代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング

この手順の全体的な目標は、in vivo代謝標識とマクロアレイ解析を組み合わせて、生体サンプル中のすべてのトランスファーRNAの細胞レベルを同時に測定することです。トランスファーRNAは、長い間、調節機能を欠くハウスキーピング分子と考えられていました。しかし、細胞のtRNAレベルは、細胞の種類、環境、ストレスなどのさまざまな条件に応答して変動することを示す証拠が増えています。

tRNA発現の変動は、遺伝子翻訳に直接影響し、特定のタンパク質の発現を促進または抑制します。タンパク質合成のダイナミクスを理解するには、高品質のtRNAプロファイルを提供できる方法が必要です。ここでは、実験室で培養した生物のトランスファーRNAレベルを迅速かつ正確に定量できる、信頼性のあるわかりやすい手法を紹介します。

まず、18ゲージの針で、滅菌済みの1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブのキャップの中央に1つの穴を開けて、適切な曝気を可能にします。次に、一晩のスターター培養から5マイクロリットルのMycobacterium smegmatisを使用して、500マイクロリットルのサプリメント滅菌7H9ブロスを接種します。標準的な放射線防護方法に従って、リン-32標識オルトリン酸のミリリットルあたり20マイクロキュリーを培地にスパイクします。

摂氏37度、1, 200 rpmで、厚さ9ミリメートルのアクリルシールドの後ろに配置されたシェーカーインキュベーターでバクテリアを増殖させます。中間対数期では、培養全体を2ミリリットルのスクリューキャップチューブに移し、10, 000倍の重力で2分間遠心分離することにより、室温で放射性細菌をペレット化します。取り込まれていない放射性オルトリン酸塩を含む上清を適切な廃棄物容器に集めます。

トータルRNAを調製するには、1ミリリットルの市販のRNA抽出試薬と約200マイクロリットルのガラスビーズをペレットに加えます。チューブをしっかりとキャップし、ホモジナイザー内で細菌を2分間最大攪拌します。サンプルを12, 000倍の重力と摂氏4度で10分間遠心分離します。

次に、上清を新しい2ミリリットルのチューブに移し、ビーズを適切に廃棄します。0.2ミリリットルのクロロホルムを加え、チューブを手で15秒間激しく振る。次に、サンプルを12, 000倍の重力と摂氏4度で15分間遠心分離します。

チューブを45度に傾けて、サンプルの水相を新しいチューブに集めます。相間層や有機層の描画は避けてください。2マイクロリットルの着色沈殿剤と0.5ミリリットルの100%イソプロパノールを水相に加えます。

チューブを手で5秒間激しく振って、再度遠心分離します。上清をチューブから取り出し、液体画分には微量の放射能が含まれている可能性があるため、適切に廃棄します。次に、ペレットを5分間風乾した後、200マイクロリットルの2X SSCに再懸濁し、容量SDSあたり0.1%の重量

Genomic tRNA Databaseを使用して、まずtRNA配列またはtRNAコード遺伝子を取得し、DNAプローブを設計します。保存された3プライム末端CCAをトリミングし、コードされている場合は逆補体を生成した後、最初の70ヌクレオチドに基づいてプローブをオーダーします。アレイ印刷を行うには、96ウェルプレートを室温で解凍します。

ダイヤモンドペンで、アミンコーティングされたスライドガラスにラベルを付けます。次に、スライドをインデックスユニットに入れます。グリッドの配置に従って、リプリケーターピンをウェルに慎重に浸します。

最小限の圧力で、スライドガラスにアレイをそっと印刷します。ブロックが終了するまでアレイアーをクリーニングせずに印刷を続行 A.It 一貫して印刷できるようにするには、ある程度の練習が必要です。セッションごとに 8 から 10 個以下の配列を印刷することをお勧めします。

アレイごとに10分から15分をカウントします。印刷パターンの順序を見失いがちなので、タスクに全神経を集中させ、気を散らすものをすべてオフにしてください。次のブロックに進む準備ができたら、レプリケーターを5%漂白剤に浸し、軽く振ってください。

リプリケーターを吸収紙に押し込みます。次に、レプリケーターを蒸留水に浸し、軽く振って紙に押し込みます。この手順を一度繰り返します。

次に、リプリケーターをイソプロパノールに浸し、軽く振って紙に押し込みます。ファンのリプリケータを約20秒間乾かしてから、96ウェルプレートの次のブロックに移ります。希望の印刷数まで続けます。

次に、スライドを乾かします。乾燥させたスライドを上向きにして、254ナノメートルのUV架橋剤のきれいな表面に置きます。エネルギーレベルを999、990マイクロジュール/センチメートルの2乗に設定し、スタートを押します。

アレイを450ミリリットルのブロッキング溶液に移し、マグネチックスターラー上で室温でインキュベートし、一晩ゆっくりと攪拌します。スライドを500ミリリットルの蒸留水で室温で5分間ずつ2回洗浄します。スライドを室温のマイクロアレイ遠心分離機で10秒間遠心分離して乾燥させます。

アレイは乾燥した暗い場所に最大6か月間保管してください。ハイブリダイゼーションの前に、スライドを沸騰水ですすぎ、遠心分離により乾燥させます。アレイをハイブリダイゼーションカセット内に置き、放射性標識RNAサンプルをロードします。

自動ハイブリダイゼーション洗浄ステーションでサンプルを分析すれば、テキストプロトコールに従って最大限の再現性が得られます。ランの最後に、遠心分離によってスライドを乾燥させます。スライドを薄いプラスチックで包みます。

次に、最も感度の高い設定でガイガーカウンターを使用して、スライドの放射性信号を確認します。スライドを露光カセット内の保存蛍光体スクリーンに、信号強度に応じて室温で10〜90時間露光します。数時間から数日続く露光時間は、アレイ信号に直接依存します。

ガイガーカウンターのカウントを露光時間に変換できるようになるには、ある程度の練習が必要です。フォスフォイメージャーを使用して50マイクロメートルの解像度でスライドをスキャンします。マイクロアレイプロファイラーでアップグレードされた無料のImageJソフトウェアを使用して、各プローブスポットの放射能強度を定量化し、バックグラウンドで差し引きます。

テキストプロトコルに従ってヒートマップを生成します。ここに示されているのは、スキャンされた細菌、マウス、およびヒトのマクロアレイです。M.smegmatis アレイは、マウスとヒトに使用される 48 個のプローブではなく、43 個のプローブのみを使用します。

その結果、バクテリアの配列には、背景と混ざり合う40の空のスポットが表示されます。3つの独立した生物学的複製は、試験された増殖条件下で、すべてのM.smegmatis tRNAがバックグラウンドレベルを超えて発現することを示しています。この特定の実験では、各プローブの観察された標準偏差は2%アルギニンTCTと22%システインGCAの間にあり、中央値は5%であり、さらに、この実験はtRNAアイソアクセプターの発現が均一ではないことを示しています。

例えば、すべてのアラニンイソアクセプターは同様のレベルで発現しますが、アルギニンを受け入れるtRNAの最高値と最低値は3倍異なります。このテクニックを習得すると、適切に実行され、スポット信号が適切であれば、約24時間で実行できます。本手法は、プローブ設計にゲノムが利用可能なあらゆる生物に適用できます。

in vitroで増殖したモデル生物は、代謝標識の理想的な候補です。ここで紹介するプロトコールは、Mycobacterium smegmatisに最適化されていますが、大腸菌、酵母、マウス、およびヒト培養細胞のtRNAのプロファイリングにも成功裏に使用されています。私たちの技術は再現性があり、特異的です。

その広いダイナミックレンジと容易に調整可能な閾値により、アレイの曝露時間を延長するだけで、ポリソームに関連するtRNAなどの低存在種をプロファイリングできます。