カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

この手法の全体的な目標は、ハイスループットアッセイでモデル生物C.elegansに対するさまざまな化合物の影響をテストすることです。この方法は、特定の化学構造がC.elegansの寿命を延ばすかどうかなど、化学、生物学、老化の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、多数の化合物を時間効率よく迅速にスクリーニングできることです。

多数の線虫を産生するための大量培養プレートを調製するには、層流キャビネット内で、まず摂氏60度の線虫増殖培地寒天の30ミリリットルを10センチメートルの培養プレートに分注し、一晩固化します。翌朝、2ミリリットルの濃縮大腸菌を各プレートに加え、プレートを傾けて回転させ、細菌をプレート表面全体に完全に広げます。大量培養プレートが乾燥したら、摂氏4度で最大2週間保存してください。

スクリーニング用のハイスループットアッセイ培養プレートを調製するには、自動化された8チャンネルディスペンサーを使用して、0.15ミリリットルの溶融線虫増殖培地寒天を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。寒天が一晩固まるのを待ちます。その後、ハイスループットアッセイプレートを摂氏4度で最大2週間保存します。

C.elegansの培養物をセットアップするには、ワームピックと解剖顕微鏡を使用して20個の卵を各大量培養プレートに移し、プレートを摂氏20度で6日間インキュベートします。7日目に、解剖顕微鏡を使用して子宮内の卵子の存在を視覚的に確認します。妊娠した成虫を採取するには、ガラスピペットを使用してプレートあたり2〜3ミリリットルのS基礎溶液を追加し、各プレートの周りの溶液を手で渦巻かせます。

ガラスピペットを使用して、線虫を15ミリリットルのチューブに移し、遠心分離によって線虫をペレット化します。ワームを10ミリリットルの次亜塩素酸塩溶液に再懸濁し、チューブを5秒間上下に急速に振る。次に、2.5分ごとに振とうしながら、ワームを室温で5分間インキュベートします。

インキュベーションの終わりに、ワームを再度遠心分離機にかけます。ペレットは黄褐色である必要があります。上清を10ミリリットルの新鮮な次亜塩素酸塩溶液と交換し、チューブを再度激しく振ってください。

ワームをさらに1〜3分間インキュベートし、時々振ってください。卵だけが残ったら、チューブを遠心分離し、上清を吸引します。ペレットは白で、茶色の着色はありません。

滅菌技術を使用して、滅菌層流キャビネット内のチューブを開き、各ペレットに14ミリリットルのS基礎溶液を追加します。ペレットを14ミリリットルのSバサールで3回洗浄します。遠心分離による3回の洗浄後、卵を2〜3ミリリットルの新鮮なS基礎溶液に再懸濁します。

L1期幼虫C.elegansを調製するには、上清をチューブごとに1つの滅菌ガラスシャーレに移し、2〜3ミリリットルのS基礎溶液を使用して、チューブから残りの卵を各ディッシュにすすぎます。各ディッシュに5ミリリットルのS基礎溶液を追加して混雑を緩和し、ディッシュを摂氏20度、20rpmのオービタルシェーカーに16〜24時間置いて孵化を促進します。すべての孵化したばかりの子ガメは、餌が不足しているため、最初の幼虫の段階で逮捕されます。

血清学的ピペットを使用して、L1幼虫を15ミリリットルのチューブに移し、遠心分離します。すべての孵化したL1が遠心分離と吸引を繰り返して固められた後、幼虫ペレットを10ミリリットルの滅菌S基礎溶液で再懸濁します。次に、10マイクロリットルを播種されていないプレートに移し、プレート上に存在する幼虫の数を数えます。

これを10回繰り返して、溶液中のL1の平均密度を求めます。滅菌血清ピペットを使用して、L1sを含む溶液の総量を測定します。次に、L1 溶液の体積と溶液中の L1 の密度を使用して、溶液中に存在する L1 の総数を計算します。

96ウェルのハイスループットアッセイプレートで線虫をプレートするには、L1懸濁液を無菌の丸い培地ボトルで1マイクロリットルあたり1匹のL1幼虫に希釈し、適度にゆっくりと回転する攪拌子を装備し、アッセイプレートを室温まで温めます。次に、層流キャビネットで、各ウェルに5マイクロリットルの濃縮大腸菌を追加し、続いてウェルごとに10マイクロリットルのL1懸濁液を追加して、ウェルあたり平均10匹のワームを生成します。すべてのワームがメッキされたら、プレートを覆い、ワームを摂氏25度で2日間インキュベートして、幼虫が成虫に成長するのを待ちます。

インキュベーションの終了時に、ケミカルライブラリープレートを凍結から室温まで上げます。解凍したプレートをマイクロプレートシェーカーで60rpmで使用直前に1分間静かに振とうします。自動化された96ウェルリキッドハンドラーを使用して、0.75マイクロリットルの化合物をライブラリープレートからアッセイプレートに移します。

すべてのウェルを処理したら、層流キャビネット内のプレートの表面から化合物を4〜8時間風乾し、乾燥したらすぐに個々のプレートを取り出します。乾燥させたプレートを透明フィルムで密封し、蓋をします。次に、プレートを1000Gで45秒間回転させ、摂氏25度の逆さの位置で保存します。

目的の化合物に対するC.elegansの応答をテストするために、ネガティブコントロールプレートを使用して、コントロール動物の95%が死亡するまでの全生存率をスコアリングできます。その時点で、すべてのテストプレートをスコアリングできます。例えば、この研究では、179種類の化合物の再試験ライブラリから57件のヒットが観察され、再試験化学物質の32%が陽性であったことが示されています。ネガティブコントロールウェルとテストウェルの平均生存率スコアのビニングは、テストウェルがコントロールウェルを上回ったことを示しました。

50マイクロモルおよび100マイクロモルの濃度の試験化合物を使用したこの代表的な試験アッセイで実証されたように、小規模なスクリーニングも実施することができる。陰性対照で処理した動物の99%以上が死亡した場合に、これらの小型スクリーンアッセイ試験プレートを再採点すると、陽性対照井戸は陰性対照井戸および試験井戸をはるかに上回り、試験井戸は陰性対照群よりもわずかに優れた性能を発揮したことが示されました。この実験では、後者の結果は、多くの試験井戸が対照処理と比較して毒性を示すように見えるという指摘によって偏り、それによってこの単純な解釈を混乱させました。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、2〜4週間で完了できます。この手順を実行するときは、アッセイプレートの完全性を維持し、使用する前にアッセイプレートが手付かずの状態であることを確認することが重要です。この手法に従うと、これらの化合物のどれがマイトファジーを誘発するかなど、追加の質問に答えることができますか?

マイトファジーアッセイには、マイトファジーレポーター鎖が使用されます。このビデオを見れば、C.elegansをモデル生物として使用してハイスループット化学スクリーニングを行う方法についてよく理解できるはずです。