Name: 代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学ぶ 代謝ラベリングとマクロアレイを組み合わせたtRNAプロファイリング法。Mycobacterium smegmatisなどの培養細胞において、24時間以内に全tRNAレベルを同時定量できる再現性の高い手法です。

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この作品が支持された SC INBRE 付与から国立科学研究所の一般医療 - NIH によって (r. g. に P20GM103499) し、国立がん研究所から P.H.H. に CA555536 ・ CA154664 を付与このプログラム部分で支えられましたチャールストン大学に就学及び学部科学教育プログラムによってハワード ヒューズ医学研究所からの助成金によって、センターからの助成金によって研究資源 (5 P20 RR016461)国立科学研究所の一般医療 (8 P20 GM103499) 国立衛生研究所から。

1 文化および代謝ラベリング
<ol><li>適切な通気を許可するように 18 g 針で滅菌 1.5 mL マイクロ遠心チューブのキャップの中心を突く一度。補われた滅菌 7 h 9 500 μ L 接種液 5 μ L M. smegmatisのスターターからの文化成長一晩12。 注: 7 H 9 の 1 リットルのレシピ スープは: 4.7 g 商業 7 H 9 粉、2 mL、グリセリン 1 mL Tween 80、0.85 g 塩化ナトリウム 5 g、アルブミン 2 g、ブドウ糖 H2O (容量は 1 L にさせる)。<ol>
<li>
(注意)次の標準的な放射線防護の実践 [32P] Na2HPO420 µCi/mL と培養基をスパイクします。9 mm 厚のアクリル盾の後ろに置かれたシェーカー インキュベーターの 37 ° C および 1,200 の rpm の撹拌でバクテリアします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 mL スクリュー キャップ チューブ midlog 段階 (O.D.600 nm 〜 0.5)、転送全体の文化と 10,000 x g に 2 分を収集の上清含む未採用放射性オルトリン酸の遠心分離によって室温で放射性細菌をペレット適切な廃棄容器。</li>
</ol>2. 総 Rna の準備
注: 総 Rna (ため、フェノールおよびクロロホルムを含む)、商業 RNA 抽出試薬を用いた細菌のペレットから抽出する製造元のプロトコルに続きます。
<ol><li>商業の RNA 抽出試薬 1 mL とペレットにガラスビーズの約 200 μ L を追加します。しっかりとチューブをキャップし、最大の動揺の下で 2 分間ホモジナイザーで細菌を混乱させる (選ばれた器械の数 5 を設定 (材料の表を参照))。</li>
	<li>4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心分離機サンプル上清を新しい 2 mL チューブに転送、ビーズを適切に廃棄します。0.2 mL のクロロホルムを追加、4 ° C で 15 分間 12,000 × g で遠心する 15 s. の手でチューブを積極的に振る</li>
	<li>45 ° で管釣りで新しいチューブにサンプルの水相を収集します。界面の有機層を描画しないでください。2 色鉛塩法の μ L と 100% イソプロパノールの 0.5 mL 追加します。4 ° C で 10 分間 12,000 × g で遠心する 5 s. の手でチューブを積極的に振る</li>
	<li>チューブから上澄みを除去し、適切に破棄と液体成分分率は放射能の痕跡を含む場合があります。5 分間乾燥ペレットの空気、クエン酸塩ナトリウム (SSC) 0.1% (w/v) ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) 最終的な X 2 の 200 μ L で再懸濁します。 注: 組成株式 20 X SSC の 3.0 M NaCl、0.3 M クエン酸ナトリウム、pH 7.0 です。</li>
</ol>3. 96 よくプリンター プレートの準備
注: tRNA のマイクロ アレイ手動で 40 2 70 mer DNA オリゴヌクレオチド 8 ピン arrayer を使用して (ターミナル CCA を除く) 各のM. smegmatis tRNA の 3' 末端に相補的な印刷されます。ウェル プレートとアレイのプローブのレイアウトと同様、DNA のオリゴヌクレオチド プローブのシーケンスを提供 (補足ファイル 1 ● シート 1 に 3 それぞれ)。
<ol><li>デザイン DNA は最初取得する tRNA シーケンスや tRNA 遺伝子ゲノムの tRNA など tRNA データベースから、データベース13をプローブします。トリム保存 3' 末端の CCA エンコードされている場合。逆の補数結果のシーケンス。最初 70 ヌクレオチドに基づいて順序プローブ。</li>
	<li>水で乾燥 DNA プローブを再懸濁します。100 μ M のプローブの濃度を調整します。96 ウェル プレート、3 X SSC、0.01% (w/v) SDS ファイナル (希薄 60 μ L 個人の株式のプローブの 6 X SSC、0.01% (w/v) SDS の 60 μ L で 50 μ M oligos の 120 μ L を準備します。</li>
	<li>蒸発や汚染を防ぐため、すぐに凍結し、-20 ° c まで必要な維持するスズ箔と板をカバーしてください。</li>
</ol>4. 配列印刷
<ol><li>常温 (約 20 分所要) 96 ウェル プレートを解凍します。</li>
	<li>ダイヤモンド ペンでアミン コーテッド ガラス スライドにラベルを付けます。インデックス ユニットにスライドを配置します。グリッド配置をに従って、次のようにです。<ol>
<li>井戸のレプリケーター ピンを慎重に浸しなさい。</li>
		<li>優しく (小さな抵抗を感じるが) 最小限の圧力を使用してスライド ガラスに配列を印刷します。ブロック A と完了するまで arrayer を洗浄することがなく印刷を続行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次のブロックに移動する準備ができたら、以下の洗濯手順に従います。<ol>
<li>5% の漂白剤のレプリケーターを浸し、軽く振る。</li>
		<li>吸収性の紙にレプリケーターを押し込みます。</li>
		<li>蒸留水でレプリケーターを浸し、軽く振るし、紙に押します。この手順をもう一度繰り返します。</li>
		<li>イソプロパノールにレプリケーターを浸し、軽く振るし、紙に押します。</li>
		<li>約 20 のためファンのレプリケーターを乾燥 s 96 ウェル プレートの次のブロック移動する前に。必要なプリント枚数を続けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>乾燥し、架橋 254 nm UV 架橋剤を使用してスライドに oligos のスライドを許可します。<ol>
<li>エネルギー レベルを 999,990 μ J/cm2に設定します。</li>
		<li>スライドの顔を架橋剤できれいな表面に設置します。「スタート」を押してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>磁性攪拌器、常温と低速攪拌法の解決を妨げるの 450 mL で一晩配列をブロックします。収集し、最大 4 倍のブロッキング液を再利用します。 注: ブロックのソリューションのためのレシピは: 125 mM リン酸緩衝 (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25 %sds (w/v)、0.5 ミリメートルの EDTA、0.5 X SSC、1 %bsa (w/v)。</li>
	<li>500 mL の蒸留水に室温で 5 分間 2 回スライドを洗います。10 遠心分離によってスライドを乾燥室温マイクロ アレイ遠心分離機で s。最大 6 ヶ月のための乾燥した、暗い場所にストア配列。</li>
</ol>5. アレイ ハイブリダイゼーション
<ol><li>交配する前に、水を沸騰のスライドをすすいで (4.6) のように遠心分離によって乾燥します。</li>
	<li>ハイブリダイゼーション カセット内部配列を置き、標識 RNA サンプルをロードします。</li>
	<li>最大再現性の自動ハイブリダイゼーション洗濯駅を実行します。<ol>
<li>プログラムのステップ次のよう。75 ° C で 2 分間条件ガスケット60 ° C でプローブをご紹介します。 プローブと 90 ° C で 5 分間のサンプルを変化させなさい。60 ° C で 3 時間サンプルを交配させる<ol>
<li>2 × SSC、0.1% (w/v) SDS 流 10 秒 2 回 50 ° C でスライドを洗うし、20 s の 0.1 0.1% SDS X SSC フロー 10 s で 2 回 42 ° C で洗浄スライドと 0.1 で二回 42 ° C で 20 s. 洗浄スライドを保持する保持 X SSC、フロー 10 s とホールド 20 s。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>(4.6) のように遠心分離によってスライドを乾燥します。</li>
</ol>6. 配列の定量化
<ol><li>薄いプラスチック フィルムを使用してスライドをラップします。その最も敏感な設定のガイガー カウンターを使用した放射性の信号用のスライドを確認します。信号の強さに応じて 10 に 90 時間室温で露出カセット ストレージ蛍光体スクリーンにスライドを公開します。 注: ガイガー カウンターの感度は、別の 1 つの楽器によって異なります、露光時間する必要があります最適化する経験的。</li>
	<li>50 μ m 解像度を phosphorimager を使用してスライドをスキャンします。バック グラウンド減算マイクロ アレイのプロファイラーを使用してアップグレード無料画像 J ソフトウェアを使用しての各プローブ スポットで放射能強度を定量化します。</li>
	<li>整理および電子スプレッドシートを使用してデータを処理します。条件付き書式設定ツールを使用してヒート マップを生成します。たとえば各プローブ信号として表現 (‰ 単位) 分数合計プローブ信号の。</li>
</ol>

<ol><li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li>
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<li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%2C+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042(2015).</li>
<li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-%CE%B2-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li>
<li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li>
<li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GtRNAdb%3A+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li>
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</ol>

利害の対立が宣言されていません。

ベータ粒子の放出は、テストの範囲に放射セル フィットネスにも大きな影響を与えるしかし静菌と殺菌剤14、知られています。シンチレーションを示した放射能が全細胞抽出液の 25%、その後、浄化された総 Rna の 1% に組み込まれています。
プローブの同一サイズ、同等の溶解温度と GC コンテンツ、macroarray のスポッティング、統一プロトコル交配および定量化のスポット信号から直接レベルの tRNA の公平な測定できます。
スポットは、再現性と特定です。その広いダイナミック レンジと簡単に調整可能なしきい値により、配列露出度9を延長することにより単にポリソームに関連付けられている Trna などの低豊富な種をプロファイリングします。必要な設備の初期投資後の消耗品を含むサンプル当たりのランニング コスト サンプルあたり 15 ドルの平均値します。
スポットは、あらゆる有機体のゲノムはプローブ設計のために適用されます。試験管内で栽培されているモデル生物は、代謝ラベリングを理想的な候補です。哺乳類のゲノムはしばしば多くの isodecoders (Trna と同じ anticodons を共有するものの、彼らのボディのシーケンスの小さい相違を表示) をエンコード、プローブは閉じる tRNA 種の同種交配を維持するために部分的に退化した必要があります。最後に、付着性の哺乳類セルは通常低い文化を大幅にスケール アップする必要があるので、 M. smegmatisなどペンションで成長した有機体と比較して総 RNA 量を得られます。

セルの種類・環境・ ストレス1,2,3などの条件によると携帯電話の tRNA のレベルが変動します。スポット、tRNA を観察するための合理化されたプラットフォームは、元、信頼性の高い研究所成長生物の転移 RNA レベルの高速高精度の定量化ができる簡単なテクニックです。
Trna は、非常に安定した二次および第三構造4を持っています。また、多数の転写後変更5を表示します。これらの機能は、重要な構造とシーケンス障害バイアスまたは防止 tRNA プロファイル標準ベンチマーク RNA 定量技術6を使用して直接かつ再現性を表します。世界中の研究グループは、細胞の tRNA のレベルを評価するために創造的な多くの場合複雑な技術の開発を余儀なくされました。これらのメソッドのいくつかを含める: 代謝ラベルの付いた Trna (1) 二次元電気泳動分離は北のしみ1整然としたスポット割り当てと組み合わせる(北に 2) 個々 の定量化のしみを使用して慎重に標準化された放射性 DNA プローブ7;(続いて 3) ポスト抽出ラベリング シアニン螢マイクロ アレイ解析3と (4)の in vitro遺伝子組換え demodification 酵素逆のトランスクリプションと組み合わせるとそれ以降を使用して tRNA 変更のストリップ高スループット シーケンス8。
スポットは 2 つのスタンダードでシンプルなアプローチのシンプルで元の組み合わせ: (1) RNA の体ラベリング、合成は、成長する生物、放射性の総 Rna や tRNA (2) macroarrays、体系的かつ小型化されたゲノムのツールで構成されていますtRNA の分離のために最適化されています。
サンプルは、生物から定量化プラットフォームに合理化します。彼らは抽出後直接分析し、さらにポスト抽出増幅または酵素治療を必要とする技術と比較してバイアスが大幅に制限されるに処理されません。スポットは多目的、リボソームの翻訳に物理的に関連付けられている tRNA サブポピュレーションの定量化ポリソーム分別に簡単に組み合わせることができます。
ここで提示されたプロトコルがアラビノースイソメラーゼ、最適化され、大腸菌9、酵母10マウスとヒトの細胞培養11 でプロファイル Trna にも正常に使っていました.

<table><tbody><tr><td>スライドガラスインデックスシステム</td><td>V&Pサイエンティフィック株式会社</td><td>VP 470</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラスアレイ リプリケータ</td><td>V&Pサイエンティフィック株式会社</td><td>VP 478</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルマイクロプレートインデックスシステム</td><td>V&Pサイエンティフィック株式会社</td><td>VP 472</td><td></td></tr><tr><td>ウォッシュ&ブロットステーション</td><td>V&Pサイエンティフィック株式会社</td><td>VP 475</td><td></td></tr><tr><td>リプリケーターピンドライヤー</td><td>V&Pサイエンティフィック株式会社</td><td>VP 474</td><td></td></tr><tr><td>アミンコーティングスライド</td><td>分子デバイス</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイザー/自動ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステーション</td><td>Digilab</td><td>Hyb10022</td><td></td></tr><tr><td>シェーカーインキュベーター</td><td>エッペンドルフ Themomixer</td><td>05-400-200</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ 2 ml チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>21-403-201</td><td></td></tr><tr><td>[32P] Na2HPO4</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>NEX011001MC</tr><tr><td>グアニジニウム チオシアン酸フェノール クロロホルム (トリゾール)</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm ガラスビーズ</td><td>Research Products International Corp.</td><td>9831</td><td></td></tr><tr><td>ミニ ビーズ ミル</td><td>VWR</td><td>25-020</td><td></td></tr><tr><td>貯蔵リン光スクリーン</td><td>富士フイルム</td><td>BAS-IP SR 0813</td><td></td></tr><tr><td>リン光イメージャー</td><td>GE ヘルスケア</td><td>タイフーン FLA7000</td><td></td></tr><tr><td>DNA オリゴヌクレオチド</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UV 架橋剤</td><td>スペクトロライン</td><td>セレクト シリーズ 254 nm</td><td></td></tr><tr><td>マイクロアレイ遠心分離機</td><td>Arrayit Corporation</td><td>MHC110V</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium smegmatis</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て針</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 遠心チューブ</td><td>Fisherbrand</td><td>14-666-317</td><td></td></tr><tr><td>沈殿物 (GlucoBlue)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>7H9 ブロス</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー ケミカル</td>ズ <td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー ケミカルズ</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>20 X SSC</td><td>ロンザ</td><td>51205</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション カセット</td><td>GE ヘルスケア</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Amresco</td><td>M126-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン</td><td>スペクトルケミカルズ</td><td>A3611</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>フィッシャーケミカルズ</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (エチレンジアミン四酢酸)</td> <td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 Mリン酸緩衝液 pH 7.2</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ63974AP</td><td></td></tr></tbody></table>

代謝ラベリングと macroarrays を使用して転移 rna のプロファイリング

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

トランスファー Rna (tRNA) が豊富な短い非コード RNA 種通常 76 に 90 のヌクレオチド長であります。Trna は mRNA のコドンをアミノ酸配列に翻訳することによってタンパク質合成を直接担当です。Trna は長い規制機能に欠けていた家は維持分子として考慮されました。ただし、証拠の成長するボディは、セル型、環境、ストレスなどさまざまな条件に対応携帯電話の tRNA のレベルが変動することを示します。TRNA 表現の揺らぎは、優遇または特定蛋白質の発現を抑制遺伝子翻訳を直接影響します。最終的にタンパク質合成の動的を理解と、高品質の tRNA のプロファイルを提供することができる方法の開発が必要です。ここで紹介する方法は、スポット観測 tRNA の合理化されたプラットフォームの略という名前です。スポットは、放射性の総 Rna のためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出が続く放射性の正燐酸塩と培養細胞の代謝ラベリングで始まる 3 つの手順で構成されています、最後に社内で交配の印刷macroarrays。tRNA のレベルを推定するには、プローブの各スポットで放射能強度の定量化します。ここで提示されたプロトコルアラビノースイソメラーゼmc2155、結核を研究するモデル生物としてよく使用されます非病原性細菌の Trna をプロファイルします。

3 つの独立した生物は、すべてM. smegmatis Trna テスト成長条件下で、バック グラウンド レベル (図 1) の上に表現されているショーをレプリケートします。この実験では、各プローブの観測の標準偏差は 2% (Arg (TCT)) と、5% (図 1) で中央値 22% (Cys (GCA)) との間で構成されています。複製間で虚偽の変更はアレイの準備および交配などの要因によって大きく影響されました。高い再現性はサンプルの交配を自動化し同様、慎重かつ一貫性のある配列印刷によって実現されます。TRNA の 5-fold 違いがあるイル (GAT) と tRNA (ヴァル (TAC)、最高と最低豊富な種それぞれ。スポットは、tRNA isoacceptors の発現は一様でないことを示しています。Isoacceptors は、同じアミノ酸を保持するが、異なるアンチコドン シーケンスを表示およびデコード Mrna のコドンを別の種です。一方、たとえば、すべてアラニン isoacceptors を表現し、似たようなレベルで受け入れる Trna が 3 倍異なる最高と最低のアルギニン。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> 図 1: 代表的な tRNA macroarray 結果。(A)スキャンした細菌、マウスおよび人間 macroarrays。M. smegmatis配列は、マウスおよびヒトの 48 ではなくのみ 43 プローブを使用します。結果として、細菌の配列には、背景とブレンド 40 の空スポット (プローブ アレイごとに 8 回にレプリケートされます) が表示されます。それらのほとんどは左上隅にクラスター化します。M. smegmatisの最適な成長条件下に tRNA のプロフィールの(B)のヒストグラムとヒートマップ表現。プローブ信号 (細菌の増殖、新陳代謝、抽出およびアレイ交配を含む) 3 つの独立実験の平均および合計 Trna の千の値に従って表現されます。3 つのレプリケートの標準偏差はそれぞれ誤差範囲とヒストグラムとヒートマップにオレンジの色合いとして示されます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

スポット (tRNA を観察するための合理化されたプラットフォーム) の名前、元のトランスファー RNA 解析プラットフォームについて述べる。スポットは、生体試料中唯一の 3 つの手順で、24 時間以内にすべての tRNAs の細胞レベルを同時に測定します。

代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

この手順の全体的な目標は、in vivo代謝標識とマクロアレイ解析を組み合わせて、生体サンプル中のすべてのトランスファーRNAの細胞レベルを同時に測定することです。トランスファーRNAは、長い間、調節機能を欠くハウスキーピング分子と考えられていました。しかし、細胞のtRNAレベルは、細胞の種類、環境、ストレスなどのさまざまな条件に応答して変動することを示す証拠が増えています。tRNA発現の変動は、遺伝子翻訳に直接影響し、特定のタンパク質の発現を促進または抑制します。タンパク質合成のダイナミクスを理解するには、高品質のtRNAプロファイルを提供できる方法が必要です。ここでは、実験室で培養した生物のトランスファーRNAレベルを迅速かつ正確に定量できる、信頼性のあるわかりやすい手法を紹介します。まず、18ゲージの針で、滅菌済みの1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブのキャップの中央に1つの穴を開けて、適切な曝気を可能にします。次に、一晩のスターター培養から5マイクロリットルのMycobacterium smegmatisを使用して、500マイクロリットルのサプリメント滅菌7H9ブロスを接種します。標準的な放射線防護方法に従って、リン-32標識オルトリン酸のミリリットルあたり20マイクロキュリーを培地にスパイクします。摂氏37度、1, 200 rpmで、厚さ9ミリメートルのアクリルシールドの後ろに配置されたシェーカーインキュベーターでバクテリアを増殖させます。中間対数期では、培養全体を2ミリリットルのスクリューキャップチューブに移し、10, 000倍の重力で2分間遠心分離することにより、室温で放射性細菌をペレット化します。取り込まれていない放射性オルトリン酸塩を含む上清を適切な廃棄物容器に集めます。トータルRNAを調製するには、1ミリリットルの市販のRNA抽出試薬と約200マイクロリットルのガラスビーズをペレットに加えます。チューブをしっかりとキャップし、ホモジナイザー内で細菌を2分間最大攪拌します。サンプルを12, 000倍の重力と摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、上清を新しい2ミリリットルのチューブに移し、ビーズを適切に廃棄します。0.2ミリリットルのクロロホルムを加え、チューブを手で15秒間激しく振る。次に、サンプルを12, 000倍の重力と摂氏4度で15分間遠心分離します。チューブを45度に傾けて、サンプルの水相を新しいチューブに集めます。相間層や有機層の描画は避けてください。2マイクロリットルの着色沈殿剤と0.5ミリリットルの100%イソプロパノールを水相に加えます。チューブを手で5秒間激しく振って、再度遠心分離します。上清をチューブから取り出し、液体画分には微量の放射能が含まれている可能性があるため、適切に廃棄します。次に、ペレットを5分間風乾した後、200マイクロリットルの2X SSCに再懸濁し、容量SDSあたり0.1%の重量で溶解します。Genomic tRNA Databaseを使用して、まずtRNA配列またはtRNAコード遺伝子を取得し、DNAプローブを設計します。保存された3プライム末端CCAをトリミングし、コードされている場合は逆補体を生成した後、最初の70ヌクレオチドに基づいてプローブをオーダーします。アレイ印刷を行うには、96ウェルプレートを室温で解凍します。ダイヤモンドペンで、アミンコーティングされたスライドガラスにラベルを付けます。次に、スライドをインデックスユニットに入れます。グリッドの配置に従って、リプリケーターピンをウェルに慎重に浸します。最小限の圧力で、スライドガラスにアレイをそっと印刷します。ブロックが終了するまでアレイアーをクリーニングせずに印刷を続行 A.It 一貫して印刷できるようにするには、ある程度の練習が必要です。セッションごとに 8 から 10 個以下の配列を印刷することをお勧めします。アレイごとに10分から15分をカウントします。印刷パターンの順序を見失いがちなので、タスクに全神経を集中させ、気を散らすものをすべてオフにしてください。次のブロックに進む準備ができたら、レプリケーターを5%漂白剤に浸し、軽く振ってください。リプリケーターを吸収紙に押し込みます。次に、レプリケーターを蒸留水に浸し、軽く振って紙に押し込みます。この手順を一度繰り返します。次に、リプリケーターをイソプロパノールに浸し、軽く振って紙に押し込みます。ファンのリプリケータを約20秒間乾かしてから、96ウェルプレートの次のブロックに移ります。希望の印刷数まで続けます。次に、スライドを乾かします。乾燥させたスライドを上向きにして、254ナノメートルのUV架橋剤のきれいな表面に置きます。エネルギーレベルを999、990マイクロジュール/センチメートルの2乗に設定し、スタートを押します。アレイを450ミリリットルのブロッキング溶液に移し、マグネチックスターラー上で室温でインキュベートし、一晩ゆっくりと攪拌します。スライドを500ミリリットルの蒸留水で室温で5分間ずつ2回洗浄します。スライドを室温のマイクロアレイ遠心分離機で10秒間遠心分離して乾燥させます。アレイは乾燥した暗い場所に最大6か月間保管してください。ハイブリダイゼーションの前に、スライドを沸騰水ですすぎ、遠心分離により乾燥させます。アレイをハイブリダイゼーションカセット内に置き、放射性標識RNAサンプルをロードします。自動ハイブリダイゼーション洗浄ステーションでサンプルを分析すれば、テキストプロトコールに従って最大限の再現性が得られます。ランの最後に、遠心分離によってスライドを乾燥させます。スライドを薄いプラスチックで包みます。次に、最も感度の高い設定でガイガーカウンターを使用して、スライドの放射性信号を確認します。スライドを露光カセット内の保存蛍光体スクリーンに、信号強度に応じて室温で10〜90時間露光します。数時間から数日続く露光時間は、アレイ信号に直接依存します。ガイガーカウンターのカウントを露光時間に変換できるようになるには、ある程度の練習が必要です。フォスフォイメージャーを使用して50マイクロメートルの解像度でスライドをスキャンします。マイクロアレイプロファイラーでアップグレードされた無料のImageJソフトウェアを使用して、各プローブスポットの放射能強度を定量化し、バックグラウンドで差し引きます。テキストプロトコルに従ってヒートマップを生成します。ここに示されているのは、スキャンされた細菌、マウス、およびヒトのマクロアレイです。M.smegmatis アレイは、マウスとヒトに使用される 48 個のプローブではなく、43 個のプローブのみを使用します。その結果、バクテリアの配列には、背景と混ざり合う40の空のスポットが表示されます。3つの独立した生物学的複製は、試験された増殖条件下で、すべてのM.smegmatis tRNAがバックグラウンドレベルを超えて発現することを示しています。この特定の実験では、各プローブの観察された標準偏差は2%アルギニンTCTと22%システインGCAの間にあり、中央値は5%であり、さらに、この実験はtRNAアイソアクセプターの発現が均一ではないことを示しています。例えば、すべてのアラニンイソアクセプターは同様のレベルで発現しますが、アルギニンを受け入れるtRNAの最高値と最低値は3倍異なります。このテクニックを習得すると、適切に実行され、スポット信号が適切であれば、約24時間で実行できます。本手法は、プローブ設計にゲノムが利用可能なあらゆる生物に適用できます。in vitroで増殖したモデル生物は、代謝標識の理想的な候補です。ここで紹介するプロトコールは、Mycobacterium smegmatisに最適化されていますが、大腸菌、酵母、マウス、およびヒト培養細胞のtRNAのプロファイリングにも成功裏に使用されています。私たちの技術は再現性があり、特異的です。その広いダイナミックレンジと容易に調整可能な閾値により、アレイの曝露時間を延長するだけで、ポリソームに関連するtRNAなどの低存在種をプロファイリングできます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

我々は、事前にマイクロRNAの設定と分析サーモ科学マトリックスマルチチャンネルピペットで手でだけでなく、ロボットを使用してQPCR用96穴の配列のデモンストレーションを行います。...

定量リアルタイムPCR（定量PCR）アレイを用いたプレマイクロRNAとマイクロRNAのプロファイリング

全細胞RNAは、短期的RNA合成と崩壊の変化と同様に、RNAプロセシングの動態を研究するための貧乏人のテンプレートが用意されています。ここでは、これらの制限を克服することができ、新たに転写されたRNAのチオール特有のビオチン化および精製し、4  -...

細胞培養におけるRNA合成、処理およびディケイの高解像度遺伝子発現プロファイリングのための新規転写されたRNAの代謝標識

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。...

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

レシオメトリック二分子ビーコン（RBMBs）は、生細胞内の画像の単一操作されたRNA転写物に使用することができる。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の蛍光イメージングによる細胞内へのRBMBsの配信、RBMBsの調製および精製を記載している。...

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

私たちは、感染中の病原体遺伝子発現プロファイリングに対して、迅速で感度が高く、再現性のあるプロトコルを開発しました。...

デジタルバーコードプラットフォームを使用して感染する微生物の遺伝子発現プロファイリング

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA...

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

ここで説明されているプロトコルは、4-チオウラシルが付いた酵母から精製した新しく合成された mRNA のゲノムワイドな定量化に基づいています。このメソッドは、mrna から非 mRNA 合成を測定することができ、したがって、RNA のポリメラーゼ II...

酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

酵母サッカロマイセスセレビシエから新たに転写されたRNAを敏感かつ特異的に精製するためにチオレートされたウラシルを使用する。...

4-チウラシル(Ers4tU)を使用したビボにおけるRNAの非常に迅速かつ特異的な代謝標識

このプロトコルの目的は、リボグロウプローブの定量的な蛍光寿命測定を、vitro、生体哺乳類細胞、三次元細胞モデルでの再現可能なRNAイメージングワークフローを可能にすることです。サンプル準備、プローブ投与、データ取得、定量解析のワークフローを概説し、バイアスなし蛍光寿命測定を抽出します。...

生体哺乳類細胞および三次元細胞モデルにおける蛍光寿命イメージングの基礎としてのリボグロウプローブのin vitro 特性解析

学ぶ 代謝ラベリングとマクロアレイを組み合わせたtRNAプロファイリング法。Mycobacterium smegmatisなどの培養細胞において、24時間以内に全tRNAレベルを同時定量できる再現性の高い手法です。

代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング

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