASE ニューロン変換する生殖細胞でされませんチェ 1過剰発現の誘導を不十分なので重要であります。これは、プロトコルで説明されているように表現型浸透度を測定することによって検出できます。動物の致死性に広範な熱衝撃を与える可能性があります。例えば、プレートに配置されている内部の壁の近くまたは静的空気インキュベーターの下の地面によく経験豊富な熱処理です。したがって、出された熱インキュベーターを使用することをお勧めします。L3 は、外陰部 (図 3) などの異なる部位のgcy 5prom::gfp異所性誘導につながることができますし、また、熱ショック誘導のタイミングは幼虫段階で以前チェ 1の過剰発現以来重要です9します。 さらに、広範な熱衝撃が 5%、その他の組織、すなわち腸の高められた自己蛍光を拡張する空のベクター RNAi 動物で表現型浸透によって検出できます。
散発的に、RNAi 細菌はターゲット遺伝子の dsRNA を効率的に生成する彼らの活動を失うことができます。残念ながら、これは RNAi 実験する前に検出することはできません。このような場合プロトコルのセクション 2 の説明に従ってグリセロールから新鮮なストリークを栽培する必要があります。まだない RNAi による多面形質pvul表現型は、林 53プラスミド、に対して成功した RNAi によるそれぞれの細菌からの DNA の隔離のように表示する必要があります実行してする必要があります新鮮な HT115 細菌がある場合林 53シーケンスを含む L4400 プラスミドで形質転換。
重要なは、BAT28 株を持って、動物の遺伝子の間に使用されたインジェクション マーカー pRF4 によるローラーの表現型、 hsp-16.2prom::che-1 DNA の構造物。時折、動物を失うを黙らせることができる圧延の表現型、 hsp-16.2prom::che-1遺伝子。BAT28 歪みを正しく維持するため新鮮なプレートに 10 のローラーの動物をピックアップし、動物を圧延のための選択を伝達します。
プロトコルのアプリケーションは、両親 (P0 世代) が林 53 RNAi にさらされていない動物では、ニューロン変換を伴う母体レスキュー4生殖細胞を表示されませんを意味する F1 RNAi プロシージャに限定されます。生殖細胞を神経細胞に変換する代替手順は、 gld 1および転写因子の過剰発現なしmex 3の RNAi ノックダウンを使用して Ciosk および同僚の15によって記述されています。得られたニューロンは、ニューロンの特定の型に属していないし、生殖細胞はまた、 gld 1 mex 3の15の RNAi による枯渇時に筋様細胞に変換します。以前は、それが実証されている林 53に対する RNAi が gaba 作動性ニューロンのような Pitx 型 homoedomain 転写因子チェ 14の代わりに UNC 3016の過剰発現細胞を胚細胞に変換を許可.将来の方向性の林 53枯渇生殖細胞かどうか要因をテストことができます異なる運命を誘発する転写は特定のニューロンより他の細胞型に変換できます。このコンテキストでは、哺乳類 MyoD17の相同、HLH 1 筋 bHLH 転写因子の過剰発現は生殖細胞のリン 53 RNAi5 時に筋肉への変換を誘導します。林 53 RNAi の時に特定の体細胞のタイプと適切な運命を誘導する転写因子の過剰発現に生殖細胞のリプログラミング設立は、さまざまな遺伝的画面の番号を使用できます。このような抑制やエンハンサーの画面は、解離細胞運命変換中に役割を果たす規制経路を助けることができます。

運命は筋の TF MyoD など異所性 TF 式によるリプログラミング細胞筋様細胞の1に直接変換線維芽細胞が何十年も研究フォーカスをされているときに、過剰に発現します。ただし、分化した細胞が細胞の身元を保護メカニズムのため、このプロセスに難治性多い。生殖細胞は保護の類似度を示し、しばしば胚細胞運命誘導 TF の過剰発現時に他の細胞の型変換を防ぐために障壁として機能する基本的なメカニズムがあります。通常は、ヒストンやクロマチン構造などのエピジェネティック制御細胞運命2,3の変換の障害を課しています。以前線虫ノック ダウン RNAi を用いた逆遺伝学を応用して携帯電話の id を保護し、それによってニューロン4に生殖細胞のプログラムし直す対抗する要因を特定します。具体的には、ポリコーム抑圧的な複雑な 2 (PRC2) と非常に節約されたヒストンシャペロン林 53 (CAF-1/RBBP/4/7 人間で) 生殖細胞の線虫におけるグルタミン酸の味神経などの特定の体細胞への直接変換を防ぐ4,5します。 これらの生殖細胞をリプログラミング バリアの要因を識別するために、熱ショック誘導亜鉛指 TF チェ-1 を運ぶトランスジェニック動物を使いました。チェ 1 通常、線虫味覚のグルタミン酸作動性ニューロンの運命と呼ぶ ASE6指定しますの 2 つのヘッド ニューロンで表されます。ASE ニューロンの運命は、ASE 固有蛍光レポーター gcy 5prom::gfpの式で視覚化できます。GCY 5 は化学受容器の ASE 右ニューロン7でしか表現です。RNAi による林 53枯渇と熱ショックによるチェ 1 の広い異所性発現の誘導、生殖細胞は4,5生体内でのニューロンに変換できます。重要なは、RNAi 治療のタイミングは、林 53 RNAi にさらされる唯一の大人のワーム (P0 世代) はニューロン4にプログラムし直すために寛容な生殖細胞を持つ F1 子孫動物に上昇を与えるという非常に重要です。
線虫のニューロン変換プロシージャに上述した生殖細胞はさまざまな細胞運命リプログラミングにおける情報伝達システムの含意など生物学的質問を勉強する使用できます。例えば、林 53に対する RNAi に ASE ニューロンにノッチ シグナル伝達過程で生殖細胞リプログラミング8経路の意義を検討するためにプログラムし直すチェ 1 誘発胚細胞を使用しました。共同林 53とヒストン脱メチル化酵素エンコーディングを破壊する二重の RNAi を実行することによって我々 はノッチ信号 PRC2 を介した遺伝子における生殖細胞系8 UTX 1 の発現を活性化によるサイレンシング経路を打ち消すことを示した遺伝子utx 1.この発見は、このプロトコルで記述されているニューロンに生殖細胞変換を使用してそのまま生物の発達と環境別のコンテキストでの細胞リプログラミングなど複雑な生物学的過程を研究できるを示します条件。さらに、それは過剰発現細胞の可塑性9の制限内での役割を研究したり、生殖細胞へのリプログラミングを誘導するための可能性を評価するために別の運命を誘発する TFs によって生殖細胞に挑戦する視点を提供します他のセルタイプをin vivo。
哺乳類の組織培養こと、細胞運命の再プログラミングのさまざまな側面を学ぶことが、文化で育つ細胞にそのまま生物と比較してシグナル伝達経路の状態を模倣する能力が限られています。したがって、 c. の elegansは、Notch シグナル生体内リプログラミング中など様々 な生物学的プロセスの役割の検査のための汎用的なモデルです。さらに、比較的簡単に維持するために、低コストの変更遺伝子は、遺伝子スクリーニングの強力なモデルです。

<table><tbody><tr><td><ストロング>ケミカル&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>寒天、神戸I</td><td>ロート</td><td>5210.1</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン&nbsp;</td><td>A. Hartenstein GmbH</td><td>211 677</td><td>ペプトンメディア&nbsp;</td></tr><tr><td>酵母エキス&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1552,0100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>USBiological</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck Biosciences</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Roth</td><td>8866.2</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Roth</td><td>4275.3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>K2PO<サブ>4</サブ</td><td>>ロス</td><td>T875.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth&nbsp;</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR</td><td>25,163,364</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>NaClO</td><td>Roth</td><td>9062.3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (5 N)</td><td>Roth&nbsp;</td><td>KK71.1</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>・ロス</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>・ロス</td><td>634412</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>・ロス</td><td>2371.2</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>インキュベーター</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター&nbsp;</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィックC24</td><td>M1247-0052</td>、<td>ヒートショック</td></tr><tr><td>インキュベーター用&nbsp;</td><td>Sanyo MIR-5</td><td>5534210</td><td>15 °C でワーム株の維持に充てられます。C または 25 &deg;C</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>M205 FA</td><td>ライカ</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡(イメージング) + カメラ</td><td>Axio Imager 2</td><td>ツァイス</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡(イメージング) + カメラ</td><td>Sensicam</td><td>PCO</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial菌株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大腸菌HT115</td><td></td><td></td><td>F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG誘導性T7ポリメラーゼ) (RNAse III minus).</td></tr><tr><td>大腸菌OP50&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Uracil auxotroph E. coli strain</td></tr><tr><td>Worm strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.</td><td></td><td></td>N2RNAi Clones</strongとの<td>4倍以上の逆交配によりOH9846から派生</td></tr><tr><td>></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lin-53</td><td>SourceBioscience</td><td>ID I-4D14</td><td>Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12</td></tr><tr><td>empty vetor: L4440</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>#1654</td><td></td></tr><tr><td>その他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワームピック&nbsp;</td><td></td><td></td><td>パスツールピペットとプラチナワイヤーを使用した自作</td></tr></tbody></table>

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする rnai と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

特定の細胞型の id を変換する時に細胞の生物学的過程を勉強して保持し、携帯電話の id を保護機構に重要な洞察を提供します。生殖細胞の線虫の線虫(C. elegans) 特定のニューロンへの変換は、細胞のアイデンティティを保護する規制の経路を分析するために遺伝的画面を実行するための強力なツールです。ASE と呼ばれるニューロンの特定の種類に生殖細胞のリプログラミングできる亜鉛指のトランスクリプションの広範な過剰発現トランスジェニック動物因子 (TF) チェ 1 が必要です。内因性チェ 1 頭 2 つのニューロンのみで表され、 gcy 5prom::gfpレポーターによって可視化することができます簡単に ASE グルタミン酸作動性ニューロンの運命を指定する必要は。熱ショック プロモーターに駆動されるチェ 1遺伝子発現コンストラクトを含むトランス遺伝子は、熱ショック処理全体の動物のチェ 1 の広範な誤式をできます。クロマチン制御因子林 53 と熱衝撃によるチェ 1過剰発現に対する RNAi の組み合わせは、ASE ニューロンのような細胞に生殖細胞のリプログラミングにつながります。ここで RNAi の特定の手順と述べるトランスジェニック動物の熱ショック治療のための適切な条件正常に胚細胞ニューロンへの変換からを引き起こすために。

図 1のように、 pvulの表現型を示す F1 動物は林 53 RNAi の成功のアプリケーションを示しています。これらの動物は、図 2に示すように、生殖細胞のチェ 1過剰発現の熱ショック誘導 ASE 神経様細胞への変換を許可するようになりやすいです。空のコントロールで育ったワームとは対照的 RNAi林 53 RNAi 治療を行えば、中間体エリア説明以前の4,として一晩熱ショックおよび 25 ° C の孵化後の異所性 GFP 信号を表示する動物をベクター8です。 これらのワームを落射蛍光顕微鏡下で綿密に検討を明らかにする (図 2 b、白い矢印) 神経細胞の典型的なニューロンのような突起をも GFP シグナルを表示セルに表示します。林 53に対する RNAi が成功しなかった場合は熱ショック条件が適切な GFP 信号はコントロール RNAi 扱われた動物 (図 2) を似ています。動物半ば L3 段階に到達する前に熱誘導によるチェ 1の過剰発現を誘導する重要なことは、避けてください。図 313に示すように、チェ 1発現誘導の時に幼すぎて動物開発外陰部など体の他の地域で異所性 gcy 5prom::gfp式を表示できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig1.jpg"> 
図 1:林 53 に対する RNAi による Pvul 表現型。(Top)L4/ヤング アダルト ステージ F1 子孫ワームの DIC 画像はコントロールまたは林 53 RNAi 扱われる母親から派生します。スケール バー = 20 μ m. (下) 動物林 53 RNAi 表示突出外陰部 (pvul) 表現型 (黒矢印) で扱われます。Pvulの表現型は、林 53に対する RNAi が成功したことを確認します。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig2.jpg"> 
図 2:ワームを正常にプログラムし直された生殖細胞とニューロン。(A) 空のベクター上に成長した BAT28 ひずみ動物がチェ 1過剰発現の熱ショック誘導後生殖細胞に GFP シグナルを表示しません。白破線は、ワームをについて説明します。スケール バー = 20 μ m. (B)林 53上中間ボディ区域で RNAi 表示gcy 5prom::gfp信号に成長した RNAi 動物空のベクター コントロール上に成長した BAT28 ひずみ動物とは対照的。63 倍の倍率で撮影した GFP シグナルと中間の body セクションの写真では、GFP 陽性細胞 (白い矢印) 突起部を明らかにします。この形態的特徴は、生殖細胞が ASE 神経様細胞への変換を受けたことを示します。白い星印は腸由来の自家蛍光。すべての写真は、20 倍の拡大率と 63 X と落射蛍光顕微鏡を用いた買収されました。白破線は、ワームをについて説明します。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56889/56889fig3.jpg"> 
図 3:異所性 GFP と初期段階ワーム。BAT28 ひずみ動物熱ショック L2 など初期の幼虫段階でチェ 1発現誘導をした空のベクター RNAi 細菌の成長は、半ば本体領域 (白アスタリスク) の GFP 信号を表示します。これらの信号は、生殖細胞のリプログラミング原因ではないです。白破線は、ワームをについて説明します。スケール バー = 20 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56889/56889fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルでは、線虫の体内の細胞運命変換中に細胞プロセスを研究する方法について説明します。観察することができます熱ショック プロモーターに駆動されるニューロン運命誘導転写因子チェ 1 過剰発現と神経細胞のリプログラミング クロマチン制御因子林 53 生殖細胞の RNAi による枯渇のトランスジェニック動物を使用して生体内で。

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

この手順の全体的な目標は、C.elegansの生殖細胞からニューロンへの変換を誘導することです。この方法は、細胞運命のリプログラミングの制御におけるシグナル伝達経路やエピジェネティクスなどの生物学的プロセスの意味を調査するのに役立ちます。このビデオで説明されている方法の主な利点は、生きている動物では、運命を誘発する転写因子の過剰発現によって生殖細胞が挑戦される可能性があることです。並行して、RNAiスクリーニングなどの遺伝子スクリーニングを実施して、細胞のリプログラミングの調節に関与する新規因子を特定することができます。この技術の意味するところは、再生治療にも及びます。なぜなら、このin vivo法は、さまざまな発生条件や環境条件下での細胞のリプログラミングを研究するために使用できるからです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、再プログラミング手順を学ぶのが難しいため、非常に重要です。なぜなら、生殖細胞からニューロンへの変換表現型は、lin-53が枯渇すると、慎重に制御された条件下でのみ起こるからです。RNAiプレートには、IPTGとカルベニシリンを含むNGM寒天を6cmプレートにロードします。暗所で室温で24〜48時間乾燥させます。その後、最大14日間、摂氏4度に移します。次に、カルベニシリンとテトラサイクリンを含む線条選択プレートに、lin-53遺伝子を運ぶL4440プラスミドを持つRNAi細菌クローンを作製します。三相ストリーキングパターンを使用し、空のベクトルコントロールを必ずプレートしてください。次に、プレートを摂氏37度で一晩成長させます。翌日、少なくとも3つの単一コロニーを選び、それぞれを2ミリリットルのLBを別々の培養チューブに接種し、カルベニシリンを補充しますが、テトラサイクリンは補充しません。条件ごとに3つの健康な培養物を持つことを計画します。次に、培養物を摂氏37度で一晩成長させ、600ナノメートルで0.6〜0.8の光学密度に達するまで成長させます。次に、各細菌培養物500マイクロリットルを6cmのNGM寒天RNAiプレートに加えます。プレートを室温で暗所で一晩インキュベートします。このプロトコールは、導入遺伝子が最も安定している摂氏15度に保たれたBAT28株の線虫に最適化されています。系統遺伝学の詳細については、本文に記載されています。ワームの年齢同期は重要です。漂白技術を使用してください。成虫と卵が入った6cmのNGM寒天プレートを800マイクロリットルのM9を使用して洗浄します。次に、遠心分離によってワームをペレット化し、上清を取り除きます。次に、ワームに1/2〜1ミリリットルの漂白液を追加します。そして、ステレオスコープでワームを観察しながら、成虫が破裂し始めるまでチューブを振ってから、卵を集めます。次に、卵から廃棄物を分離します。まずチューブを遠心分離し、上清を廃棄します。次に、ティッシュのペレットを800マイクロリットルのM9で3回洗浄します。洗浄の間に組織をプールするために、必ず遠心分離を使用してください。次に、洗浄した卵をOP50バクテリアを播種した新鮮なNGMプレートに移します。胚の単離が成功し、NGMプレートに移されたかを簡単に確認します。動物を摂氏15度で育てます。lin-53の枯渇時に生殖細胞からニューロンへの変換を達成するためには、枯渇は親世代から開始する必要があります。lin-53を枯渇させるには、L4動物をRNAiにさらします。1回の複製につき50匹のL4線虫を、バクテリアなしでNGM RNAiプレートに手動で移します。プラチナ線を使用してください。L4線虫は、腹側の約半分に白い斑点があることで認識できます。次に、ワームを摂氏15度の暗闇で約7日間インキュベートします。IPTGは光に敏感です。F1の子孫がL3およびL4段階に到達したら、それらをより大きくて厚い親動物から分離します。この時点で、F1で突出した外陰部の表現型をスクリーニングし、lin-53に対するRNAiが成功したことを示します。RNAi活性は致死率も引き起こし、摂氏15度を超えると増加します。che-1を活性化し、F1子孫の生殖細胞からニューロンへの変換を誘導するために、暗闇の中で摂氏37度で30分間線虫に熱ショックを与えます。ベント式インキュベーターを使用すると、より効率的なヒートショックが可能になります。ヒートショック後、プレートを25°Cで暗所で一晩インキュベートします。動物がL3中期に達する前に、熱ショックによるche-1の過剰発現を誘発しないことが重要です。これにより、非標的組織にche-1タンパク質が発現する可能性があります。翌日、蛍光光源とGFPフィルターを設置して、動物が体の中央領域で導入遺伝子由来の蛍光を発しているかどうかを調べます。表現型の浸透度を評価するには、蛍光シグナルを放出する動物の比率を見つけます。通常、約30%は離散的なGFPシグナルを示します。これに対し、空のベクターRNAiを保有する動物では、生殖細胞系のびまん性シグナルでさえ、集団の5%以上では見られません。突出した外陰部表現型を示すF1動物は、lin-53 RNAiの成功した適用を示しています。これらの動物では、che-1の熱ショック誘導時に生殖細胞がASEニューロン様細胞に転換されるのが一般的です。綿密な調査では、生殖細胞からのニューロンに典型的なニューロン様の突起が明らかになります。対照的に、空のベクターコントロールはGFPの発現を最小限に示し、せいぜい拡散性でした。これらの動物の生殖細胞には、ニューロンのような特徴がありませんでした。che-1過剰発現誘導時に動物が若すぎる場合、発育中の外陰部など、体の他の領域で異所性導入遺伝子の発現を示すことがよくありました。このビデオを見れば、生殖細胞をニューロンに再プログラムするために、生きた線虫を用いた実験を慎重に計画し、実施する方法を十分に理解できるはずです。このビデオで説明する方法により、細胞のリプログラミングの制御におけるさまざまな要因の影響を調査することができます。一度習得すれば、この手順は10日で完了します。実験を試みる際には、リプログラミングを誘導する前に動物を慎重にステージングし、BAT28株を15度に保つことが重要です。この手順に続いて、ダブルRNAiなどの他の方法を実行して、細胞運命変換中に役割を果たす根本的なメカニズムは何かという追加の問題に対処することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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線虫生殖細胞のニューロンへの細胞運命リプログラミング

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学ぶ C. elegans の生殖細胞をニューロンに再プログラムする方法。RNAiによるLIN-53除去と熱衝撃誘導型CHE-1発現を用いて、細胞運命転換のメカニズムをin vivoで解明する技術です。

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

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