Name: トコンの節間文化の中に内生オーキシンとサイトカイニンの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学ぶトコンの不定芽形成における内因性オーキシンとサイトカイニンの動態解析法。LC-MS/MSを用いて高感度に植物ホルモンを定量し、組織培養における再生メカニズムの理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

その技術支援の応用生物科学部、東洋大学、群馬県農業技術センターの谷口広大の村上彰氏に感謝しております。東洋大学、博士 Uma Maheswari 医教授庄作柏田へ彼らの提案に感謝しております。本研究は、生活と環境科学、東洋大学の研究センター部分で支えられました。

注: 内因性ホルモンの分析を容易にするため、トコン (C. トコン) はこの研究で使用されました。
1 トコンの不定芽を誘発する成長条件
<ol><li>PH 5.710、調整無料の植物ホルモンの B5 培地を準備し、0.2% ジェランガムを追加します。オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい。</li>
	<li>オートクレーブの中の 25 mL を滅菌シャーレ (90 × 20 mm) に注ぐ。</li>
	<li>手術のメスを用いた滅菌アクリル板に刃号 22 トコン苗木の 8 mm 節セグメントを切り取り、媒体 (図 1)。</li>
	<li>15 µmol m− 2の− 1 5 週間 14 h/10 h の光暗いサイクルの光の下の 24 の ° C で植物ホルモン無料 B5 培地で培養。</li>
	<li>地域を識別する私 (根尖部) から IV (基底) の各セグメント (図 1B)。週に一度顕微鏡下で地域ごとに不定芽 > 0.3 mm 長さの数をカウントします。</li>
</ol>2. 抽出と植物ホルモンの精製
<ol><li>それぞれ 4 つの 2 mL のサンプル チューブの 5 mm ジルコニア ビーズを入れてください。</li>
	<li>セグメントを切る地域 IV (各 2 mm 長さ) 滅菌アクリル板に手術のメスを使用します。</li>
	<li>別のサンプル チューブ (10-30 mg の新鮮な重量) の各地域の 8 つのセグメントを収集します。</li>
	<li>量る、そして液体窒素でサンプルを凍結します。</li>
	<li>ビーズ ベースのホモジナイザーを用いた凍結試料を粉砕します。</li>
	<li>オーキシンの各内部標準の 500 pg 及び CKs (d5独立行政法人、d5tZ、d5最も息、6d iP、d6知的財産権) を含む 1 mL のアセトニ トリルに押しつぶされたサンプルを中断渦のミキサーを使用しています。</li>
	<li>室温で 5 分間 3,500 × gで遠心分離後 1 h、4 ° C で保持します。</li>
	<li>1% (v/v) 酢酸を含む 80% (v/v) アセトニ トリルでペレットを洗浄します。3,500 × gで再度遠心して、室温で 5 分間。(手順 2.7 および 2.8) から使い捨てのガラス管の培養上清を組み合わせます。</li>
	<li>追加 600 μ L 各複合培養上清に含まれる 1% (v/v) 酢酸を水し、真空濃縮を用いたアセトニ トリルを蒸発させます。</li>
	<li>アセトニ トリル、メタノール、および 1% (v/v) 酢酸を含む水の各 1 mL を適用することによって、親水性・親油性-バランス (HLB) 列カートリッジを平衡します。</li>
	<li>平衡の HLB カートリッジあたり 1 つのサンプル ソリューションを適用します。</li>
	<li>1% (v/v) 酢酸を含む水を 1 mL でカートリッジを洗浄します。</li>
	<li>ガラス管に 1% (v/v) 酢酸を含む 2 mL 80% (v/v) アセトニ トリルのすべてのホルモンを溶出します。</li>
	<li>取得真空濃縮を使用して 1% (v/v) 酢酸を含む水で抽出する溶出液にアセトニ トリルを蒸発させます。 注: は、これを完全に乾燥しないでください。</li>
	<li>混合モードでは、強い陽イオン交換 (MCX) 列カートリッジを 0.5 mL、1 mL のメタノール 1 mL のアセトニ トリルを適用することによって平衡 0.1 M HCl と 1% (v/v) 酢酸を含む水を 1 mL。</li>
	<li>平衡の MCX カートリッジあたり 1 つのサンプル ソリューションを適用します。</li>
	<li>1% (v/v) 酢酸を含む水を 1 mL でカートリッジを洗浄します。</li>
	<li>IAA をガラス管に 1% (v/v) 酢酸を含む 2 mL 30% (v/v) アセトニ トリルで溶出します。</li>
	<li>1% (v/v) 酢酸を含む 2 mL 80% (v/v) アセトニ トリルでカートリッジを洗浄します。</li>
	<li>2 mL の水と 5% アンモニア水を含む水を 1 mL のカートリッジを洗ってください。</li>
	<li>ガラス管にアンモニア水 5% を含む 2 mL 60% (v/v) アセトニ トリル、CKs を溶出します。</li>
	<li>真空濃縮を使用して各ホルモンの分画の溶剤を蒸発し、クロマトグラフィー-タンデム質量分析まで +30 ° C で保存します。</li>
</ol>3 独立行政法人及び CKs の LC ・ MS/MS 分析
<ol><li>メタノールの 600 μ L で管内各ホルモン エキスを溶解し、ソリューションをねじ首総復旧時バイアルに転送します。真空濃縮を使用して溶媒を蒸発させます。</li>
	<li>20 μ L 30% (v/v) アセトニ トリル中で IAA 分数と CK 分数スクリューバイアル首総復旧時の 1% (v/v) 酢酸を含む 20 μ L の水に溶解します。</li>
	<li>高速液体クロマトグラフィー システムを搭載したトリプル四重極 MS システムで肯定的なイオン モードでサンプルを分析します。 注: 我々 は、表 1に記載されている HPLC 条件を設定します。<ol>
<li>IAA 溶出の 5%-50% 溶剤 B 7 分以上のバイナリのグラデーションを使用し、98% 溶剤 B 増し、1 分間保持巣注入による 5% 溶剤 B で 2 分間、平衡します。</li>
		<li>CK 溶出 2-40% 溶剤 B 5 分以上 7 分で 40-70% 溶剤 B のバイナリのグラデーションを使用し、95% 溶剤 B 増し、1 分間保持によって 2% 溶剤 B で 2 分間、平衡注入を入れ子にします。</li>
		<li>エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) を設定-MSの表 2に掲げるイオン源のパラメーター。</li>
	</ol>
</li>
	<li>複数の反応 (MRM) 遷移表3 各試料の定量化のための監視を使用します。</li>
	<li>重水素標識基準にラベルの比の標準曲線に対して内因性 IAA と CK のレベルを定量化します。</li>
</ol>

<ol><li>Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).</li>
<li>Skoog, F., Miller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regulation+of+growth+and+organ+formation+in+plant+tissues+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Symp+Soc+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro.</a> Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).</li>
<li>Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. <a target="_blank" href="NULL">Transgenic plants and crops</a>. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).</li>
<li>Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+emetic+alkaloid+by+in+vitro+culture+of+Cephaelis+ipecacuanha%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).</li>
<li>Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Cultivation-Utilization-Medicinal-Plants-Kapur/dp/B001I6AQI6">Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research</a>. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).</li>
<li>Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/0167-7799(94)90092-2">Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).</li>
<li>Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24241769">Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).</li>
<li>Yoshimatsu, K., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+shoot+formation+on+internodal+segments+and+alkaloid+formation+in+the+regenerates+of+Cephaelis+ipecacuanha+A.+Richard%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard.</a> Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).</li>
<li>Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9684-8">Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac.</a> J. Plant Growth Regul. , (2017).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).</li>
<li>Watad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304423896008746">Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures.</a> Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).</li>
<li>Ajithkumar, D., Seeni, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050418">Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree.</a> Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).</li>
<li>Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1010652006417">Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).</li>
<li>Rao, M. S., Purohit, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10535-006-0079-0">In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd.</a> Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).</li>
<li>Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9050-6">TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+negatively+regulates+cell+death+by+controlling+NPR1-dependent+salicylic+acid+signaling+during+senescence+and+the+innate+immune+response+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).</li>
<li>Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+hormones%3A+cytokinin+and+auxin+interactions+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development.</a> Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).</li>
</ol>

著者は、利害の対立があるないことを宣言します。

植物ホルモンの分布を識別するために器官形成に関与することが重要です植物ホルモンを誘導するための植に外に適用されるため、器官形成植物ホルモン フリー培地で観察できる植物材料を使用枝や根、細胞分化と器官形成における植物の固有の可塑性を評価するが難しく、全体外植体に影響します。カーネーション・ l ・11、エグレ marmelos (l.) Corrêa12、オトメアゼナ(l.) 事業13、など他の植物種の植物ホルモン自由な文化媒体の不定芽を誘起することツルウメモドキ paniculatusアマランサス。14、およびKalanchoë 対新。15. これらの植物種のプロトコルに適用することが可能でしょう。
独立行政法人、tZ、最も息、iP、およびアセトニ トリル中...

ゴットリーブ Haberlandt (1854-1945 年) は、「全能性」、ことができます細胞植物によって分割、区別し大株1で特定の細胞型に分化させ事前後も全植物体を再生の概念を提案しました。組織培養、植物体再生を誘起することまたはないかどうか、組み合わせと成長培地におけるジベレリンの植物ホルモンの濃度によって決まります。培とミラーは、不定根が低比2を含む培地に誘導することが一方 CKs とオーキシンの高い比率を含む培養液中でタバコ由来カルスから不定芽を誘導することが発見しました。その発見以来組織培養行われている遺伝子組換え植物3の再生、経済的に重要な作物の伝播のため。不定芽は、茎頂、葉、根、茎など以外の組織から誘導することができます。植物ホルモン処理は、ほとんどの植物種の不定芽の誘導に必要です。ただし、最適濃度との組み合わせは異なる種と組織外植片として使用中です。したがって、多くの努力は、最適な濃度と植物ホルモンの実験のための組み合わせを決定するのに入ります。
トコン(Brot。)L. アンダーソン (トコン) は、エメチンと根4を中心に、セファエリンなどのアルカロイドが含まれている薬用植物です。ルート エキス、amoebicide5嘔吐、去痰薬として使用されます。トコンは、ブラジルの熱帯雨林に自生、文化では、種子を設定するには消極的だし、寒い気候6を使って、日本の種子貯蔵中に発芽率が低下します。代わりに、組織培養からの伝播が、撮影する不定節の形成は最も効率的な方法7,8。興味深いことに、植物ホルモン治療8なしこの種の不定芽を誘起することができます。
不定芽は、基底部9ではなく親、なし節セグメントの根尖部に表皮に形成されます。この違いは、おそらく ∼ 規制下にある節セグメントで組織の極性を示します。トコン文化システムにより、不定芽形成の間に内生植物ホルモン レベルの変化を分析するユニークな機会です。ここで 1 つオーキシン (インドール-3-酢酸酢酸 (IAA)) と 4 つの CKs の内因性レベルの解析の手法を紹介 (イソペンテニル アデニン (iP)、イソペンテニル アデニン ゼアチンリボシド (iPR)、トランス-ゼアチン (tZ) とトランス-ゼアチンリボシド (最も息))LC ・ MS/MS を使用して節間のセグメント。

<table><tbody><tr><td>[2H5]インドール-3-酢酸</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>031 1531</td><td>LC-MS/MSの内部標準</td></tr>[<tr><td>2H5]トランス-ゼアチン</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0301</td><td>LC-MS/MSの内部標準</td></tr><tr><td>[2H5]トランス-ゼアチンリボシド</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0311</td><td>LC-MS/MSの内部標準</td></tr>[<tr><td>2H6]N6-イソペンテニルアデニン</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0161</td> の内部<td>標準LC-MS/MS</td></tr><tr><td>[2H6]N6-イソペンテニル アデノシン</td><td>オルケムLM Ltd</td><td>030 0171</td><td>LC-MS/MS</td></tr><tr><td>インドール-3-酢酸</td>の内部標準 <td>和光</td><td>098 00181</td><td>LC-MS/MS</td></tr><tr><td>のトランスゼアチン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z0876 5MG</td>の<td>LC-MS/MS</td></tr><tr><td>標準 リボシド</td><td>和光</td><td>262 01081</td><td>LC-MS/MSの標準</td></tr><tr><td>N6-イソペンテニルアデニン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D7674</td><td>1G 標準液 LC-MS/MS</td></tr><tr><td>N6-イソペンテニル アデノシン</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>22648 1000</td><td>標準液 LC-MS/MS</td></tr><tr><td>用 アセトニトリル ハイパーグレード LC-MS 用 LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.00029.1000</td><td>溶媒 LC-MS/MS 用</td></tr><tr><td>水 LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.15333.1000</td><td>液滴 LC-MS/MS</td></tr><tr><td>HPLC</td> <td>用島津</td>製作所 <td>プロミネンス</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Sciex</td><td>3200QTRAP</td><td></td></tr><tr><td>オアシス HLB 30 mg/1 cc</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT094225</td><td>カートリッジカラム</td></tr><tr><td>オアシス MCX 30 mg/1 cc</td><td>ウォーターズ</td><td>186000252</td><td>カートリッジカラム</td></tr><tr><td>スクリューネック トータルリカバリーバイアル</td><td>ウォーターズ</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>ブルー、12 x 32mm スクリューネックキャップ、PTFE/シリコンセプタム</td><td>ウォーターズ</td><td></td><td></td>186000274</tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18、2.1x100 mm</td><td>Waters</td><td>186002350</td><td>UPLC カラム</td></tr><tr><td>Proshell 120、EC-C18、2.1x50 mm</td><td>Agilent</td><td>699775-902</td><td>UPLC カラム</td></tr><tr><td>デジタル顕微鏡</td><td>Leica</td><td>DHS1000</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>サージカルブレード</td><td>フェザー</td><td>No. 22</td><td></td></tr><tr><td>メスの柄</td><td>フェザー</td><td>No.4</td><td></td></tr><tr><td>サバント SpeedVac/冷蔵ベイパートラップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SPD111/RVT4104</td><td>真空濃縮器</td></tr><tr><td>使い捨てガラストーブ (13x100 mm)</td><td>岩城</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ペトリ皿</td><td>INA OPTICA</td><td>I-90-20</td><td></td></tr></tbody></table>

トコンの節間文化の中に内生オーキシンとサイトカイニンの定量化

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

不定芽形成は経済的に重要な作物の普及のため、遺伝子組換え植物の再生に重要な手法です。植物ホルモン処理は、ほとんどの種の不定芽の誘導に必要です。オーキシンとサイトカイニン (CK) 間のバランスによって決定されます不定芽を誘発することができるかどうかのレベル。多くの努力は、最適な濃度と外植片として使用される各組織、各植物は植物ホルモンの組み合わせを決定するのに入ります。ただし、トコンは培植物ホルモン治療なしで節間のセグメントに不定芽を誘導することができます。これは評価する細胞分化のトコンの固有の可塑性をことができます。トコンの不定芽を誘導して、5 週間 0.2% ジェランガムで凝固した植物ホルモン無料 B5 培地で 14 h/10 h の光暗いサイクルで 15 µmol m− 2の− 1光の下の 24 の ° C で節間のセグメントを培養しました。不定芽形成過程における植物ホルモンの動態を調査するには、計測における内生インドール-3 - 酢酸及び CKs セグメント液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法クロマトグラフィー-タンデム質量による。このメソッドは、単純な方法で解析における内生インドール-3 - 酢酸の CKs レベルをできます。それは、他の植物の器官の中に内生オーキシンと CK のダイナミクスを調べるに適用できます。

1st週不定芽が形成ないです。2nd週間で小さな芽が登場しました。3rdと 4th週間、数シュート頂端領域 (I および II) を中心に増加 (図 2A)。5 週目で番号シュートの地域であった約 7 で私と 5 地域 II (図 2B)。対照的に、いくつかの撮影だけは III と IV の地域で形作られました。
文化の前に IAA レベルだった地域でわずかに高い私 (4.1 pg ユニット/mg, 生体重 (FW)) より地域 II 〜 IV (〜 2.5 pg/mg FW;図 3)。1s...

不定芽は、植物ホルモン治療せずトコンの節間のセグメントに誘導できます。不定芽形成過程における植物ホルモンの動態を評価するには、MS LC/MS による節セグメントにおける内生オーキシンとサイトカイニンを測定しました。

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

この手順の全体的な目標は、ipecacの外来性シュート形成中に内因性植物ホルモンレベルがどのように変化するかを説明することです。この方法は、植物組織培養ホイールにおける組織再生に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、インドール-3-酢酸の内因性レベルとサイトカイニンを高感度で簡単に分析できることです。この技術の意味は、内因性植物ホルモンレベルの変化が不定芽形成を引き起こすため、植物組織の変性の確立全体に広がっています。まず、植物ホルモンを含まないB5培地を準備し、0.2パーセントのジェランガムを追加します。次に、培地をオートクレーブして滅菌します。滅菌アクリル板上の外科用メスを使用して、ipecacの苗木の8ミリメートルの節間セグメントをスライスし、培地に置きます。次に、ipecacセグメントを摂氏24度で1平方メートル秒の光で15マイクロモル/平方メートル秒未満で培養し、14時間の光と10時間の暗サイクルで5週間培養します。ipecacセグメントを培養した後、各セグメントの領域1〜4を特定します。週に一度、顕微鏡を使用して、各領域の不定芽の数を数えます。まず、5mmのジルコニアビーズを4本の2mlサンプルチューブに入れます。次に、滅菌アクリル板に外科用メスを使用して、ipecacセグメントを領域IからIVに切断します。各サンプルを秤量し、液体窒素で凍結します。次に、ビーズベースのホモジナイザーを使用して、凍結したサンプルを粉砕します。ボルテックスミキサーを使用して、サンプルを1ミリリットルのアセトニトリルに懸濁し、牛とCKの各内部標準液を500ピコグラムで懸濁します。サンプルを摂氏4度で1時間持ち帰ります。次に、サンプルを3500 Gで室温で5分間遠心分離します。ペレットを80%のアセタールニトリルで1%の酢酸で洗います。次に、遠心分離を繰り返し、使い捨てのクラスチューブを使用して上清を結合します。結合した上清に1パーセントの酢酸を含む600マイクロリットルの水を加えます。次に、真空濃縮器を使用してアセタールニトリルを蒸発させます。サンプル溶液を個々の平衡化HLBカートリッジにロードします。そして、カートリッジを1パーセント酢酸を含む1ミリリットルの水で洗います。次に、ガラス管に2ミリリットルの80%アセチルニトリルと1%の酢酸を入れて、すべてのホルモンをほのめかします。真空濃縮器を使用して、アセタールニトリルを蒸発させ、1%酢酸を含む水中の抽出物を得る。サンプル溶液を個々の平衡化MCXカートリッジにロードし、カートリッジを1ミリリットルの水と1%酢酸で洗浄します。次に、ガラス管にIAAを溶かし、2ミリリットルの30%アセタールニトリルと1%の酢酸を入れます。次に、カートリッジを2ミリリットルの80%アセタールニトリルと1%の酢酸で洗浄します。次に、ドラフトチャンバーでカートリッジを2ミリリットルの水と1ミリリットルの水で5パーセントのアンモニア水で洗浄します。ドラフトチャンバー内の60%アセタールニトリルと5%のアンモニア水性を2ミリリットル含むガラス管のCKをほのめかします。次に、真空濃縮器を使用して、各ホルモン画分の溶媒を蒸発させます。LCMSMS分析まで、サンプルを摂氏マイナス30度で攪拌します。まず、各ホルモン抽出物を600マイクロリットルのメタノールを含むチューブに溶解します。次に、溶液をスクリューネック全回収バイアルに移し、真空濃縮器を使用して溶媒を蒸発させます。IAA画分を20マイクロリットルの30%アセタールニトリルに溶解し、CK画分を20マイクロリットルの水に1%酢酸で溶解します。次に、HPLCシステムを搭載したトリプル四重極MSシステムを使用して、陽イオンモードでサンプルを分析します。最後に、非標識標識標準物質と重水素標識標準物質の比率の標準曲線に対して、CKレベルの内因性IAAを定量します。このプロトコルでは、外来性シュートの内因性酸化性サイトカイニンをLCMSMSを介して5週間測定しました。最初の週には、不定シュートは形成されておらず、最初の小さなシュートは2週目に現れました。第3週と第4週の間に、シュートの数は主にリージェント1と2で増加しました。5週目のシュートの数は、リージョン1で約7本、リージョン2で5本でした。培養前は、IAAレベルはリージョン1の方がリージョン2、3、および4よりもわずかに高かった。最初の週に、IAAレベルはリージョン4で大幅に増加し、リージョン1、2、および3でわずかに減少しました。培養の5週間までに、IAA濃度勾配が現れました。レベルはリージョン1からリージョン4に増加します。培養前は、ほとんどのCKの微量レベルしかありませんでした。最初の週に、tZRレベルは領域2で1ミリグラムあたり13.8ピコグラムに増加しました。そして、領域3では1ミリグラムあたり18.1ピコグラム。対照的に、tZ、iP、iPRのレベルは培養中にわずかに変化しただけでした。この手順を試みる際には、内因性部分のホルモンが安定していることを覚えておくことが重要です。それが人間に開発された後、この技術は植物組織培養の分野の研究者のための道を開きます。他の生物における不定形成を探求すること。このビデオを見れば、内因性インドール-3-酢酸とサイトカイニンの分析方法について十分に理解できるはずです。

quantification-endogenous-auxin-cytokinin-during-internode-culture

Research

JoVE Journal

Environment

環境

このビデオは、シロイヌナズナ植物の実生成長阻害アッセイを示しています。免疫ペプチドエリシターの濃度の増加が苗の成長に与える影響が決定されます。...

免疫誘発性実生成長阻害の測定

側根誘導系で<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;とトウモロコシ

ここで概説されているプロトコルは、2-クロロエチルホスホン酸(CEPA)を利用することにより、細菌のエチレン応答の便利な調査を容易にします。...

細菌でエチレン応答を研究するためのツールとして、エチレン放出化合物、2-クロロエチルホスホン酸を利用します

記載された水耕共培養システムは、金属メッシュスクリーンを有する完全な植物を支持し、それらを細菌と共培養する。植物組織、細菌、および分泌された分子は、下流の分析のために別々に採取することができ、同時に植物宿主および相互作用する微生物または微生物の両方の分子応答を調べることができる。...

植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム

記載プロトコルは、じゃがいも (ジャガイモ)...

孤立した塊茎プロトプ ラストのフローサイトメトリーによる表現を測定

特定および効率的なタンパク質枯渇を達成するための分解性の調整

化合物ライブラリーの大規模スクリーニングにより、葉面蒸散起のモジュレーターを同定する方法を提供する。...

ヘリアンサス・アンヌウスにおける大規模な熱画像スクリーニングによる植物蒸散の新規レギュレーターの同定

ここでは、植物中のイノシトールポリリン酸塩を検出し定量する高感度の方法である[3H]-ミオ-イノシトール標識苗の強力なアニオン交換高速液体クロマトグラフィーについて述べた。...

SAX-HPLCを用いた異種植物由来の可溶性、放射性標識イノシトールポリリン酸塩の抽出と定量化

この論文では、気孔の発達を制御する遺伝子を特徴付けるために、表皮剥離を使用しない2つの表現型法について説明します。最初の方法は、トルイジンブルーO染色植物表皮を使用して気孔表現型を分析する方法を示しています。2番目の方法は、気孔リガンドを同定し、それらの生物学的活性を監視する方法を説明する。...

表皮表現型スコアリング による 気孔発生に関与する遺伝子の同定

ここでは、 シロイヌナズ ナの苗木の脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成モニタリング用に設計された高度なツールについて説明します。この新しい方法論は、高い空間分解能と時間分解能で非侵襲的なリアルタイムクロロフィル蛍光イメージングを提供します。...

シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

学ぶトコンの不定芽形成における内因性オーキシンとサイトカイニンの動態解析法。LC-MS/MSを用いて高感度に植物ホルモンを定量し、組織培養における再生メカニズムの理解に貢献します。

トコンの節間文化の中に内生オーキシンとサイトカイニンの定量化

さらに動画を探す