Name: カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶC.elegansを用いたハイスループット化合物スクリーニング法。96ウェルプレートで高密度培養し、長寿効果を評価する迅速なプロトコルです。老化研究や化学バイオロジーへの応用が可能です。

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テクニカル サポート、Dipa Bhaumik、アーロン ミラーとボブ ・ ヒューズに感謝します。系統は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。ジョージア州の森と有益な議論のリスゴー、Kapahi、および Melov ラボのメンバーに感謝しております。ミリリットルは、国立衛生研究所 (NIH) 訓練グラント T32 AG000266 と、エリソン医療財団/アメリカ連合の加齢研究博士課程の親睦によって支持されました。この作品は、BioAge 研究所からの助成金によって支えられた、国立衛生研究所と同様に、ラリー ・ l ・ ヒルブロン財団補助金付与 UL1024917、Geroscience と G.J.L. に 1R01AG029631 01A1 に関する学際的研究コンソーシアムをサポート

1. バッファーを準備します。
<ol><li>
流体培養基 LB
	<ol>
<li>予混合顆粒 (表を参照) を使用し、製造元の準備のためのプロトコルに従います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
線虫成長メディア (NGM) 寒天培地
	<ol>
<li>ミックス 23 の寒天の g、塩化ナトリウム 3 g、2.5 g バクト ペプトンのし 0.972 L. オートクレーブに脱イオン水と 60 ° C に冷ます、1 mL の 1 M 硫酸マグネシウム (MgSO4) 25 mL の 1 M カリウム リン酸 (KPO4) バッファー (pH 6.0) 追加、1 M 塩化カルシウム (CaCl2) 1 mL と 5 mg/mL (エタノール) でコレステロールの 1 mL。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
次亜塩素酸
	<ol>
<li>5 M コ、5 mL の次亜塩素酸ナトリウム溶液 (6%)、および脱イオン H2O 50 mL の容量に 4 mL を混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
基底 S
	<ol>
<li>K2HPO4、6 g の KH2PO4と 1 L、オートクレーブ、脱イオン水の 1 g, 塩化ナトリウム 5 g を混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 集中エシェリヒア属大腸菌(OP50) の準備
注: この手順には、25 mL の S の基底バッファーにエシェリヒア属大腸菌飽和溶液 1 L が集中しています。
<ol><li>エシェリヒア属大腸菌 (ひずみ OP50) の単一コロニーと流体培養基 LB オートクレーブ (ステップ 1.1) の 5 mL を接種して、37 ° C (250 rpm) を振動で 4-6 時間孵化させなさい。この溶液 0.1 mL を使用して、ポンドの 1 L を 2 L の三角フラスコに接種します。1 L フラスコ一晩 (12-16 h) 37 ° C (250 rpm) を振動で孵化させなさい。</li>
	<li>遠心 10,000 × g と、細菌を餌し、離れての残りのメディアをデカントする 4 ° C で 5 分間 500 mL 遠心ボトル 1 L 一晩文化。S 基底 (手順 1.4) 25 mL にペレットを再懸濁します。4 ° C でのストア</li>
</ol>3. NGM 培養皿の準備
<ol><li>ワームの大規模な番号を生成するために使用、大衆文化板は、層流の流体自動塗布装置や血清ピペットで 10 cm 培養皿にキャビネットの溶融 (60 ° C) NGM 寒天 (ステップ 1.2) の 30 mL を分配します。一晩乾燥させてください。</li>
	<li>ピペット 2 mL を傾斜して回転、平板寒天培地の表面を完全にカバーに広がる各 10 cm プレート集中 OP50 プレート乾燥を許可します。2 週間までの 4 ° C でプレートを格納します。</li>
	<li>高スループット スクリーニング用アッセイ培養皿流内閣で 96 well プレートの各ウェルに溶融 NGM 寒天 0.15 mL を分注する自動 8 チャネル ディスペンサーを利用します。使用注意してください井戸は、井戸でアッセイを妥協するワームの穴を掘る泡を欠いています。一晩乾燥させてください。2 週間までの 4 ° C でプレートを格納します。</li>
</ol>4. 温度感受性 (ts) 滅菌線虫大量文化の準備
<ol><li>転送の 20 卵を解剖顕微鏡の下で 'ワーム選択' (接続されている白金線または製造されたワームにガラス ピペットを選択) を使用して文化を開始する (TJ1060 をひずみ: spe-9 (hc88) 私; 3.1 の手順で作製した培養プレートに rrf-3(b26)II)。20 ° c のプレートを 6 日間、インキュベート (成長の複数の世代移動 20 卵の子孫のコレクション対象にできる)。</li>
	<li>視覚的に解剖顕微鏡を用いた妊娠大人 (子宮に卵) の存在を確認します。S プレート ガラス ピペットを使用して基底の 2-3 mL を分注して妊娠の大人を収集します。プレートの周りの液体を手で旋回し、ガラス ピペットを使用して 15 mL チューブに液体を収集します。</li>
	<li>ワーム、ペレット、上清を吸引しダウン チューブ (20 ° C で 1.5 分 1,000 x g) スピンします。ワームのペレットに 10 mL の次亜塩素酸溶液 (手順 1.3) を追加し、急速に揺れ 2.5 分ごと 5 分間 5 s. 加温の上から下の方向に手でチューブを振る。</li>
	<li>また、スピン ダウン チューブ (1.5 分、1,000 x g);ペレットは、黄色がかった茶色にする必要があります。上清を離れて吸い出しなさい。10 mL の次亜塩素酸溶液を加える卵ペレットとチューブを積極的に振る。1 〜 3 分、時折振動と解剖顕微鏡で外観を監視しながらインキュベートします。目視確認だけの卵されているため、次の手順に進みます。</li>
	<li>スピン ・ ダウン チューブ (1.5 分 1,000 x g) と上清を離れて吸い出しなさい。ペレットはない茶色の着色と白する必要があります。 注: 次亜塩素酸溶液の除去後って重要な汚染から滅菌テクニックとバッファーを使用する (細菌、真菌、特に) 無駄に貴重な時間と試薬、実験を台無しにすることができます。本研究では、フィルター層流キャビネットを使用し、滅菌ピペットとヒントのみを使用して液体を移動します。</li>
	<li>無菌空間でチューブを開きます。S で 3 回ペレットを基底、スピン (1.5 分、1,000 x g) ダウンと吸引離れて上澄みするたびに洗ってください。再度 2-3 mL の S の基底に卵ペレットを中断します。これらの卵は、L1 幼虫 (手順 5) を収集するためにバッファーに一晩ハッチのため今すぐ使用できます。</li>
</ol>5. (L1 幼虫c. の Elegansを準備する) 同期のカルチャを取得するバッファーへの線虫卵を孵化
<ol><li>カバー付き滅菌ガラス シャーレに卵ペレットとバッファーをデカントします。2-3 ml の S の基底の血清ピペットを使用して皿にチューブから残りの卵をすすいでください。(ベリー ダンサー軌道シェーカー 20 rpm) の揺れをつけるように、これは孵化を促すことがありますので、混雑を緩和するため基底 S の 5 mL を追加します。卵ハッチ (16-24 h) 時間を許可するように 20 ° C で一晩インキュベートします。食品の不在のためすべて孵化 1st幼虫 (L1) で逮捕します。 注: 逸話的な証拠は、新鮮な L1 準備 (採卵後 16 36 h) 生成成虫の最も同期集団であることを示します。</li>
	<li>血清ピペットで 15 mL チューブに l1 を収集します。遠心分離機 (1.5 分 1,000 x g) でスピンダウンすると l1、離れて、上清を吸引し、S の 10 mL の次のステップの根元を残しながら、板を孵化から収集されたすべての l1 まで繰り返します。</li>
	<li>L1 を含むチューブ、マイクロ ピペット (混合) 後すぐに 0.01 mL を出てし、シードされていない上に分配 (ない大腸菌) NGM プレート。プレート上の l1 の数をカウントします。10 回繰り返すし、各因数で l1 の数の平均値を求めます。一般に、(起動時 20 卵を含む 1 の大量培養プレート) は μ L あたり 1-3 l1 間期待します。</li>
	<li>血清ピペットの S の基底、l1 を押しのボリュームを決定します。L1 の総数を推定するため、前の手順で取得した、0.01 mL 当たりワームの断固としたな数の平均値を推定します。一般に、(大衆文化プレート 20 卵を含む) ごとの 10,000-30,000 l1 間期待します。</li>
	<li>96 ウェルの分析で、この文化を使用するには、滅菌ラウンド メディア ボトルに μ 1 L1 L1 懸濁液を希釈し、手順 7 に進みます。追加の生成に使用する場合はこの文化c. の elegans文化を大量、手順 6 に進みます。</li>
</ol>6. 大規模な同調培養準備
注: L1 ソリューションは、迅速にワームの人口を増加する使用できます。
<ol><li>L1 ソリューションとワームの大規模な番号を生成するには、各大量培養皿の数で最大 5,000 l1 を分配します。4.1-2 の手順で説明するように妊娠大人 2.5 日後 (20 ° C) を収集し、卵を収集する 4.3 の手順に進みます。</li>
	<li>ピッキング卵ので次亜塩素酸治療、残りの人口を服従させる前に伝播の複数の次亜塩素酸コレクションすることができます征服された人口を強調、分割した集団が繰り返しそれ逸話的に観察されているよう繰り返し、人口の世代は次亜塩素酸溶体化処理する対象ではありません。</li>
</ol>7. 96 ウェル アッセイ プレートのセットアップ
<ol><li>部屋の温度に到達する (手順 3.3 で準備) アッセイ プレートを許可します。その後、流キャビネットの各ウェルに集中 OP50 (2.2 の手順で準備) の 5 μ L を追加します。以前のように、自動の 8 チャネル ディスペンサーを使用します。</li>
	<li>自動 8 チャネル ディスペンサーを使用して各ウェルに L1 懸濁液の 10 μ L を追加します。これは懸濁液に 1 μ L あたり L1 で存在しているので好評につき、平均 10 ワームになります。スラリーから l1 の平等な分配を促進するため、積極的に適度にゆっくりと回すと混合ラウンド メディア ボトルから l1 を調剤攪拌棒。</li>
	<li>カバー プレートのバッチをボックス, 蓋付きプレートと 2 日間の 25 ° C で孵化させなさい。</li>
</ol>8. 1 st日アダルト線虫化学物質での治療
<ol><li>冷凍庫から化合物ライブラリー プレートを外し、続行する前に部屋の温度に達するまでプレートを許可します。 注: 化学ライブラリ プレート前述のように、すべてが同じ濃度で、DMSO に溶解し、各ウェルで離散化合物を含む 96 ウェル プレートです。これらのライブラリは、外側の列を使用しないし、各プレートは最大 80 の異なる化学物質。ここで説明したプロトコルでライブラリ濃度は 10 mM です。それは表現型に及ぼす溶媒効果を考慮することが重要です。DMSO 濃度 0.5% でスクリーンをこの検討、一方このレベルをこれらの寿命の試金、低スループット アッセイ、複合原液濃度を選択する可能性が高く、決して超えています。このプロトコルは、寿命変更が行われない16、少なくとも N2 ひずみレベルである 0.25% を超えない。</li>
	<li>軽くプレートを使用する前にすぐに 1 分のマイクロ プレート シェーカーで 60 回転で振る。</li>
	<li>またはを使用して、自動 96 ウェル液体ハンドラー、化合物の転送 0.75 μ L (DMSO) アッセイ プレートにライブラリ プレートから。液体ハンドラーのピペット チップ (ワームや手順 7.1 から集中 OP50 で寒天培地の表面に液体の ~ 15 μ L を 0.75 μ L のボリュームを提供しているように、慎重にアッセイ プレートに液体の配信中にピペットの深さを制御します。-2)、よく寒天表面を貫通していないと。非常に小さな画面でを除いてマニュアル 8 または 12 マルチ チャンネル ピペットを使用しないでください (< 10 皿)、彼らはエラーとアッセイを妥協する寒天表面の穿刺の結果にしばしばを増やすことができます。</li>
	<li>テスト対象ライブラリは、溶媒として DMSO を使用する前提に dmso (ジメチルスルホキシド) 化合物ライブラリー ネガティブ コントロール プレートを準備します。試験板 10 の負の制御板まですべての 5 の 1 のネガティブ コントロール プレートを作る。可能であれば、また肯定的な制御プレートを作る (NP11 20 mM、0.1 mM の最終測定濃度ではこの目的のため、効果的な代表結果セクションを参照してください)。彼らは特に乾燥しやすい、プレートの 2 外柱に化学薬品 (テストや制御) を追加しないでください。</li>
</ol>9. 乾燥文化
<ol><li>寒天の表面から液体を削除するには、4-8 h のキャビネットの層流板を乾燥します。これらのプレートは完全に乾燥させますが、枯らしていないかが重要です。いくつかのプレートは、他の人よりも乾燥に時間がかかりますとすべてのプレートを密接に監視し、乾燥するいるとすぐを削除します。プレートの個々 の井戸を視覚的注意による乾燥を確認します。 注記: キャビネットの排気速度を含む要因によってこれにかかる時間必要があります経験的に決まります。この乾燥のステップが完全キャビネット用約 4-8 時間かかります。</li>
	<li>透明フィルムとプレートをシールし、プレート蓋に置きます。</li>
	<li>45 96 ウェル アッセイ プレートをスピン 1,000 x g で s。</li>
	<li>25 ° C で反転店プレート</li>
</ol>10 長寿のための得点のc. の Elegans文化
<ol><li>まで負の制御板を監視 > 95% 死亡率が観察されます。その後数週間、毎日毎週の最初の 2 つの板を確認してください。同じひずみと種の線虫コホート試験17によって寿命が大幅に異なるを表示できます。 注: 記載されている、25 ° C で培養 TJ1060 動物と寿命の試金のためこれらの人口の 95% の死亡率が成人の日 16-20 から発生しました。</li>
	<li>陰性対照の井戸に達していると認められるとき、> 95% をマーク、45 のすべての 96 ウェル アッセイ プレート スピンダウンをテーブル トップ遠心分離機 s 適応ローター (250 x 45 g s 20 ° c)。</li>
	<li>制御板のすべての井戸をスコアします。これは、カウントし、各ウェルで生きていると死んでいる動物の数を記録します。死んでワームは、動きの完全な欠如によって生きている虫から区別できます。任意の誘発電位の接眼レンズをのぞきながら解剖顕微鏡表面に約 7 cm から 96 ウェル プレートをドロップすることによって生きているワームの動きを誘発します。死んでワームが応答しないと、近くの研究室仲間が反復的な雑音を認めるかもしれない。</li>
	<li>テスト プレートのカウント、生きた虫体を含む井戸のみを記録します。ライブのワームを観察すると、よく位置とプレートと一緒に、よくすべての生きていると死んでいる動物を数えます。 注: それはしばしば後プレートを再獲得する有用 > ネガティブ コントロール ワームの 99% は死んだ。大型画面で初期スコアリングを行う最高のポイントがあります。いずれの場合も、スコア/再-score 前述のように</li>
</ol>11. 化合物の再テスト
<ol><li>候補化合物の数が少ないをテストするとき (< 320 化合物)、再テストまたは候補画面 (代表的な結果を参照してください)、アッセイを 32 の中央の井戸に可能なプレートの影響を最小限に抑えるために制限します。これは、未処理、寒天、食物、およびワームを含むまだプレートの端に最も近い 2 の井戸を残します。</li>
</ol>

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<li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307 (5707), 258-262 (2005).</li>
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</ol>

著者は、この作業を支援資金のエンティティは、データや結果の分析を公開する決定のコレクションにない任意の入力を持って宣言します。

ここで 96 ウェル プレートで線虫を培養するための簡単な方法を説明しました。これらの化学物質のスクリーニングと寿命試金で使用するための文化について述べるが、多くのタイプの試金のため使用することができます。ここで説明アッセイ寿命分析10を含むいくつかの方法と異なるは、化学物質のスクリーニングのためのウェル培養条件は以前報告された8をされています。寿命試金をここで説明 96 ウェル プレートを利用して、(化学殺菌) ではなく不稔突然変異に依存している、寒天培養条件を使用して、単純な液体、ワームを移動する処理を使用して、エンドポイントでのスコアは手動で。これらの条件を記述するメソッドをスクリーニングを探している研究者にヘルプのこの試金で使用されるさまざまな方法があります。
この議定書の重要な要素は、アッセイのため、材の質に主にセンターします。まず、板を作るときは、寒天培地の表面が泡やその他の欠陥の自由が不可欠です。寒天表面におけるこれらの変化は、ほとんど常に穴を掘ると井戸の損失に します。第二に、このプロトコルは、セットアップと薬漬けにする段階で作製した液体を乾燥に依存します。これらの液体が完全に削除が、寒天は乾燥になってないが重要です。逸話的に、それは (液体の水泳) を完全には井戸のワームに乾燥表示されます乾燥とワームの穴を掘ると損失につながる寒天の割れにつながるプレートの過剰乾燥しながら適切に乾燥井戸より長く生き続ける。このプロトコルの別の重要な要素は、無菌状態を維持です。任意の寿命のアッセイでは、多くの作業板セットアップに関与して、落ち着く、プレート上に成長する汚染を台無しに試金のため多くの機会と時間が存在します。
ここで説明した寿命アッセイは線虫の化合物のスクリーニングに役立つ、だが特定の遺伝的背景に限定使用温度感受性 (ts) の不稔系統;高い不稔浸透度のある TJ1060 を使用しました。これはこの方法でのスクリーニングに有用菌を制限します。希望の背景にts不稔突然変異を横断、化学滅菌を使用してなどの代替アプローチします。我々 は、このアッセイで化学滅菌を試していませんが、それは可能なはず。潜在的なハードルは、ワームに殺菌剤を配置する適切な用量で適切な段階であります。説明されたプロトコルはここで高速ですが、大人を効果的に分配するが表示されない液体ディスペンサーを使用します。だから、これらのワームは皿の上開発し、したがって、プレートで化学滅菌では治療する必要があります。至適投与量を決定してタイミングが成功のため重要となります。大人を動かすことができる調剤法を用いた代替戦略が含まれます。過去には、我々 は、識別し、大人を並べ替えすることができるマシンが中断された幼虫の均質なスラリーを分配することができます単純な液体ハンドラーより一般的にはるかに遅いことを発見しました。
一般に、寿命に大きな肯定的な効果は急速にスクリーン化学物質やトリートメントにこのメソッドを使用します。メソッドは複数の用量で使用する場合に特に効果的、高番号を複製し、常に保持され、テスト プレートの中に散在する否定的なコントロールの監視を終了します。ポジティブ コントロールまた設計および本稿で説明した画面を実装するときに便利です。ただし、効果的な正には、コントロールはかなり強力なおよび/または非常に堅牢なする必要があります。画面が最初に展開したときに適切に強力かつ堅牢な化合物を識別できませんでした。現在、多くのレポートにあるポジティブ コントロール可能性が高い候補者の '老化' 文学ここで説明画面で役に立ちます。この原稿の期待される結果の候補画面セクションと図 2および表 1に説明した、複合 NP1 はこの画面の効果的な肯定的な制御。我々 は一般的に 3 mm 培養皿上の標準的な寿命試金とこれらの画面から肯定的なヒットを確認します。

ここでのプロトコルは、線虫の寿命に及ぼす影響の化合物のスクリーニングのために開発された説明します。プロトコル自体は、レポーター線虫株を利用した研究を含む他の表現型の画面に容易に適応可能であります。このプロトコルは NP1 新規生理活性化合物を識別するために正常に利用された (ニトロフェニル-ピペラジン 1)、強く食餌療法の制限のメカニズムを線虫の寿命を拡張します。NP1 と遊びで、遺伝経路の説明を含む、寿命への影響の評価が以前いた別の場所1を説明。そのレポートには、画面の大規模な実装の結果の説明も含まれています。ここより詳しく方法論と述べる自体は、画面の設定両方の小規模および大規模アプリケーションのスケーラブルであります。
ここで説明したプロトコルの作成をもたらした目標は、新規生理活性化合物の大規模化合物ライブラリーのスクリーニングに使用できるc. の elegans文化のプラットフォームを開発することでした。化学の画面は、このプロトコルの開発の前に行われている間これらは主に小規模だったおよび/または型候補に近づく2,3。確かに、ほとんどの化合物の数十のラボで実施画面は長寿効果4上映されてヒットでストレス抵抗性アッセイを利用しました。この研究はしよう寿命効果画面の直接代わりに。驚くことに、線虫と大規模な化学の画面を実行する時に科学文献の少数の記述があった。線虫を用いた大規模化学スクリーニング画面5,6、7の他のタイプに比べると、確かに、雇用の下に見えたの。
線虫でのこのアプローチの開発の基礎として使用された大規模な化学画面の 2 つの記述があった。これらの最初の化学の画面を使用して動物の開発を混乱させることができる化合物を識別するピーター ロイの研究室からエレガントな研究だった。研究は、これらの化学物質8遺伝子の標的を識別する前進突然変異誘発スクリーンでフォロー アップ.その研究で説明されているプロトコルは、この調査の特定のニーズ (ライブラリと限られた利用可能なインキュベーター空間で化学の限られた量) に単に実行可能ではなかった 24 ウェル パテを使用しました。他の研究は、化学物質9,10を拡張する寿命のためマイケル Petrascheck の革新的で野心的な小分子の画面だった。その研究は、384 ウェル プレートと液体培養に使用されます。この画面の他の主な特徴は、化学的に子孫の生産を阻害する FUDR (5 フルオロデオキシウリジン) の使用をだった。かなりの研究に記載されているプロトコルの検討後、化学滅菌と線虫の液体培養は避けた。
FUDR は、線虫の寿命実験で広く使用されますが、FUDR は予期しない薬物相互作用を引き起こす可能性がありますまたはその FUDR 自体が寿命に影響していることの懸念があった。最近この後者の懸念は検証されて、少なくともいくつかの濃度で、特に 25 ° C11時。子孫の汚染の問題を回避するためにc. の elegans菌株 TJ1060 を使用した、2 つの独立した温度敏感な突然変異を隠し持っている (spe-9 (hc88) 私は精子の生産を廃止し、有用であることが実証されている rrf-3(b26)II);同期集団12マスのカルチャ。この株は 25 ° C で完全に滅菌が 15-20 ° C で培養の子孫が生成されます。この調査は、ワームの液体培養で得られた結果は常に従来の寒天版で再現するいないと、寒天培地の表面にクロールを従来の培養条件を使用しました。この現象は完全に理解されていませんは、ワームが標準メディア13,14上で培養したワームとは異なる方法で DR (食事制限) に液体対応培養を実証されています。したがって、液体メディアが画面で特定されていくつかの DR の模倣をマスクがもっともらしいです。
寒天培養条件で定着した、この試金の井戸の性能を得点のさまざまなオプションが考えられていた。様々 な自動またはイメージング ベースの試金は利用可能でしたが、彼らは獲得と技術的に困難なほとんどが法外に高価なデバイスの展開を必要とします。これらのオプションを検討しながら、すべてのタイプの以前の寿命の画面を参照してくださいに不可欠でした。最終的には、寿命の表現型15Siu シルビア ・ リー ラボの全ゲノム RNAi スクリーニングから適応手法を用いた。具体的には、すべて寿命プレートが同じ方法でセットアップされたが、否定的なコントロールだけを監視しました。ネガティブ コントロール プレート近く完全な死亡が確認され、一度テスト プレートを手で獲得されました。この大規模な画面で陽性は、主な陽性の繰り返しを 3 通を使用して作りたての化学薬品と再テストによって確認されました。

<table><tbody><tr><td>LBブロスミラー顆粒VWR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ユニペンス&nbsp;</td><td>ウィートン・サイエンス・プロダクツ</td><td></td><td>自動液剤分注装置</td></tr><tr><td>96ウェルアッセイプレート。COSTAR 3370</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop 384; 自動 8 チャンネルディスペンサー</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>製造ワームピック</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Stovall Life Science inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートシェーカー;MTS 2/4 デジタル</td><td>イカワークス株式会社&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動化された96ウェルリキッドハンドラー。Biomek FX リキッドハンドラー</td><td>&nbsp;ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動96ウェルリキッドハンドラー。ベンチトップピペッター&nbsp;</td><td>ソレンソン・バイオサイエンス(株)</td><td></td><td></td></tr><tr>マニュアル <td>レイニン&hellipを使用している</td><td>8または12マルチチャンネルピペット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明な96ウェルフィルムカバー。TempPlate RT光学フィルム&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テーブルトップ遠心分離機;遠心分離機 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

線虫は、生理学的反応の効果をテストするための有用な生物です。全体の生物分子の小さな画面では、寿命などの複雑な表現型を変更することができます生物学的活性の化学構造を特定するための重要な利点を提供しています。ここで説明した各ウェルにc. の elegansのかなり一貫した番号 96 ウェル培養皿の数百を生成するための単純なプロトコルです。次に、我々 は、線虫の寿命に及ぼす化学物質の何千もの画面にこれらの文化を使用する方法を指定します。このプロトコル温度敏感な不稔系統、寒天プレートの条件、および単純な動物のスクリーニングのための同期の動物文化の高スループットの急速な生産を容易にする処理を使用します。

まず 96 ウェル寿命試金のためのこのプロトコルを採用するの代表的な結果を調べることから始めます。最初の例では、メソッドは 30,000 の化学物質を介して正常に画面に使用された化学物質を線虫の寿命を延長し、最高のパフォーマンスを用いた化学物質のフォロー アップ再テスト画面から結果も含まれますを識別する、同じプロトコル。これらの結果は、前述の1だった。2 番目の例は、候補化合物の小規模な画面で同じプロトコルを使用します。
大型スクリーンと再テスト:重複での単回投与で大型スクリーン 30,000 化合物のテストを行った。個々 の化学物質は 20 の予想総動物人口との 2 つの井戸にしたがって行った。これを達成するために (重複) で 10,000 化合物の 3 つの個別のセットは、全体の 30,000 の化合物をカバーする 〜 3 ヶ月の期間にわたって上映されました。これは試金の終わりに手動スコアリングの管理量を確保するため一部で行われていた、各セットの 96 ウェル アッセイ プレートの 260 の合計を必要があります。ライブラリ株式板でだけ 80 井戸含まれる化合物。125 アッセイ プレートを 10,000 化合物の 1 つの複製になります。この調査は、各セットの 10 のネガティブ コントロール プレート 2 複製を使用しました。スループットを向上させる、プレートは ~ 99% の死亡率を経験しているため陰性対照の個体群が評価されたときにとどまった。ライブのワームの井戸を調べたし、すべてのテスト。
ライブ 1 つのワームに井戸中の化学物質は、ヒットと呼ばれました。井戸と呼ばれるヒットし、さらにそれらの井戸ですべてのワーム (生きていると死んでいる) またあった生きている以上 1 ワームが含まれている化学物質は、単純なスコアを生成する数えられた (パーセント生きているスコア; 生きているワーム死んでワームの数で割った数)。ライブラリ内の個々 の化学物質がヒットを 2 回呼び出されますしたがって可能性があります、それらのヒットでしたが、いない、可能性がありますスコアがそれらに関連付けられています。512 の明瞭な化学物質は、30,000 化合物の画面からヒット数 (1 回以上) を呼ばれていた。画面は、強力な堅牢なの (再現) プロ長寿効果を識別することを意図して行われました。これらの 2 つの異なるプロパティが異なる効果をあります。強力な化学物質が劇的に寿命を増加の場合我々 はその薬品のよく生きていることにワームの高いパーセントを期待したいです。堅牢な化学物質の両方のレプリケートは、ライブのワームを持っている期待されます。ヒット リストは、これらの基準に基づくランク付けされました。化学物質の 179 高パーセントの生きているスコアを得られた両方のレプリケートで打撃を受けたや再試験のため選ばれました。ヒットと呼ばれるが、再テスト、選択されていない残りの化学薬品のほとんどは、レプリケートの井戸の 1 つで生きている 1 つのワームを含んでいたのみ。
ヒット曲の再テストは実行、3 複製 (予想される動物の総人口 30) と無処理板に動物の寿命の注意の定量化を除く主なスクリーンのよう。これらの変更は、テストおよび制御の井戸を比較することで支援するために追加されました。化学のヒットの 179 だった再注文、10 mM に希釈、96 ウェル プレートに移動します。24 内部の井戸だけが再テスト試金のため使用された (このプロトコルの現在のバージョンと使用している内部 32 井戸再テスト画面の [プロトコル] セクションで説明したよう)、化合物 6 ネガティブ コントロール アッセイ プレートと 3 通で再テストDMSO 溶媒と扱われます。1 つのネガティブ コントロール プレートは、総生存 (図 1A) のため定期的に得点されました。すべてのプレートに完全にとどまった対照動物の約 95% は死んでいた、(扱われるすべてのライブし、死んでワームが数えられた)。
再テストの結果からヒットを呼び出す、ネガティブ コントロール +2 標準偏差 (SD) の平均パーセント生きているスコアで、カットオフをしました。テスト井戸の平均 % (得点の時) 生きているスコアを 3 つ複製し各ウェルからパーセント生きているスコアを平均することによって算出しました。この特定の試金のため井戸陰性対照の平均パーセント生きているスコアが 48 ウェル (帳票のネガティブ コントロール プレートの 2 セット) の 3 つの複製の平均として計算されます。再テスト化学セットからヒットを呼び出すために使用 SD だった 48 ネガティブ コントロール間で SD 平均パーセント生きているスコア。この戦略を使用すると、57 安打 179 合計再テスト化学薬品の 32% が陽性を示す化合物、(図 1B) の再テスト ライブラリから分った。負の制御とテストの井戸の平均パーセント生きているスコアのビニング テスト井戸が制御井戸 (図 1C) を上回ることを示した。
候補画面:小規模な画面は、上記再テストと同様の方法で実行できます。ここでは、139 化合物候補画面から結果について述べる。これらの候補者は、長寿を促進する可能性が高い構造として組み立てられました。この画面の (50 μ M ・ 100 μ M) の 2 つの異なる投与量で試験板の 5 レプリケートを実行されます。さらに、我々 は; 2 つの異なる用量を含む単一肯定的な制御 (NP1) プレートと 8 ネガティブ コントロール プレートを使用50 μ M、100 μ M。
〜 90% の動物が死んでいたまで負の制御板を監視しました。その時、すべての制御井戸で生きた虫体を含むテスト井戸からライブとデッドのワームを数えることによって井戸にとどまった。得点時に生きて % は、各ウェルの平均パーセント生きているスコアの計算に使用されました。マイナス コントロールの 32 井戸 8 複製からパーセント生きているスコアを持っていた。ポジティブ コントロールの各用量 4 複製し全体の平均 4 もスコアがあった。ヒットされた平均パーセント生きているスコア、平均よりも大きかったが、井戸と呼ばれる陰性対照 % 生きているスコア +2 の SDこのカットオフは、候補画面で左に 14 安打とネガティブ コントロール井戸のすべてを除外します。そのカットオフはまた肯定的な制御のすべてを含まれて 100 μ M でのポジティブ コントロール 50% 扱われる井戸は 50 μ M で扱われます。これらの結果が表示されますここでビン分割 (図 2A) の 50 μ M、100 μ M (図 2B) テスト画面パーセント生きているスコアの平均します。
最後に、すべてのプレートが再獲得の時間に対応した後半時点で動物が死んでいたネガティブ コントロールの 99% 以上扱われたとき。これらの結果は、こと肯定的な制御井戸はるかに優っていた否定的な制御とテスト井戸 (図 2C) 示されます。試掘井がマイナス コントロールよりわずかによかった。この後の結果は、テスト井戸の多くはこの単純な解釈をそれにより交コントロール治療 (表 1)、相対的な毒性を示す登場徴候によってバイアスされています。これ候補ライブラリはc. の elegans、未知の生物学的活性と化学物質の真のスクリーン再テスト画面は本質的に毒性を示さなかった化合物のスクリーニングから予想されることでした。このプライマリ画面の寿命を長く化合物の頃、大幅有毒化学物質必要があります設定されていない再テストで。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig1.jpg"> 図 1: 代表に起因する高スループット画面および再テスト (A) 生存曲線のテスト再試金で使用される代表的なネガティブ コントロール プレートから。この曲線は、アッセイの 18 日間で 4 回この試金で使用される 24 の井戸ですべてライブとデッド ワームの得点から建設されました。成人の日 18 ~ 5% の生存率を持っているコントロールを行ったし、すべてのコントロール テストとプレートも得点だったし。(B) 表画面と再テストの結果をまとめたします。(C) 再テスト画面からコントロールとテストの両方の条件の平均井戸パーセント生きているスコアのビニング。コントロールのスコアは 48 の井戸からそれぞれ成っている 3 複製の平均。テスト結果は 179 井戸からそれぞれ成っている 3 つの複製から平均スコア。図 1は、以前の文書1から再現します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig2.jpg"> 図 2: 代表候補画面から結果 (A) 50 μ M 候補画面から結果のビニング。139 のテストも結果 5 複製から平均パーセント生きているスコアを表します。32 の負の制御結果は 8 複製から平均パーセント生きているスコアから成っています。4 肯定的な制御結果は (16 の合計井戸 50 μ M を含む NP1) 4 の複製から平均パーセント生きているスコアから成っています。(B) 100 μ M 候補画面から結果のビニング。すべてはテスト井戸やポジティブ コントロールは 100 μ M の濃度で治療されたことを除いて (A) と同じです。同じ否定的な制御板は両方 (AとB) のとおりです。(C) 代表に比較的過酷な後半時点でプレート、再記録する起因します。ポジティブ コントロールはちょうどメイン テキストと表 1に記載したテスト井戸に対して偏りのあるがあるこの時点でライブのワームと井戸の % を占める場合劇的に他のすべてをアウトパ フォーム。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="6">平均パーセント生きているスコアのビニング</td>
		</tr>
<tr>
<td>グループ化されたスコア</td>
			<td>すべての死者 (0)</td>
			<td>1-10</td>
			<td>11-20</td>
			<td>21-30</td>
			<td>31-40</td>
			<td>&gt; 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>再テストします。</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(-) # 制御</td>
			<td>16</td>
			<td>31</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># 井 (50 μ m) の</td>
			<td>46</td>
			<td>69</td>
			<td>50</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>候補者の画面</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(-) # 制御</td>
			<td>0</td>
			<td>11</td>
			<td>21</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>(+) # 制御 (50 μ m)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>(+) # 制御 (100 μ m)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td># 井 (50 μ m) の</td>
			<td>94</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># 井 (100 μ m) の</td>
			<td>86</td>
			<td>25</td>
			<td>21</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 異なる画面をビンから代表結果します。 2 つの画面 (再テストおよび候補者) から平均パーセント生きているスコアのビニングを紹介します。[再テスト] 画面で、ピークは右側に劇的に陰性対照を上回る再テストと負のコントロールに似ています、テーブルの (長寿命) 側。これは再テスト セット内に存在する複数のプロ長寿化合物の存在を示します。候補画面では、ピークがすべて死んでいるカテゴリがある間もテーブルの右側から明らかな信号を参照してください。これは候補のセットでプロの長寿化合物の存在を示すが、また化合物の候補セットの間で有意な毒性の存在を示します。

ここで急速に線虫成長メディア寒天、ウェルあたりCaenorhhabditis 線虫の一貫性のある数 96 ウェル培養皿の数百を生成するための単純なプロトコルについて述べる。これらの文化は、全有機体の表現型スクリーニングに適しています。ここでプロの長寿効果のスクリーン化学物質にこれらのカルチャを使用して注力します。

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

この手法の全体的な目標は、ハイスループットアッセイでモデル生物C.elegansに対するさまざまな化合物の影響をテストすることです。この方法は、特定の化学構造がC.elegansの寿命を延ばすかどうかなど、化学、生物学、老化の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、多数の化合物を時間効率よく迅速にスクリーニングできることです。多数の線虫を産生するための大量培養プレートを調製するには、層流キャビネット内で、まず摂氏60度の線虫増殖培地寒天の30ミリリットルを10センチメートルの培養プレートに分注し、一晩固化します。翌朝、2ミリリットルの濃縮大腸菌を各プレートに加え、プレートを傾けて回転させ、細菌をプレート表面全体に完全に広げます。大量培養プレートが乾燥したら、摂氏4度で最大2週間保存してください。スクリーニング用のハイスループットアッセイ培養プレートを調製するには、自動化された8チャンネルディスペンサーを使用して、0.15ミリリットルの溶融線虫増殖培地寒天を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。寒天が一晩固まるのを待ちます。その後、ハイスループットアッセイプレートを摂氏4度で最大2週間保存します。C.elegansの培養物をセットアップするには、ワームピックと解剖顕微鏡を使用して20個の卵を各大量培養プレートに移し、プレートを摂氏20度で6日間インキュベートします。7日目に、解剖顕微鏡を使用して子宮内の卵子の存在を視覚的に確認します。妊娠した成虫を採取するには、ガラスピペットを使用してプレートあたり2〜3ミリリットルのS基礎溶液を追加し、各プレートの周りの溶液を手で渦巻かせます。ガラスピペットを使用して、線虫を15ミリリットルのチューブに移し、遠心分離によって線虫をペレット化します。ワームを10ミリリットルの次亜塩素酸塩溶液に再懸濁し、チューブを5秒間上下に急速に振る。次に、2.5分ごとに振とうしながら、ワームを室温で5分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、ワームを再度遠心分離機にかけます。ペレットは黄褐色である必要があります。上清を10ミリリットルの新鮮な次亜塩素酸塩溶液と交換し、チューブを再度激しく振ってください。ワームをさらに1〜3分間インキュベートし、時々振ってください。卵だけが残ったら、チューブを遠心分離し、上清を吸引します。ペレットは白で、茶色の着色はありません。滅菌技術を使用して、滅菌層流キャビネット内のチューブを開き、各ペレットに14ミリリットルのS基礎溶液を追加します。ペレットを14ミリリットルのSバサールで3回洗浄します。遠心分離による3回の洗浄後、卵を2〜3ミリリットルの新鮮なS基礎溶液に再懸濁します。L1期幼虫C.elegansを調製するには、上清をチューブごとに1つの滅菌ガラスシャーレに移し、2〜3ミリリットルのS基礎溶液を使用して、チューブから残りの卵を各ディッシュにすすぎます。各ディッシュに5ミリリットルのS基礎溶液を追加して混雑を緩和し、ディッシュを摂氏20度、20rpmのオービタルシェーカーに16〜24時間置いて孵化を促進します。すべての孵化したばかりの子ガメは、餌が不足しているため、最初の幼虫の段階で逮捕されます。血清学的ピペットを使用して、L1幼虫を15ミリリットルのチューブに移し、遠心分離します。すべての孵化したL1が遠心分離と吸引を繰り返して固められた後、幼虫ペレットを10ミリリットルの滅菌S基礎溶液で再懸濁します。次に、10マイクロリットルを播種されていないプレートに移し、プレート上に存在する幼虫の数を数えます。これを10回繰り返して、溶液中のL1の平均密度を求めます。滅菌血清ピペットを使用して、L1sを含む溶液の総量を測定します。次に、L1 溶液の体積と溶液中の L1 の密度を使用して、溶液中に存在する L1 の総数を計算します。96ウェルのハイスループットアッセイプレートで線虫をプレートするには、L1懸濁液を無菌の丸い培地ボトルで1マイクロリットルあたり1匹のL1幼虫に希釈し、適度にゆっくりと回転する攪拌子を装備し、アッセイプレートを室温まで温めます。次に、層流キャビネットで、各ウェルに5マイクロリットルの濃縮大腸菌を追加し、続いてウェルごとに10マイクロリットルのL1懸濁液を追加して、ウェルあたり平均10匹のワームを生成します。すべてのワームがメッキされたら、プレートを覆い、ワームを摂氏25度で2日間インキュベートして、幼虫が成虫に成長するのを待ちます。インキュベーションの終了時に、ケミカルライブラリープレートを凍結から室温まで上げます。解凍したプレートをマイクロプレートシェーカーで60rpmで使用直前に1分間静かに振とうします。自動化された96ウェルリキッドハンドラーを使用して、0.75マイクロリットルの化合物をライブラリープレートからアッセイプレートに移します。すべてのウェルを処理したら、層流キャビネット内のプレートの表面から化合物を4〜8時間風乾し、乾燥したらすぐに個々のプレートを取り出します。乾燥させたプレートを透明フィルムで密封し、蓋をします。次に、プレートを1000Gで45秒間回転させ、摂氏25度の逆さの位置で保存します。目的の化合物に対するC.elegansの応答をテストするために、ネガティブコントロールプレートを使用して、コントロール動物の95%が死亡するまでの全生存率をスコアリングできます。その時点で、すべてのテストプレートをスコアリングできます。例えば、この研究では、179種類の化合物の再試験ライブラリから57件のヒットが観察され、再試験化学物質の32%が陽性であったことが示されています。ネガティブコントロールウェルとテストウェルの平均生存率スコアのビニングは、テストウェルがコントロールウェルを上回ったことを示しました。50マイクロモルおよび100マイクロモルの濃度の試験化合物を使用したこの代表的な試験アッセイで実証されたように、小規模なスクリーニングも実施することができる。陰性対照で処理した動物の99%以上が死亡した場合に、これらの小型スクリーンアッセイ試験プレートを再採点すると、陽性対照井戸は陰性対照井戸および試験井戸をはるかに上回り、試験井戸は陰性対照群よりもわずかに優れた性能を発揮したことが示されました。この実験では、後者の結果は、多くの試験井戸が対照処理と比較して毒性を示すように見えるという指摘によって偏り、それによってこの単純な解釈を混乱させました。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば、2〜4週間で完了できます。この手順を実行するときは、アッセイプレートの完全性を維持し、使用する前にアッセイプレートが手付かずの状態であることを確認することが重要です。この手法に従うと、これらの化合物のどれがマイトファジーを誘発するかなど、追加の質問に答えることができますか?マイトファジーアッセイには、マイトファジーレポーター鎖が使用されます。このビデオを見れば、C.elegansをモデル生物として使用してハイスループット化学スクリーニングを行う方法についてよく理解できるはずです。

a-simple-method-for-high-throughput-chemical-screening-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

液体ベースの培養および調剤のための手順...

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

我々は、使用してプロトコルを記述する...

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

出典: アンダーソン、Q.L. 他。 ハイスループット,高含有量,液体ベースの C.エレガンス 病態系 J. Vis. 経験。 (2018年)このビデオでは、 Caenorhabditis elegans...

C.エレガンスノックダウンをスクリーニングするためのマルチウェル液体ベースのアッセイ

定量の走化性応答の評価方法...

C. elegansの走化性アッセイ

生殖細胞毒性を評価するために使用された線虫Caenorhabditis...

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

本発明者らは、集団ベースアッセイにおいて可溶性化合物に対するCaenorhabditis elegansの選好を自動的に分析することができる行動記録設定およびプロトコルを提示する。この記事では、ビヘイビアチェンバーの構築、ビヘイビアアッセイプロトコル、およびビデオ分析ソフトウェアの使用について説明します。...

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

ここでは適応可能、全体のホスト、ホスト病原体の相互作用を研究し、創薬に使用することが出来、高コンテンツ スクリーニング ツール...

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

定量法は識別し、線虫の表現型プロファイリングを自動的に分析することによって化学物質の急性毒性を予測しました。このプロトコルでは、384 ウェル...

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

ここでは、ポリグルタミン凝集、神経細胞死、および化学回避行動を含む Caenorhabditis...

ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

腸内微生物は、特定のまたは保存されたメカニズム を介して 宿主の健康にプラスまたはマイナスの影響を与える可能性があります。 カエノラブディティスエレガンスは 、そのような微生物をスクリーニングするための便利なプラットフォームです。本プロトコルは、線虫の健康状態の代理として使用される、線虫ストレス耐性への影響についての48の細菌分離株のハイスループットスクリーニングを記載している。...

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

学ぶC.elegansを用いたハイスループット化合物スクリーニング法。96ウェルプレートで高密度培養し、長寿効果を評価する迅速なプロトコルです。老化研究や化学バイオロジーへの応用が可能です。

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